Yöntem makalesi

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi Utero olarak Elektroporasyon

DOI:

10.3791/50412

⸱

24 Temmuz 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg , 2Institut de recherches cliniques de Montreal

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine rağmen, Utero genetik manipülasyon nadiren çalışılmıştır. Biz için ayrıntılı bir prosedür göstermek Utero elektroporasyon.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişmekte olan memeli beynin belirli bölgelerde genetik modifikasyonu çok güçlü bir deneysel bir yaklaşımdır. Ancak, yeni fare mutantlar üreten genellikle sinir bozucu yavaş. Makul post-operatif sağkalım rahimde gelişmekte olan fare beyin erişimi mümkün olduğu gösterilmiştir. Yine de, bu prosedüre sonuçlar gelişmekte olan beynin en yüzeysel ve kolay erişilebilir kısmı için neredeyse sadece bildirilmiştir, korteks yani. Talamus, daha dar ve daha orta bölgesinden bir hedef, daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle derin çekirdek, hipotalamus bu içine Transfeksiyon, en zorlu ve bu nedenle çok az sonuç bildirilmiştir belki de. Burada tüm hipotalamik epitele veya elektroporasyon ile transfeksiyon için bunun bir parçası (hipotalamik bölgeler) hedef için bir prosedürü göstermektedir. Bizim yaklaşım anahtarları t uzun narkoz kez, enjeksiyon olarakHird ventrikül ve uygun tür ve elektrot konumlandırma. Ayrıca, hedef ve en girintili hipotalamik çekirdek, göğüs vücudun sonraki histolojik analiz sonuçları göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik fare beyin genetik manipülasyon gelişimsel düzenleme hakkında bilgi almak için tercih edilen bir yaklaşımdır. Mutant fare hatları üretimi ne kadar yavaş ve pahalıdır. Memeli beyin nöronların geliştirilmesinde belirli genetik değişiklikler tanıtmak için bir güçlü bir yöntem utero elektroporasyon olduğunu. Esasen, teknik daha sonra embriyo, belirli bir zaman süresi boyunca hayatta beyin toplamak ve olası yeni, bilgilendirici, fenotip için bunları incelemeye izin veren elektrik darbeleri vasıtasıyla embriyonik beyin epitele DNA transfekte oluşur. Bu şekilde, fare deneyi mutantlarının üretimi için gerekli olan uzun bekleme süreleri olmaksızın hemen hipotezleri test edebilir.

Gelişmekte olan embriyo içine DNA Transfeksiyon civciv embriyoları 1 ovo elektroporasyon ile başladı. Fare için proof-of-concept temel kültüründe yapıldı kadar. Bu yakında utero 3,4 fare üzerindeki tekniğin ilk açıklamaları izledi.

Asıl sorun onları ya da anne öldürmeden rahimde gelişmekte olan embriyo beyin transfect etmektir. (Laparotomi, enjeksiyon, elektroporasyon) gerekli ameliyat öğrenmek uzun bir eğitim süresi gerektirir. Ameliyat embriyo hayatta kalma oranı kabul edilebilir noktaya hakim sonra, bir sonraki önemli bir soru: beyin yapıları erişilebilir olan? Beklendiği gibi, utero elektroporasyon ile elde edilen sonuçlar gösteren ilk yayınlanan bildiri kortikal gelişim 5-9 odaklanmıştır. Cerrahi işlemler için en kolay gelişmekte olan fare beyin bölgesi korteks (Şekil 1), bu durum, bu yöntem kullanılarak yayın çoğu için de geçerlidir. Korteks içine utero elektroporasyon prosedürü tarif edilmiştirbaskı 10 ve video 11-14. Tekniğin bir değişiklik telencephalon bir karın kısmı, bazal ganglion 15 hedeflemek için kullanılabilir.

Telencephalon ötesinde, diensefalon (klasik talamus ve hipotalamus ayrılmıştır) ulaşmak için daha zor ön beyin bir bölgedir. Onun dorsal ve en kolay kısmı, talamus 16-19 hedef kağıtları raporların az sayıda.

