Bu protokol, biz aynı anda bal arıları iki gen (çift gen demonte) bastırmak iki strateji açıklar. Sonra bal arısı tat algısı çift gen demonte etkisini incelemek için burnumun uzantısı yanıt (PER) testi nasıl kullanılacağı mevcut.
Yöntem makalesi
Bu protokol, biz aynı anda bal arıları iki gen (çift gen demonte) bastırmak iki strateji açıklar. Sonra bal arısı tat algısı çift gen demonte etkisini incelemek için burnumun uzantısı yanıt (PER) testi nasıl kullanılacağı mevcut.
Bu video çift zincirli RNA (dsRNA) enjeksiyonları kullanarak bal arıları aynı anda iki gen downregülasyon RNA girişim (RNAi) 'nin yeni teknikler gösterilmiştir. Ayrıca tat algı ölçümü için hortum uzantısı yanıt (PER) testinin bir protokol sunar.
RNAi-aracılı gen demonte hedef gen ifadesi Aşağı doğru düzenleme etkili bir tekniktir. Bu teknik genellikle tek gen manipülasyonu için kullanılan, ancak etkileşimler ve genler arasında ortak etkileri tespit etmek için sınırlamalar vardır. Bu videonun ilk bölümünde, biz aynı anda iki gen (çift gen demonte olarak adlandırılır) yıkmak için iki strateji sunuyoruz. Biz her iki stratejinin etkili bir düzenleyici geri besleme döngüsü olan iki gen, vitellogeninin (vg) ve Ultraspiracle (USP), bastırmak edebiliyoruz göstermektedir. Bu çift gen demonte bir yaklaşım genler arasındaki ilişkileri incelemek için kullanılabilir ve kolayca uygulanabilirfarklı böcek türü.
Bu videonun ikinci kısmı çift gen demonte tedavisi sonrasında bal arıları içinde burnumun uzantısı yanıt (PER) testi bir örneğidir. BAŞINA testi bal arılarının, bir bal arısı davranışsal olgunlaşma ne kadar hızlı için önemli bir belirleyici olduğu da tat algısı ölçmek için standart bir testtir. Yuva arıların daha fazla tat algısı genellikle polen uzmanlık yiyecek arama ve yiyecek arama başlama erken yaşta ile ilişkili artan davranışsal gelişim gösterir. Buna ek olarak, BAŞINA test bal arıları içinde doyma veya açlık metabolik durumları tanımlamak için uygulanabilir. Son olarak, test PER arılar da yaygın olarak bal arıları öğrenme ve bellek çalışmaları için kullanılan klima için farklı koku uyaranlara eşleştirme ile birlikte.
RNA interferans (RNAi) ökaryotik organizmaların bir yelpazede oluşur RNA temelli transkripsiyon sonrası gen susturma vardır. RNAi işlemi endojen veya eksojen çift sarmallı RNA (dsRNA) öncüleri tarafından tetiklenir. DsRNA bağlar ve küçük parçaları (20-25 bp) için dsRNA parçalayarak ribonükleaz protein Dicer harekete geçirir. Daha sonra dsRNA kılavuzun küçük parçalara argonaute proteinler tarafından tamamlayıcı mRNA bir tanıma ve bölme, RNA'ya bağlı susturma kompleksi (RISC), 1 katalitik bir bileşeni. Memelilerde, 30 nt daha uzun dsRNA'ları, RNA transkript 2 spesifik olmayan bozulmasına yol açan bir antiviral (interferon yanıtı, IFN) akti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bölüm 1: RNAi-aracılı çift gen demonte
1. dsRNA Sentez
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tek enjeksiyon ve iki günlük enjeksiyon stratejileri hem önemli ölçüde bal arıları içinde transkript düzeyleri VG (Tek yönlü ANOVA, p <0.001) (Şekil 2A) ve USP (Tek yönlü ANOVA, p <0.001) (Şekil 2B) azaltılmış dsRNA sonra altı gün enjekte edildi. DsRNA karışımı ile tek enjeksiyon ve VG birinci ve USP ikinci (vg / USP) ile iki günlük enjeksiyon kullanarak USP transkript bastırılması usp ilk ve VG ikinc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Çalışmamız aynı anda yetişkin böcekler iki gen yıkmak için ilk çabadır. Sonuçlarımız dsRNA enjeksiyon (tek enjeksiyon ve iki günlük enjeksiyon) iki strateji çift gen baskılanması ve vg ve USP aynı anda gen susturulması için geçerli olan 6 gün arıların 8,9 içine dsRNA enjeksiyon sonra test edilebilir olduğunu göstermektedir. Ancak, gen demonte etkinlik hücreleri veya organları tarafından hedef gen, protein devir oranları ve dsRNA alımı verimlilik transkript düzeyine bağlı olarak farklı böcek .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.
Yazarlar deney yardım için Erin Fennern teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Norveç araştırma Konseyi (180504, 185.306 ve 191.699), PEW Charitable Trust ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA P01 AG22500) tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 kuyulu plakada GE Healthcare PCR boncukları | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
| QIAquick PCR saflaştırma kiti | Qiagen | 28104 | |
| RiboMax T7 RNA üretim sistemi | Promega | P1300 | |
| Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
| Kloroform: İzoamil alkol 24: 1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| izopropil alkol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Hamilton mikro şırınga | Hamilton | 80301 | |
| 30G BD tek kullanımlık iğneler | BD Biosciences | 305106 | |
| Sükroz | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 1 ml Şırınga | BD Biosciences | 30960 | |
| Stereo diseksiyon mikroskobu | Leica Microsystems | S6D | |
| Böcek pimleri | Güzel Bilim Araçları | 26000-25 | |
| Balmumu plakası |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste