Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Protein AKIL: A Tezgahı

16.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50476

⸱

25 Temmuz 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Bu makalede

Özet

Protein tasarımının birkaç önemli alanını ele alabilen hesaplamalı de novo protein tasarım yöntemleri geliştirdik. Bu yöntemleri yaymak için, protein tasarımı için çevrimiçi bir araç olan Protein WISDOM'ı sunuyoruz (http://www.proteinwisdom.org). Yapısal bir şablondan başlayarak, artan stabilite için monomerik proteinlerin ve artan bağlanma afinitesi için komplekslerin tasarımı gerçekleştirilebilir.

Özet

De novo protein tasarım amacı, doğal diziye göre bu tür bir bağlanma afinitesi, agonist ya da antagonist davranış veya stabilite gibi belirli özellikleri, iyileştirmeler ile arzu edilen bir 3-boyutlu yapı içine düşen doyurmaya amino asit dizileri bulmaktır. Protein tasarım güncel gelişmeler ilaç tasarımı ve keşif merkezinde yer almaktadır. Sadece protein tasarım potansiyel olarak yararlı ilaç hedefleri için tahminler sağlar, ama aynı zamanda protein katlanması süreci ve protein-protein etkileşimleri anlayışımızı artırır yok. Bu yönlendirilmiş evrim gibi deneysel yöntemlerle protein tasarımı başarı göstermiştir. Ancak, bu tür yöntemleri tractably aranabilir sınırlı dizisi boşluk sınırlıdır. Bunun aksine, hesaplama tasarım stratejileri özellikler ve işlevler geniş bir yelpazede kapsayan dizileri çok daha büyük bir dizi tarama için izin verir. Biz hesaplama de novo protein tasarım metodoloji bir dizi geliştirdikprotein tasarım birçok önemli alanlarda mücadele yeteneğine ds. Bu artan bağlanma afinitesi açısından daha yüksek kararlılık ve kompleksleri için monomerik protein tasarımı içerir.

Daha geniş için bu yöntemleri yaymak için biz Protein AKIL (mevcut kullanmak http://www.proteinwisdom.org ), protein tasarım sorunları çeşitli için otomatik yöntemler sağlayan bir araçtır. Yapısal şablonları tasarım süreci başlatmak için sunulur. Tasarım ilk aşaması sırası alanda potansiyel enerji minimizasyonu yoluyla istikrarı geliştirmek amaçlayan bir optimizasyon sırası seçim aşamasıdır. Seçilen dizileri daha sonra bir kat özgüllük sahne ve bir bağlanma afinitesi sahne aracılığıyla çalıştırılır. Sürecinin her adımı için dizilerin bir rütbe-sipariş listesi birlikte ilgili tasarlanmış yapıları, tasarım kapsamlı bir nicel değerlendirme ile kullanıcıya sunar. Burada ayrıntıları o sağlamakm, her bir tasarım yöntemi, hem de yöntemlerin kullanımı ile elde birkaç önemli deneysel başarılar.

Giriş

De novo protein tasarımı, gelişmiş özelliklere veya işleve sahip istenen bir üçüncül yapıyı verecek protein dizilerinin tanımlanmasıdır. Bir proteinin doğal kıvrımı, serbest enerji minimumunda yer alan konformasyon olduğundan, de novo protein tasarımı, hedef kıvrımda minimum serbest enerjiye sahip olacak dizileri arar. Bu sorun ilk olarak Drexler1 ve Pabo2 tarafından tanımlanmış ve "ters katlama sorunu" olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte, bir dizinin yalnızca bir katlanmış yapı çözeltisi verebildiği protein katlanma probleminden farklı olarak, de novo protein tasarım problemi dejenerasyon sergiler. Birçok farklı amino asit dizisi aynı üçüncül yapıyı ve işlevi verebilir.

Protein tasarımı geleneksel olarak rasyonel tasarım ve yönlendirilmiş evrim yoluyla deneysel olarak gerçekleştirilirken, deneysel yöntemlerin doğasında bulunan sınırlı arama alanının üstesinden gelmek için hesaplamalı yöntemler daha yakın zamanda kullanılmıştır. Deterministik yöntemler, stokastik yöntemler ve olasılıksal yöntemler dahil olmak üzere çeşitli hesaplama yöntemleri kullanılmıştır. 3,4 Erken hesaplama yöntemleri, problemin çözülmesini kolaylaştırmak için sabit omurga şablonlarını kullandı. 5-7 Daha hızlı işlemcilerin, yüksek performanslı bilgi işlemin ve daha verimli algoritmaların ortaya çıkmasıyla, omurga esnekliği, sabit omurga şablonlarının8-14 bir topluluğu kullanılarak veya şablonu atom-atom mesafeleri ve dihedral açılar açısından ifade ederek gerçek omurga esnekliğini dahil ederek dahil edilmiştir. 15,16

Bu makale, hesaplamalı de novo protein tasarım çerçevemizi kullanmak için akademik topluluğa sunulan çevrimiçi bir araç olan Protein WISDOM'ı ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu çerçeve, HIV, kanser, kompleman hastalıkları ve diğer otoimmün bozukluklar gibi hastalıkları hedef alan terapötik kullanım için çok sayıda proteinin tasarımına uygulanmıştır. Tahmin edilen peptitlerin çoğu deneysel olarak doğrulandı ve bu da yöntemin gücünü gösterdi. Tablo 1, protein veya peptidin boyutu, tahmin sayısı ve deneysel doğrulama dahil olmak üzere tasarlanmış farklı proteinlerin bir özetini sunmaktadır.