Hipotalamus, ön beyin en karın kısmı bu nedenle bir dorsal yüzeyi (korteks), (Şekil 1) 'den en derin lokalize. Bu bölge genetik rahimde fare beyin işlemek için taahhüt araştırmacılar için zor bir sorun olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, sadece çok az sayıda makale fare hipotalamus 20,21 içine utero transfeksiyon içinde sonuçları rapor. Ancak, hipotalamus bulaşmıyor işlevsel önemibu, çiftleşme, üreme ve ebeveynlik 22 yeme ve içme gibi davranışları düzenleyen beri t, abartılmış. Ayrıca, hipotalamik gelişiminde değişiklikler daha sonra obezite, hipertansiyon, diyabet ve erken ergenlik 23 gibi yaşam koşulları kaynaklı katkıda bulunur. Gelişimi sırasında genetik hipotalamus değiştirmek için güçlü olmak bunu anlamak için çok güçlü bir araç sağlayacaktır.

Burada kullandığımız gebe farelerin laparotomi için temel cerrahi protokolü diğer protokoller 11,13,14,24 kullanılan benzemektedir. Biz bütünlüğü için kısaca bunları anlatacağız. Bizim prosedüre anahtar, diğer taraftan, anestezi tipi, enjeksiyon yeri, elektrotların türü ve ekleme ve embriyonun kafası ile ilgili olarak pozitif elektrot pozisyonu vardır. Eski sağlar beri, basit intraperitoneal anestezi üzerinden gaz solunması anestezi teşvik ve korumak için tercihnarkozu biraz daha uzun süre zor bir ameliyat için gerekli. Anestezi daha hızlı kurtarma izofluran inhalasyon sonuçları, genellikle anne zaten ameliyattan sonra dakika normal bir davranışı gösterir beri. Cam mikropipet ile DNA çözüm enjeksiyon en kolay nokta ancak hipotalamus elektroporasyon için tamamen uygun değildir lateral ventrikül vardır. Doğrudan üçüncü ventrikül enjeksiyon gerçekten derin diensefalik yapıları hedef için çok önemlidir. Bu standart, off-the-raf elektrotlar ile E12.0 veya E12.5 gelen hipotalamus transfect mümkündür. Biz özellikle bu amaç için uygun Nepa, Gene (Chiba, Japonya) tarafından üretilen bazı elektrodların bulduk.

Bizim işlem ile, tüm hipotalamik neuroepithelium veya elektrot yönüne bağlı olarak kısmi, bölgesel aktarılmasının transfeksiyon edinin. Burada muhtemelen, göğüs vücut transfecting tarafından tekniği göstermekderin ve bütün hipotalamik çekirdek en gömme. Buna ek olarak, çözünürlük, hücresel seviyede için transfekte edilmiş hücrelerin ayrıntılı histolojik analizi aşağı göstermektedir.

Utero fare gelişen beyin transfecting diğer yaklaşımlarla utero elektroporasyon karşılaştırılması Tartışma bölümünde bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Enjeksiyon için DNA ve Cam mikropipetler hazırlanması

  1. İyi kaliteli cam mikropipetler amniyotik sıvı kaybı nedeniyle ilk yüksek kürtaj oranını azaltmak için gereklidir. Cam mikropipetler çekmek için prosedür de 13,18,25 belgelenmiştir. Isı = 300,, 1.2 mm çapında kılcal kullanın ayarları p = 500 ile geleneksel bir Sutter P-97 cihazı çekti = 40 çekin; Hız = 50; Zaman = 50. 3 mm "çukur" filamentler (Sutter Instrument FT330B) ile çektirme takın. 2 mm boyutu filamentler bize daha az tatmin edici sonuçlar için vermiştir. Öte yandan, mikropipet ipuçları beveling bizim için sonuçlarını geliştirmek için görünmüyor.
  2. 1-2 mg / ml bir son konsantrasyona kadar hızlı şekilde yeşil% 0.1 içeren PBS içinde saflaştınldı, endotoksin içermeyen DNA (Hücre Kültürü Sınıf) içinde çözülür. Hızlı Yeşil embriyonik beyin ventrikül görünür enjekte çözüm yapacaktır.
  3. Cam mikropipet içine DNA çözüm 10 ul yükleyin.
  4. Enjeksiyon sistemi (Pico Pompa) veya ağız pipet cam mikropipet bağlayın.