Protein Tasarımı Protein Uzunluğu # Hesaplamalı Tahminler # Deneysel Doğrulamalar referans İnsan beta-defensin-2'nin tam dizi tasarımı 41 340   (17) buyurmuştur. İnsan C3'ün compstatin inhibitörleri 13 28 3/3 (18, 19) Sıçan C3c'ye bağlanan compstatin analogları 13 5   (20) buyurmuştur. Di-serin uzantılı compstatin analogları 15 8     Compstatin analog W4A9'un stabilize edici yapısı 13 18     C3a reseptör agonistleri ve antagonistleri 77 20 4/7 (21) buyurmuştur. C5a reseptör agonistleri ve antagonistleri 74 61 2/61   HIV-1 gp14 inhibitörleri 12 6 4/5 (22) buyurmuştur. HIV-1 gp120 inhibitörleri 9 14     Bcl-x L ve Bcl-2'nin Bak inhibitörleri 16-18 yaş arası 10 5/5 (23) buyurmuştur. ERK2 inhibitörleri 11 25     EZH2 inhibitörleri 21 17 10/10 (24) LSD1 ve LSD2 inhibitörleri 16 41 17/20   HLA-DR1 inhibitörleri 13 6   (25) buyurmuştur. PNP inhibitörleri 5 13    

Tablo 1. De novo protein tasarım çerçevesi kullanılarak tasarlanan proteinlerin ve peptitlerin özeti. Hesaplamalı tahminlerin #'si, olumlu tahminlerin sayısı olarak sunulur (yani, belirli bir kesimin üzerindeki katlama özgüllükleri veya yerel diziden daha büyük yaklaşık bağlanma afiniteleri). Deneysel doğrulamaların #'si iki sayı verir: birincisi deneysel olarak doğrulanan tahminlerin sayısı, ikincisi ise deneysel olarak test edilen toplam tahmin sayısıdır.

İnsan-beta-defensin-2 (hβD-2) tasarımı, peptidin antimikrobiyal özelliğini arttırmak için gerçekleştirildi. 17 Bu tasarım için iki durumu göz önünde bulundurduk: 1) hβD-2 boyunca 10'a kadar mutasyon ve 2) Sisteinler (8, 15, 20, 30, 37 ve 38) hariç tüm hβD-2 kalıntı konumlarının tam dizi tasarımı. Tasarımda üç farklı desen şablonu ve üç farklı dizi seçim modeli kullanılmıştır. Hem 10 mutasyon tasarımı hem de tam dizi tasarımı için ağırlıklı ortalama ve mesafe kutusu modelleri arasında mutasyonlarda yüksek düzeyde benzerlik gözlenmiştir. Ek olarak, çok sayıda dizinin doğal diziye göre daha uygun hesaplanmış Kat Özgüllüğü değerlerine sahip olduğu bulundu.

Kompleman sistem inhibitörleri (C3, C3a ve C5a) inme, kalp krizi, Alzheimer hastalığı, astım, romatoid artrit, ksenotransplantasyonun reddi, yetişkin solunum yolu hastalığı, sedef hastalığı ve Crohn hastalığı gibi bir dizi bağışıklık hastalığıyla mücadele etmek için tasarlanmıştır. Protein tasarım çerçevesi tarafından tahmin edilen üç C3c kompstatin inhibitörü ve rasyonel olarak tasarlanmış üç dizi, doğal compstatinden daha iyi bağlayıcılar olarak deneysel olarak doğrulandı. 18,19

Daha ileri çalışmalar, primat olmayan C3c'ye karşı compstatin aktivite kaybını inceledi ve bir dizi aday sıçan ve fare C3c inhibitörü tasarladı. Beş dizinin, sıçan C3c ile C3c'yi inhibe ettiği bilinen W4A9 compstatin mutantından daha uygun ilişki serbest enerjilerine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu, Arg1 tarafından yeni bir tuz köprüsü oluşumundan kaynaklanmaktadır. 20 N-terminal uzantılı sekiz dizinin, di-Serin uzantılı W4A9'dan daha iyi bağlayıcılar olduğu tahmin edildi. Son olarak, 18 compstatin dizisinin W4A9'un bağlı konformasyonunu stabilize ettiği ve primat ve primat olmayan C3c inhibitörleri için güçlü adaylar sağladığı tahmin edildi.

C3c inhibitörlerine ek olarak, C3a ve C5a reseptör agonistleri ve antagonistleri, C3a ve C5a'nın yapılarına dayalı olarak tasarlanmıştır. Model tarafından tahmin edilen yedi C3a dizisi deneysel olarak test edildi. Dizilerden ikisi güçlü agonistler iken, diğer ikisi kısmi agonistlerdi. 21 İki güçlü agonist, daha önce keşfedilen bir "süperagonist" e göre 58 kat iyileşme gösterdi. C5a reseptör agonistlerinin ve antagonistlerinin tasarımı, 61 diziden oluşan bir set sağladı. Tüm diziler sentezlendi ve ikisinin yeni C5a agonistleri olduğu bulundu.

AIDS'e neden olan virüs olan HIV-1'in

füzyon inhibitörleri, HIV-1'in hücreleri enfekte etmesini önlemek için tasarlanmıştır. İlk tasarım, HIV-1'in bir zarf glikoproteini olan gp41'i hedef aldı. Protein tasarım çerçevesi, doğal diziden daha iyi bağlayıcı olan altı diziyi öngördü. Bu tahmin edilen dizilerden dördü, HIV-1'i inhibe etmek için deneysel olarak doğrulandı ve en iyi dizi 29 μM kadar düşük bir IC50'ye sahipti. Bu dizi, doğal diziye göre 3-15 kat iyileşme gösterdi ve Enfuvirtide dirençli bir virüs suşuna karşı aktivite kaybı olmadı. 22 İkinci tasarım, HIV-1'in başka bir zarf glikoproteini olan gp120'yi hedef aldı. On dört dizinin gp120'nin bağlayıcıları olduğu ve HIV-1'in ek potansiyel füzyon inhibitörleri sağladığı tahmin edildi.