2. Anestezi

Bir ısıtma yastığı ve cerrahi aletler ile cerrahi tablo hazırlayın. Embriyoların görselleştirme kolaylaştırmak için soğuk ışık kaynakları açın. Örneğin bir cam boncuk sterilizatör için kullanarak cerrahi aletler dezenfekte edin.

Üç farklı anestezi prosedürleri (Tartışma) bu protokol için mümkündür. Burada biz (debisi 0,5 L / dk) anestezi indüksiyonunda izofluran inhalasyon kullanarak, iyi düşünün bir de bakım (akış hızı 1 L / dk) anlatacağız.

  1. Boru kısa bir uzunluğu Komesaroff Mark 5 Anestezi Cihazı bağlı bir (yani fare görünür kalır) şeffaf küçük bir kapta hamile fare tanıtmak.
  2. Izofluran ile buharlaştırıcı doldurun, daha sonra cihaza bağlı oksijen şişe açın. Isofl bir ya da iki darbe Darbeurane / narkoz set in için fare ve saat tutan kaba oksijen (0.5 L / dk)
  3. Onları kurumasını önlemek ve hemen kendi kafasına akış anestezi maskesi uygun merhem ile göz kapağı, fareyi çıkarın.

3. Laparotomi

  1. Isıtma yastığı (aksi takdirde vücut ısısı kurtarma şansı azalan, çok hızlı aşağı gidecek) kadar göbek fare yerleştirin ve bant ile yanlarına dört ayakları sabitleme tarafından yerine gövdesi sabitleyin. Refleks stimülasyon (firma basınç ile örneğin parmak veya kuyruk tutam) yanıt kaybı denetleyerek anestezi derinliği değerlendirin.
  2. Karın yüzeyi Tıraş ve iodophorpovidone-iyot (Braunoderm) ile dezenfekte edin.
  3. Karın derisi üzerinde bir uzunlamasına kesik (1-1,5 cm uzunluğunda) olun. Daha sonra periton kesti. Kesi etrafında pamuk gazlı bez yerleştirin. Bir uterin boynuz görünür yapın ve PBS-durulanır gauz üzerine künt forseps ile dikkatli bir şekilde çekine. Çok sık, her zaman (Şekil 2A ve 2B) nemlendirilmiş tutmak için PBS ile rahim durulayın. Tüm işlem sırasında rahim içinde yüksek basınç kürtaj ile sonuçlanan enjeksiyon üzerine sıvı kaybı şansı artan embriyo ilettiğiniz çünkü, sıkı mesometrium veya rahim çekerek kaçının.

4. Beyin Ventrikül içine DNA Enjeksiyon

  1. Beyin ventriküller görülebilmesi şekilde rahim tutun. Yaygın olumsuz bir pozisyonda yatıyor bir embriyo yeniden konumlandırmak etmeyin - bu sadece kürtaj şansını artırır.
  2. Üstten embriyonun kafası bakıldığında, sol ve sağ kortikal hemisfer arasındaki görsel boşluğu veya fissür lokalize. Hemisfer ayırt etmek kolaydır ve içlerinde lateral ventriküller (hedef olmamak), genellikle biraz daha koyu şekiller olarak algılanabilir. Bir embriyo (Figür DNA enjeksiyonu için mükemmel odaklı olduğu bulunursaes 2C ve 2D), bu delmek için rahim duvarı mevcuttur ve aynı anda üçüncü ventrikül girin. Yaklaşık 1 mm delici, rahim duvarı ve kortikal hemisfer arasındaki farkın rostral sonunda delinme buna 45 ° cam mikropipet tutun. Bu şekilde, cam mikropipet ucu beyin (değil yanal ventrikül) (Şekil 2C ve 2D) üçüncü ventrikül girecektir. Bu embriyonik baş çevresinde ilk delmek rahim duvarına (her zaman 45 °) için yararlıdır az olumlu odaklı embriyolarda, kortikal hemisfer arasında doğru pozisyonda mikropipet ucu yerleştirin ve ancak o zaman beyin perfore. Üçüncü ventrikül (iyi bir enjeksiyon yeşil sıvı ile ventrikül doldurur) içine DNA çözüm 1 ul hakkında enjekte edilir. Bir rahim boynuzu tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın. Bu DNA çözümü için bir süre ventriküler sıvı ile eşit karıştırın ve entir ulaşmasını sağlare neuroepithelium.