Kanserle bağlantılı çok sayıda protein, kanser terapötikleri için umut verici hedefler sağladı. Bcl-2 ve Bcl-xL, hücre ölümünü önleyen anti-apoptotik proteinlerdir. Bu iki proteinin inhibitörleri, kanser hücrelerinde hücre ölümünü indüklemek için tasarlanmıştır. On dizinin doğaldan daha iyi bağlayıcı olduğu tahmin edildi ve bu sonuçlar önceki deneysel ve mutajenez sonuçlarını yakaladı. 23 Başka bir hedef protein olan ERK2, onu antiproliferatif kanser tedavileri için umut verici bir hedef haline getiren sinyal iletim kaskadlarında yer alır. Yirmi beş dizinin ERK2'nin inhibitörleri olduğu tahmin edildi.

Histon metiltransferazlar ve demetilazlar, prostat, meme, lenfoma, miyelom, mesane, kolon, cilt, karaciğer, endometriyal, akciğer ve mide dahil olmak üzere birçok kanser türüyle bağlantılı olan histon metilasyonunu dinamik olarak kontrol eder. De novo protein tasarım çerçevesi, 17 EZH2 inhibitörü (bir Lizin metiltransferaz) tanımladı ve deneysel olarak test edilen on inhibitörden hepsinin EZH2'yi inhibe ettiği bulundu. 24 En güçlü peptit, yaklaşık 13 μM'lik bir IC50'ye sahipti, yüksek enzim konsantrasyonları ile eşit derecede etkiliydi ve kofaktör ile rekabet etmedi. Bu peptitler, EZH2'nin ilk inhibitör setiydi. 53 LSD1 inhibitörü (bir demetilaz) çerçeve tarafından tahmin edildi ve deneysel olarak test edilen 20 inhibitörün 17'si LSD1 inhibitörü ve 18'i LSD2 inhibitörüydü. En iyi inhibitörler, 1 μM'nin altında IC50 değerlerine sahipti ve bu da onları bugüne kadar keşfedilen en güçlü peptidik inhibitörler haline getirdi.

Son iki protein sistemi, Çölyak hastalığı, diabetes mellitus tip 1, sistemik lupus eritematozus, Sjögren sendromu, Churg-Strauss Sendromu, Hashimoto tiroiditi, Graves hastalığı, idiyopatik trombositopenik purpura, romatoid artrit ve alerjiler gibi çeşitli otoimmün hastalıkların tedavisi için hedefler sağladı. Bu potansiyel inhibitörlerin hiçbiri deneysel olarak doğrulanmamıştır, ancak çerçeve HLA-DR1'e bağlanan altı dizi ve PNP'ye bağlanan 13 dizi öngörmüştür.

Tablo 2, de novo protein tasarım çerçevesi kullanılarak tahmin edilen deneysel olarak doğrulanmış inhibitörleri ve agonistleri özetlemektedir. Yaklaşık bağlanma afinitesi metriği, dizilerin dokuzunu (insan C3c inhibitörleri, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 ve LSD2) tahmin etmek için kullanılırken, kat özgüllüğü metriği, dizilerin dördünü (C3aR'nin agonistleri / antagonistleri) tanımlamak için kullanıldı. Bu peptitler, de novo protein tasarım çerçevesinin, özellikle de eklenen yaklaşık bağlanma afinitesi metriğinin başarısını vurgulamaktadır. Çerçeve, uygulanabilirliği açısından son derece çok yönlüdür. Yirmi beş farklı hastalıkla bağlantılı altı farklı protein başarıyla tasarlanmış ve deneysel olarak doğrulanmıştır.

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi mili Serisi Serisi Serisi Serisi arası Serisi Serisi (İngilizce) Serisi (İngilizce) Serisi Serisi Serisi Serisi
adIC50EC50Protein HedefiUygulanabilir Hastalıklar
SQ0270,94 μM insan C3cinme, kalp krizi, Alzheimer hastalığı, astım, romatoid artrit, sistemik lupus eritematozus, multipl skleroz, sedef hastalığı, diyabet tip I, Crohn hastalığı, pankreatit ve kistik fibroz
SQ0861,98 μM insan C3c
SQ0594,73 μM insan C3c
SQ110-4 15,2 denizC3aR
SQ060-4 36,4 milyonC3aR
SQ007-515,4 milyon C3aR
SQ002-526,1 nM C3aR
SQ43529 - 253 μM HIV-1 gp41AIDS
SQ03713,57 μM EZH2prostat, meme, lenfoma, miyelom, mesane, kolon, cilt, karaciğer, endometriyal, akciğer ve mide kanserleri
SQ011-10,521 μM LSD1
SQ016-10,249 μM LSD1
SQ026-12,51 μM LSD2
SQ015-11.332 μM LSD2

Tablo 2. Çeşitli hastalıkları hedef alan hesaplamalı olarak tahmin edilmiş ve deneysel olarak doğrulanmış peptitler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yöntem Özeti

Protein WISDOM'da kullanılan de novo tasarım çerçevesi iki aşamadan oluşur. İlk aşama, belirli bir şablon yapıya katlanacak amino asit dizilerinden oluşan sıralı bir liste üretir. İkinci aşama, katlanma özgünlüğünü veya yaklaşık bağlanma afinitesini ya da her ikisini hesaplayarak bu dizileri doğrular. İlki temel olarak tek bir protein tasarımı yapıldığında, ikincisi ise bir kompleks (bir hedef proteine bağlanan bir peptit) tasarımı yapıldığında kullanılır. Şekil 1, çerçevede yer alan adımların genel bir özetini sunmaktadır.

Tasarım Girdileri: de novo protein tasarım çerçevesi için bir dizi girdinin tanımlanması gerekir. Bunlardan ilki tasarım şablonudur. Bu, proteindeki tüm atomların koordinatlarını içeren 3 boyutlu (3D) bir protein yapısıdır. Yapı rijit veya esnek olabilir. Rijit şablonlar, sabit atom koordinatlarından oluşan bir kümedir ve X-ışını kristalografi yapılarından elde edilirler. Esnek şablonlar ise sabit atom koordinatları veya atom koordinatları için alt ve üst sınırlar şeklinde olabilir. Bu şablonlar NMR çözelti yapılarından, moleküler dinamiklerden veya kenetlenme (docking) simülasyonlarından elde edilebilir.