5. Elektroporasyon için Hipotalamus Hedefleme

  1. Üzerinde Elektroporatör açın ve embriyonik yaş (E12.5 için biz 5 kare-dalga darbeleri kullanın, 50 V, 50 msn ON/950 msn OFF) göre ayarlayın. Pozitif kutbu paslanmaz çelik iğne elektrot (CUY550-10) olarak ve negatif kutup yuvarlak düz elektrot (CUY700P4L) olarak kullanın. (Bu, aksi takdirde mevcut değil, sadece bu kadar embriyo çevresinde akar yana elektrotlar, embriyo daha küçük olması önemlidir.)
  2. Elektroporasyon için olan sırt tarafında (yani deneyci dönük) kadar (bunlardan çoğu gibi) bu embriyoların seçin, ve olan yönelim elverişli değildir bu atın. Bu etanol-dezenfekte parmakları ile veya eldiven ile rahim dokunmak artık güvenlidir. Forseps ile rahim Holding Ancak, elektroporasyon sırasında elektrik akımını bozabilir.
  3. Pierce amn arasındaki embriyonun başkanı tarafından rahim duvarıiğne elektrot ucu ile aşağı doğru sokmak tarafından iotic kese ve plasenta. Itme blok gibi diğer elin işaret parmağınızı kullanın. Elektrot ucu yaklaşık 5 mm orta beyin (Şekil 2E ve 2F) yaklaşık düzeyinde, amniyon kesesi ve uterus duvar arasında şimdi olmalıdır. Bu "hedef elektrot", bu nedenle konumunu hipotalamik neuroepithelium parçası transfekte almak için büyük olasılıkla belirlemek unutmayın. Embriyo çok yavaşça elektrotlar arasında "sıkıştırılmış" olmak zorundadır.
  4. Öte yandan, pozisyon ile embriyo kafası (Şekil 2E ve 2G) ters tarafında rahim dış duvarın yuvarlak yassı elektrod.
  5. (, 950 msn kapalı, 5 kare dalga darbeleri ON 50 V, 50 msn) gerilim uygulamak için pedal anahtarı kullanın.
  6. Diğer elin işaret parmağı ile rahim geri tutarak yavaşça rahim iğne elektrot çekin - eğer Amniotik sıvı Patlak duvarından kaybolur, genellikle embriyo kürtaj geçirecek. Tüm embriyolar ile aynı işlemi tekrarlayın.
  7. Karın içine rahim boynuz dönün ve kalan boynuz içinde enjeksiyon ve elektroporasyon tekrarlayın.

6. Cerrahi Bitirme

  1. Tüm embriyoların enjeksiyon ve elektroporasyon sonra, kapatmadan önce serum fizyolojik ile periton boşluğuna önce ve nemli tam olarak konumlandırılmış, çok dikkatli bir şekilde karın geri rahim yerleştirin.
  2. Cerrahi katgüt (Vicryl poliglaktin 910, 5-0, Ethicon V4914) ile periton dikin. Cilt kullanım kapatılması için methodwith daha dayanıklı sütür (Supramid Naylon, 6-0, Serag Wiessner 07171L TO) "dikiş kesildi".
  3. Povidon-iyot (Braunoderm) ile karın yüzeyi dezenfekte edin ve bir non-steroid subkutan anti-inflamatuar (örneğin% 0.9 NaCl içinde Rimadyl içinde 1:10 çözüm 100 ul) veya, daha iyi, met gibi bir opioid enjekteprenorphine (Temgesic,% 0.9 NaCl 0.05 ile 0,1 mg / kg vücut ağırlığı) ağrı gidermek için.
  4. Anestezi makineden anne çıkarın ve bir ısıtma yastığı ile ısıtılan bir kafes yerleştirin. Tamamen anestezi kurtarıldı kadar sürekli fare izleyin. Daha sonra, onlar enfeksiyon veya ağrı belirtisi olmadan prosedürü gelen kurtarma sağlamak için her gün hayvanları kontrol edin.

7. Sonuçları analiz

  1. Analiz istenilen güne göre embriyolar (veya postnatals) hasat. Doğum Sonrası fareler (1 ile 2 günlük) dekapitasyon tarafından öldürüldü.
  2. Bir önceki elektroporasyon açıklama göre her embriyo ayırın. Bir stereo mikroskop altında beyin incelemek ve uygun bölgede yeşil floresan sinyal (GFP muhabiri itibaren) için mikroskop altında kontrol edin.
  3. Seçilen beyin "taze" analiz edilebilir:% 4 paraformaldehid kısa bir süre için doku düzeltmek ve agaroz% 4 veya jelatin-bir gömmeklbumin, o zaman bir vibratome tipi cihaz bölümü (Şekil 3). Daha detaylı immünohistokimyasal analizi için (Şekil 4), OKT montaj orta (Doku Tek) gömmek% 30 sakaroz çözüm, beyinde kriyo-koruma sonra kriyostat 20 mikron bölümleri kesti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En hipotalamus nöronlar biraz daha kısa fare geliştirme 27,28 tercüme sıçan 26 doğum kalma analizine göre, E11.5 arasında E15.2 için doğarlar. Hipotalamik nöron zirve E12.5 29-31 ulaşılır. Buna göre, bu çalışmada (E12.5) için seçilen transfeksiyon yaşta, hipotalamus nöronları büyük bir kısmı, herhangi bir rostro-kaudal seviyesinde etiketlenebilir.

Kalın vibratome tip bölümlerde E18.5 de analizi (Şekil 3A ve 3B), hipotalamik n...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anestezi hakkında: Hipotalamus içine utero elektroporasyon teknik olarak zorlu olması ve daha uzun narkoz kez gerektirebilir yana, oksijen ve izofluran karışımı verilmesi ile anestezi neden ve korumak için tercih. Bizim tecrübelerimize göre, hayvanlar en az, annenin iyileşme çok hızlı, ve embriyo hayatta kalma geliştirilmiş bir saat kadar süre bu şekilde uygun anestezi kalabilir. Anestezi için diğer yaklaşımlar da mevcuttur. En basit bir prosedür intraperitoneal enjeksiyon ile narkoz neden olan ve muha...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
 REAKTİFler< / güçlü >
AcepromazineSanofi GmbHanestezik
İzofluranBaxterHDG9623anestezik
KetaminPharma GmbHanestezik
Fast GreenFluka44715& nbsp;
RimadylPfizernon-steroidal anti-inflamatuar
Braunoderm Braun3887138povidon-iyot
Fosfat Tampon Salin PBSGibco14190 
Temgesic (buprenorfin)Essex Pharmaopioid analjezik
Göz MerhemiPan-Oftal7136926 
KsilazinBayer 
  EKİPMANLAR< / güçlü >
Anestezik Cihaz Komesaroff Mark-5Tıbbi Gelişmeler AvustralyaACN 004 903 682 
Kılcal çektirme P-97Sutter Instrument Co.P-97 
SıkıştırmaHassas TalimatıVF-300Vibratom tipi cihaz
Konfokal MikroskopZeissLSM700 
KriyostatLeicaCM3050S 
ElektroporatörNepa Gene Co., Ltd.CUY21EDIT 
Elektrot 1Nepa Gene Co., Ltd.CUY550-10Paslanmaz Çelik İğne Elektrodu, 10 mm Uç, 0,5 mm çap
Elektrot 2Nepa Gene Co., Ltd.CUY700P4LKapaklı Yuvarlak Platin Plaka 4 mm çap
Fiberoptik soğuk ışık kaynağıLeicaKL2500 LCD 
Cam kılcal damarlarHarvard AparatıGC120T-151. 2 mm Dış Çap x 0.94 mm İç Çap
Cam boncuk sterilizatörüGüzel Bilim AraçlarıFST250ve nbsp;
Isıtma yastığıHarvard Aparatıpy872-5272& nbsp;
Enjeksiyon cihazıDünya Hassas AletlerPnömatik Pico Pompa PV820 
Sütür İplik Kaplı VicrylEthiconV4914Peritoneal
Sütür Thr. SupramidSerag WiessnerTO07171LCilt Sütürü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236(2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27(2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4(2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Utero ElectroporationHypothalamic DevelopmentMouse EmbryoDNA InjectionThird VentricleElectrode PositioningFluorescence MicroscopyMammillary BodyCell MigrationGenetic Specification

İlgili makaleler