Tasarım şablonu, tasarlanan proteinin izin verilen mutasyon setini oluşturmak için kullanılır. Bu set, dizinin hangi pozisyonlarının hangi amino asitlere mutasyona uğrayabileceğini tanımlar. Mutasyon seti, tasarım şablonundaki her bir kalıntının çözücüye erişilebilir yüzey alanı (SASA) hesaplanarak oluşturulur. Eğer kalıntının %50'sinden fazlası çözücüye maruz kalmışsa, hidrofilik amino asitlerden oluşan bir sete (D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T) izin verilir. Eğer kalıntının çözücüye maruz kalma oranı %20'den azsa, hidrofobik amino asitlerden oluşan bir sete (A, F, I, L, M, V, W, Y) izin verilir. Kalıntının maruziyeti %20 ile %50 arasındaysa, tüm amino asitlere izin verilir. Deneysel veriler veya literatür bilgileri uygun görmediği sürece, sistein genellikle mutasyon setinden hariç tutulur. Küçük amino asitler (A, G, T) genellikle tüm mutasyon setlerine dahil edilir. Mevcut olduğunda, belirli amino asit pozisyonlarının mutasyon setlerini manuel olarak değiştirmek için deneysel veya literatür verilerinden yararlanılabilir.

Tasarım şablonundaki dizilerin çiftler arası etkileşim enerjisini hesaplamak için bir kuvvet alanı seçilir. Herhangi bir kuvvet alanı bu çerçeve içinde kullanılacak şekilde uyarlanabilse de, iki mesafe bağımlı kuvvet alanı geliştirilmiştir ve de novo tasarım çerçevesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincisi, mesafelerin kalıntıların Cα karbonları arasında olduğu yüksek çözünürlüklü bir Cα-Cα kuvvet alanıdır.26 İkincisi ise, mesafelerin kalıntıların merkezleri (centroid) arasında olduğu yüksek çözünürlüklü bir centroid-centroid kuvvet alanıdır.27 Kuvvet alanlarındaki enerji parametreleri, geniş bir protein eğitim seti için düşük enerjili yüksek çözünürlüklü decoy yapıların, yerli konformasyonlarından enerjik olarak daha az elverişli olmasını gerektiren doğrusal bir programlama parametre kestirim probleminin çözülmesiyle türetilmiştir. Yüksek çözünürlüklü centroid-centroid kuvvet alanı ve Cα-Cα kuvvet alanı, insan beta-defensin-2 üzerine yapılan önceki çalışmalarda test edilmiş ve doğrulanmıştır.17 Kuvvet alanlarının mesafe aralıklarına (bin) ayrılmasıyla, modele gerçek omurga esnekliği dahil edilmiştir. Bir amino asit çifti arasındaki mesafe, bir dizi mesafe aralığına aynı enerji değerini veren bir mesafe aralığına karşılık gelecektir. Bu durum, dizi seçimi optimizasyon modelinin omurga hareketlerini hesaba katmasını sağlar.

Yük kısıtlamaları veya içerik kısıtlamaları şeklindeki biyolojik kısıtlamalar, kullanıcı tarafından ek bir tasarım girdisi olarak manuel olarak dahil edilebilir. Yük kısıtlamaları, tasarlanan dizinin veya tasarlanan dizinin bir kısmının karşılaması gereken belirli bir yükü veya yük aralığını belirtir. Yük, pozitif yüklü kalıntıların (K ve R) toplamından negatif yüklü kalıntıların (D ve E) toplamının çıkarılmasıyla hesaplanır. İçerik kısıtlamaları, dizide belirli bir amino asidin görülme sıklığına ilişkin üst ve alt sınırları belirler. Biyolojik Kısıtlamalar genellikle doğal diziye yapılan kapsamlı bir dizi hizalaması yoluyla tanımlanır. Bunun amacı, bir protein ailesi için doğada temsil edilen yük ve amino asit içeriğine dair bilinen biyolojik sınırları yakalamaktır. Diğer kısıtlamalar ise bilinen deneysel verilerin analizi yoluyla manuel olarak tanımlanır.

Birinci Aşama: Sekans Seçimi: Orijinal sekans seçimi yöntemi ilk olarak Klepeis et al. tarafından geliştirilmiştir.15,16 Bu yöntem, bir Tam Sayı Doğrusal Optimizasyon (ILP) modeli kullanarak amino asit sekanslarını tasarım şablonundaki enerjilerine göre seçer ve sıralar. Yöntem daha sonra, rijit (tekli) şablonlar için hesaplama açısından daha verimli bir sekans seçimi modelinin kullanılmasıyla geliştirilmiş ve esnek şablonlar için modellerin geliştirilmesiyle genişletilmiştir. Bu küresel optimizasyon yöntemi rastgele mutasyonlara dayanmaz ve teorik olarak tüm sekans uzayını tarayıp küresel bir çözüm belirlemeyi garanti eder. Bu, yaklaşımımızın mevcut diğer tüm yaklaşımlara göre temel bir avantajıdır.

Tek Yapı Modeli: Klepeis et al.15,16 tarafından önerilen dizi seçim modelinin orijinal formu, Fung et al.28 tarafından daha da geliştirilmiştir. Final formu Denklem 1'de verilmiştir.

Denklemler ve kısıtlamalar içeren optimizasyon problemi; matematiksel optimizasyon, sembolik gösterimler.
i=1,...,n kümesi, tasarım şablonundaki kalıntı pozisyonlarını tanımlar. Her bir i pozisyonunda, mutasyonlar j{i}=1,...,mi ile temsil edilir; burada eğer i pozisyonunun yirmi doğal amino asitten herhangi birine mutasyona uğramasına izin veriliyorsa mi=20'dir. Tüm benzersiz ikili etkileşimleri temsil etmek için k>i olacak şekilde k≡i ve l≡j takma ad kümeleri kullanılır. Amino asit mutasyonlarını modellemek için yj alt indis i üst indis j, matematiksel gösterim, denklemlerdeki değişkenler. ve Birinci türev gösterimi y'_k, denklem, kalkülüs kavramı, eğitici formül. ikili değişkenleri tanıtılmıştır. Eğer model i pozisyonuna j amino asidini atarsa yj alt indis i üst indis j, matematiksel gösterim, denklemlerdeki değişkenler. değişkeni bir değerini, aksi takdirde sıfır değerini alacaktır (benzer şekilde Birinci türev gösterimi y'_k, denklem, kalkülüs kavramı, eğitici formül. için de geçerlidir). Amaç fonksiyonu, tasarım şablonundaki tüm ikili enerji etkileşimlerinin toplamını temsil eder. j amino asidinin işgal ettiği i pozisyonu ile l amino asidinin işgal ettiği i pozisyonu arasındaki enerji etkileşimi olan Soyut cebirde tensör gösterimi örneği; indis gösterimini örnekleyen matematiksel ifade. parametresi, iki pozisyondaki α-karbonların veya yan zincir centroidlerinin arasındaki mesafeye (xi,xj) ve j ile l amino asitlerinin türüne bağlıdır. Bu parametre, ancak hem yj alt indis i üst indis j, matematiksel gösterim, denklemlerdeki değişkenler. hem de Birinci türev gösterimi y'_k, denklem, kalkülüs kavramı, eğitici formül. bir'e eşitse amaç fonksiyonuna katkıda bulunur.

Fung et al.28, formülasyonun (1), sekans seçimi için kullanılan diğer on iki eşdeğer kuadratik atama benzeri modelden önemli ölçüde daha hesaplamalı olarak verimli olduğunu bulmuştur.28,29 Özellikle, insan beta-defensin-2 için iki sekans seçimi probleminde, biri 3,4x1045 karmaşıklık düzeyinde ve diğeri 49 ek doğrusal biyolojik kısıtla 6,4x1037 düzeyinde olan problemlerde, Klepeis et al.15,16 tarafından önerilen orijinal modeli geride bırakmıştır. Klepeis et al.15,16 tarafından önerilen orijinal modelin, Pentium IV 3,2 GHz işlemci üzerinde CPLEX 9.030 kullanarak iki problemi küresel optimalliğe ulaştırmak için sırasıyla 53.263 merkezi işlem birimi (CPU) sn ve 4.578 CPU sn harcadığı görülmüştür. Formülasyon (1) aynı görevleri gerçekleştirmek için yalnızca 649 CPU sn ve 14 CPU sn harcamış olup, bu durum hesaplama verimliliğinde sırasıyla 82 ve 327 katlık bir artışa karşılık gelmektedir.

Ağırlıklı Ortalama Modeli: Fung et al.28, tasarım şablonunun esnek olduğu ve bir dizi yapı içerdiği tipik de novo protein tasarım durumunu yönetmek için iki model geliştirmiştir. Ağırlıklı Ortalama Modeli, Tek Yapı Modeli'ndeki (Denk. 1) enerji parametresi Soyut cebirde tensör notasyonu örneği; indeks notasyonunu gösteren matematiksel ifade.(xi,xk) yerine, ağırlıklı ortalama bir enerji Statik denge formülü ΣE_ik^jl(x_i,x_k)wt(x_i,x_k,d) denklemi, matematiksel kavram. kullanır. Ağırlıklar wt(xi,xk,d), şablon yapılarda xi ve xk arasındaki mesafenin d mesafe kutusuna düşme sıklıklarıyla belirlenir. Ağırlıklı Ortalama Modeli'nin nihai formu Denk. 2'de verilmiştir.

Optimizasyon problemi denklemleri; doğrusal programlama modeli; kısıtlamalar ve ikili değişkenler; matematiksel formülasyon.
Mesafe Kutusu Modeli: Esnek şablon yapıları için ikinci sekans seçim modeli, bir ikili değişken olan bikd değişkenini tanıtarak çoklu yapılardan gelen mesafe bilgilerini dahil eder. Bu değişken, xi ve xk arasındaki mesafe d mesafe kutusuna düşüyorsa bire, aksi takdirde sıfıra eşittir. Tanıtılan bir diğer parametre olan disbin(xi, xk, d) ise, şablon yapılarından herhangi birinde xi ve xk arasındaki mesafe d mesafe kutusuna düşüyorsa bire, aksi takdirde sıfıra eşittir. Amino asit çifti başına yalnızca bir mesafe kutusu toplam enerjiye katkıda bulunacağından,Soyut cebirde tensör notasyonu örneği; indeks notasyonunu gösteren matematiksel ifade. amaç fonksiyonundaki ifadesi Matematiksel denklem Σ E(x) diyagramı; statik denge, araştırma analizi için toplama formülü. ile değiştirilir. Ancak bu durum, amaç fonksiyonuna doğrusal olmama özelliği getirir. Modelin doğrusallaştırılması ve uygulanabilirlik için eklenmesi gereken ek kısıtlamalar hakkında daha fazla ayrıntı Fung et al. çalışmasında28 bulunabilir. Mesafe Kutusu Modeli Denklem 3'te verilmiştir.

Optimizasyon problemi denklemleri; doğrusal programlama modeli; kısıtlar ve ikili değişkenler; matematiksel formülasyon.
Yukarıda formüle edilen Tam Sayılı Doğrusal Programlama (ILP) problemlerinin15-17 herhangi biri, dal-sınır (branch-and-bound) teknikleri kullanılarak titizlikle çözülebilir.28-30 Bu tür teknikler, küresel minimum enerji dizisine tutarlı ve güvenilir yakınsamayı garanti eder.

İkinci Aşama: Doğrulama: Şekil 2, İkinci Aşama için kullanılan iki yaklaşımın ayrıntılı bir genel görünümünü sunmaktadır. Şekil, nihai sıralama metriğinin hesaplanması için gereken adımları ve her adımda üretilen yapı sayısını göstermektedir.

Katlanma Özgünlüğü: Katlanma özgünlüğü, Birinci Aşamada elde edilen ön tasarımları sıralamak için kullanılan bir metriktir. Hesaplamanın amacı, enerji hesaplamalarına dayanarak, her bir dizinin şablon yapıya ne kadar iyi katlandığını şablonun orijinal dizisine kıyasla belirlemektir. Bunu gerçekleştirmek için, her biri farklı hesaplama gereksinimlerine sahip iki yaklaşım mevcuttur.

İlk yaklaşım Klepeis tarafından uygulanmıştır. ve ark..15,16 Bu yaklaşım, ASTRO-FOLD protein yapısı tahmin çerçevesini kullanmaktadır, 26,27,31-47 deterministik küresel optimizasyona dayalıdır. Bu yaklaşım, hesaplama açısından çok maliyetli olması nedeniyle şu an Protein WISDOM uygulamasında kullanılmamaktadır. Hesaplama kaynağı kısıtlamalarını ve tasarım aşamasındaki potansiyel olarak yüzlerce veya binlerce sekans üzerinde bu hesaplamayı gerçekleştirme ihtiyacını göz önünde bulunduran Fung ve ark..17 TINKER/CYANA kullanarak daha verimli bir yaklaşım önermiştir.48-50 Bu yaklaşım, yapının esnek bir şablonunun tanımlanmasını içerir. Esnek şablon, C atomları arasındaki mesafeler için üst ve alt sınırlar kullanılarak tanımlanabilir.α atomlarının yanı sıra kalıntıların ϕ ve ψ açıları. Tek bir yapı için, başlangıç mesafeleri ve dihedral açılar kullanılır ve sınırlar ya sabit bir mesafe ya da bir yüzde olarak tanımlanır. Varsayılan sınırlar C için ±%10'durα mesafeler veya ±10° dihedral açı sınırları için. Esnek bir şablon için sınırlar, tasarıma girdi olarak verilen tüm şablon yapılarında görülen maksimum ve minimum değerlerden elde edilebilir. Her dizi için başlangıç sınırları tanımlandıktan sonra, CYANA 2.1 kullanılarak yüzlerce konformer içeren ansambllar oluşturulur.48,49Konformerler, proteini hızla ısıtan ve ardından yavaşça soğutarak örneklenen konformasyonları takip eden, CYANA'daki bir torsiyon açısı dinamiği simüle edilmiş tavlama protokolü kullanılarak üretilir. Simüle edilmiş tavlama işleminden sonra, Van der Waals yarıçaplarının örtüşmesinden kaynaklanan çakışmaların yanı sıra mesafe ve açı kısıtlamalarındaki ihlalleri minimize eden bir yerel enerji minimizasyonu gerçekleştirilir. Varsayılan olarak 500 nihai yapı üretilir. Her dizi için topluluktaki her bir yapı, TINKER 3.6'da bir yerel minimizasyona tabi tutulur,50 AMBER kuvvet alanı kullanılarak.51 Minimize edilmiş her bir yapının final potansiyel enerjisi tablo haline getirilir. Bu genel yaklaşım, hem başlangıç sekansı hem de her bir aday mutant sekans için uygulanır. Ardından, her bir mutant sekansın hedef katlanmaya olan Katlanma Spesifikliği, doğal sekansa göre aşağıdaki Boltzmann dağılımı (Denk. 4) kullanılarak hesaplanabilir.

Doğal ve yeni durumlar için statik denge denklemi Σ(e^(-βEi)); matematiksel formül.
Yaklaşık Bağlanma Afinitesi: Yaklaşık bağlanma afinitesi hesaplama yöntemi, bir hedef proteinle kompleks halindeki tasarlanmış dizileri sıralamak için kullanılır. Bu hesaplamalar, doğrudan Birinci Aşamadan gelen diziler üzerinde yapılabileceği gibi, katlanma spesifikliği adımından elde edilen yüksek katlanma spesifikliğine sahip diziler üzerinde de gerçekleştirilebilir.

Lilien et al.52, protein-ligand komplekslerinin yaklaşık bağlanma afinitelerinin hesaplanması için bir yaklaşım önermişlerdir. Bu yaklaşım; protein, ligand ve protein-ligand kompleksi için rotamer tabanlı toplulukların oluşturulmasına ve bu toplulukların bölüşüm fonksiyonlarını hesaplamak için kullanılmasına dayanmaktadır. Bu yaklaşık bağlanma afinitesi K* ile gösterilmekte ve Denklem 5 ile tanımlanmaktadır.

Burada qPL protein-ligand kompleksinin bölüşüm fonksiyonu, qb serbest proteinin bölüşüm fonksiyonu ve qL ise serbest ligandın bölüşüm fonksiyonudur. Bölüşüm fonksiyonları, B, F ve L kümelerinin sırasıyla bağlanmış protein-ligand kompleksinin, serbest proteinin ve serbest ligandın rotamer tabanlı konformasyonlarını içerdiği Denklem 6'da tanımlanmıştır. En n konformasyonunun enerjisi, R gaz sabiti ve T sıcaklıktır.

Thermodynamic equilibrium equations; Σe^(-Eb/RT); scientific formula for internal energy.
Yapı Tahmini: Hesaplamalara başlamak için K* her bir dizinin 3B yapısına ihtiyaç duyulur. Bu işlem Rosetta AbRelax fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirilir,53-55 Rosetta 3.4 yazılım paketinin bir parçasıdır. AbRelax algoritmasının temelindeki strateji, proteinin yerel yapısının, proteinin yerel dizisinden etkilendiği ancak yalnızca bu dizi tarafından belirlenmediği yönündeki deneysel gözleme dayanmaktadır. Yerel protein yapılarını, diziden türetilen yapısal fragmanlarla değiştirmek için bir Monte Carlo algoritması kullanılır. Bu yöntem; gömülü hidrofobik kalıntılar, eşleşmiş β kıvrımları ve spesifik yan zincir etkileşimleri gibi yerel olmayan etkileşimleri hesaba katan nihai kompakt protein yapılarını üretir.

Kümeleme: AbRelax'tan elde edilen yapılar daha sonra OREO kullanılarak φ ve ψ açılarına göre kümelenir.56,57 Bu kümeleme yöntemi, tüm yapısal topluluğun temsilci omurga yapılarını aydınlatır. En büyük on kümeden elde edilen ortalama yapılar ve genel olarak en düşük enerjili yapı, hedef proteine kenetlenme (docking) için seçilir. Bu işlem, her peptit dizisi için 11 benzersiz omurga yapısı sağlayarak, omurga esnekliğini topluluk oluşturma sürecine dahil eder.

Kenetlenme Öngörüsü: Kenetlenme öngörüsü RosettaDock kullanılarak yapılır.58-60 Her bir dizi için, 11 peptit omurga yapısının her biri hedef proteine karşı kenetlenir. Bu durumda, bağlanma bölgesi bilindiği için peptitler bağlanma bölgesinin yakınına yerleştirilir ve bağlanma bölgesine dik olarak 3 Å, bağlanma bölgesine paralel olarak 8 Å öteleme yapmalarına ve 8° dönmelerine izin verilir. RosettaDock, düşük ve yüksek çözünürlüklü kenetlenme hareketleri için bir Monte Carlo algoritması kullanır. Her bir kenetlenme çalışması, kompleks yapılardan oluşan geniş bir topluluk oluşturur. 11 çalışmanın her birindeki en düşük enerjili on kompleks, rotamer tabanlı nihai konformasyon topluluğu oluşturma aşamasında başlangıç yapıları olarak kullanılır (dizi başına 110 başlangıç yapısı).

Final Ensemble Oluşturma: RosettaDesign61, fixbb fonksiyonu aracılığıyla yalnızca yan zincirlerdeki rotamerleri ayarlayarak bir dizi yapı üretebildiği için rotamer tabanlı nihai konformasyon ensemble'ını oluşturmak amacıyla kullanılır. RosettaDesign'a bir dizi başlangıç yapısı verilir ve her yapı için rastgele bir kalıntı seçilerek rotamer bir Monte Carlo algoritması aracılığıyla değiştirilir. Bu işlem, binlerce rotamer değişimi denenene kadar tekrarlanır ve bölüşüm fonksiyonuna yüksek katkı sağlayacak nihai düşük enerjili bir konformasyon verir.

Peptit topluluğunu oluşturmak için, en büyük on kümenin her birinden en düşük enerjili on peptit yapısı ve ayrıca genel olarak en düşük enerjili on peptit yapısı, RosettaDesign için başlangıç yapıları olarak kullanılır (toplam 110 başlangıç yapısı). Her bir başlangıç yapı için 200 rotamer konformeri oluşturulur ve bu da toplamda 22.000 yapıdan oluşan nihai bir topluluk sağlar ( Denklem 6'daki L kümesi). Topluluk, hem omurga esnekliğini hem de rotamer esnekliğini kapsamaktadır.

Kompleks topluluğu, kenetlenme tahmin adımından elde edilen 110 başlangıç yapısının alınması ve başlangıç yapısı başına 200 rotamer konformeri üretilmesiyle benzer şekilde oluşturulur. Nihai topluluk boyutu 22.000 yapıdır (Denklem 6'daki B kümesi). Esneklik; kullanılan çeşitli peptit omurga yapıları, çeşitli kenetlenmiş konformasyonlar ve her başlangıç yapısı için rotamer konformerleri aracılığıyla dikkate alınır.

Protein topluluğu, RosettaDesign'ın yalnızca hedef protein yapısı üzerinde çalıştırılmasıyla oluşturulur. Bu durumda, tek bir başlangıç yapı için 2.000 rotamer konformasyonu üretilir, böylece nihai topluluk boyutu 2.000 yapı olur (Denklem 6'daki F değeri).

Protein WISDOM

Protein Workbench for In Silico De novo design Of bioMolecules anlamına gelen Protein WISDOM, akademik topluluğun de novo protein tasarım çerçevemize kullanıcı dostu bir şekilde erişmesini sağlayan çevrimiçi bir araçtır. Tek bir protein zincirinin bir şablon katlanmayı benimseyecek şekilde tasarlanmasından, bir hedef proteine bağlanacak yeni peptitlerin tasarlanmasına kadar yaygın olarak karşılaşılan çeşitli tasarım hedeflerini yönetebilir. Sonraki iki bölüm, Protein WISDOM'un karşılaşılan iki ana protein tasarım problemi türüyle ilgili yeteneklerini açıklamaktadır. İlk tür, verilen tasarım şablonunda elverişli olan yeni dizileri seçmek için dizi seçimini uygular ve ardından yeni dizileri doğrulamak için katlanma özgüllüğünü kullanır. İkinci tür, bir kompleks içinde bağlı bir peptidin yeni dizilerini seçmek için dizi seçimini kullanır ve ardından yeni dizileri doğrulamak için hem katlanma özgüllüğünü hem de yaklaşık bağlanma afinitesi hesaplamalarını kullanır.

Kullanıcı Kaydı

http://www.proteinwisdom.org adresindeki Protein WISDOM web sayfasını ziyaret edin.

Sayfanın sağ üst köşesindeki Kullanıcı Girişi düğmesine tıklayın. Kaydolmak için "Buraya tıklayın" ifadesine tıklayın.

E-posta adresi ve talep edilen kullanıcı adı ile ilgili bilgileri doldurun ve devam et'e tıklayın.

İsim, kurum, grup ve adres gibi ek bilgileri doldurun. Kullanım koşullarını kabul etmek için onay kutusuna tıklayın. "Kaydı Gönder" düğmesine tıklayın.

Birinci Aşama: Sekans Seçimi

Protein Dizisinin ve Şablon Yapı(lar)ın Gönderilmesi

Protein tasarım deneyine başlamak için Kullanıcı Girişi düğmesine tıklayın. Kullanıcıya; gönderdikleri işlerin sayısının, yükledikleri yapıların (şablonların) sayısının ve şimdiye kadar yükledikleri yapıların bir listesinin yer aldığı "Kullanıcı Ana Sayfası" (Şekil 3) sunulur.

"Create New Job" seçeneğine tıklayarak yeni bir tasarım işi başlatın. Kullanıcı "Job Submission" sayfasına yönlendirilir (Şekil 4). İşe bir isim verin ve işin önceki bir işe dayalı olup olmadığını belirtin (yani aynı tasarım şablonu, mutasyon setleri ve biyolojik kısıtlamalar yeni bir işe aktarılabilir; ancak kullanıcı, mutasyon setlerini ve biyolojik kısıtlamaları değiştirme imkanına sahip olacaktır). "Continue" düğmesine tıklayın.

Tasarım şablonunun protein yapılarını yükleyin (Şekil 5). Bu şablon, standart protein veri bankası (PDB) formatında olmalıdır. Şablon, rijit bir şablon (her atom için tek bir koordinat seti) veya esnek bir şablon (NMR çözelti yapılarıyla elde edilenler gibi çoklu modeller) olabilir. Tek bir protein tasarlanması durumunda, şablonda yalnızca bir zincir bulunabilir. Kullanıcı yeni bir şablon yükleyebilir veya daha önce yüklemiş olduğu mevcut şablonlar arasından seçim yapabilir. Varsa, şablonun pdb ID'sini isteğe bağlı olarak belirtin. Birden fazla şablon yüklendiğinde, her modelin "MODEL #" ile başladığından ve "ENDMDL" ile bittiğinden emin olun. Her kalıntının doğal bir amino asit ile tanımlandığından emin olun. "Continue" (Devam Et) butonuna tıklayın.

Şablon başarıyla yüklendikten sonra, Protein WISDOM şablonda bulduğu kalıntı, zincir ve model sayısını görüntüleyecek, diziyi listeleyecek ve kullanıcıdan şablonu doğrulamasını isteyecektir. Şablon yapısı doğru şekilde girilmişse onaylayın ve "Continue" butonuna tıklayın.

Şablon başarıyla yüklendikten ve onaylandıktan sonra kullanıcı "Ana Kontrol Sayfası"na (Şekil 6) yönlendirilir. Bu sayfada kullanıcı iş durumunu görüntüleyebilir, mutasyon setlerini ve biyolojik kısıtlamaları değiştirebilir ve işi Birinci Aşama: Sekans Seçimi için gönderebilir. Bu noktada, Birinci Aşama tamamlanmadığı için İkinci Aşama'ya yönelik seçenekler bulunmamaktadır. Bunlar, Birinci Aşama'dan gelen sonuçlar mevcut olduğunda görünür.

Mutasyon Setlerinin Seçimi

Mutasyon setlerini tanımlamak için "Ana Kontrol Sayfası"ndaki "Mutasyon Setleri" bağlantısına tıklayın.

Hangi kalıntıların mutasyona uğramasına izin verileceğini ve bu kalıntıların hangi amino asitlere dönüşebileceğini seçin (Şekil 7). Varsayılan olarak, herhangi bir konumdaki izin verilen amino asitler, Solvent Erişilebilir Yüzey Alanı'na (SASA) göre seçilir. Mutasyon setleri gereklidir.

Mutasyon setleri seçildikten sonra "Save Changes" butonuna tıklayın. Kullanıcı, mutasyon setini düzenlemeye devam etmeyi seçebilir. Mutasyon setini düzenleme işlemi tamamlandığında, "Main Control Page" sayfasına geri dönmek için tıklayın.

Biyolojik Kısıtlamaların Seçimi

Biyolojik kısıtlamaları tanımlamak için "Ana Kontrol Sayfası"ndaki "Biyolojik Kısıtlamalar" bağlantısına tıklayın.

Proteinin tamamı veya bir kısmı için yük veya amino asit içeriği kısıtlamalarını belirtin (Şekil 8).

Gerekliyse, gerçekleşmesine izin verilen toplam mutasyon sayısını sınırlandırın. Biyolojik kısıtlamalar isteğe bağlıdır. İşlem tamamlandığında "Ana Kontrol Sayfası"na dönmek için tıklayın.

Birinci Aşamanın Teslimi: Sekans Seçimi

Kullanıcıyı "Aşama 1'i Gönder" sayfasına yönlendirmek için "Aşama 1'i Başlat" bağlantısına tıklayın.

Tasarlanacak zinciri (Şekil 9), oluşturulacak sekans sayısını, uzaklığa bağlı kuvvet alanını ve modeli seçin. Eğer bir kompleks tasarlanıyorsa ve Katlanma Özgüllüğü (Fold Specificity) hesaplaması isteniyorsa, tasarlanmak üzere yalnızca tek bir zincir seçilmelidir. Yüklenen şablon tek bir yapı veya "rijit bir şablon" ise, yalnızca Tek Yapı (Single Structure) modeline izin verilir. Yüklenen şablon esnekse, kullanıcı üç model arasından seçim yapabilir: Tek Yapı (Single Structure), Ağırlıklı Ortalama (Weighted Average) ve Mesafe Kutusu (Distance Bin). Çözülecek optimizasyonun hesaplama karmaşıklığına dikkat edin. İzin verilen hesaplama karmaşıklığı için üst sınır 2025'tir.

İşi gönderin. Kullanıcı tekrar "Ana Kontrol Sayfasına" yönlendirilir (Şekil 10). İş Durumu, işin mevcut ilerlemesini gösterecek şekilde güncellenecektir. İş, gönderildikten sonra düzenleme için kilitlenecektir.

İşlem tamamlandığında, kullanıcıya tasarlanan dizilerin bir listesini içeren sonuçların gönderildiği bir e-posta ulaşır. Sonuçlar aynı zamanda "Ana Kontrol Sayfası" üzerinden de görüntülenebilir. Kullanıcının bu doğrulamayı gerçekleştirmesine olanak sağlamak için sayfada Aşama 2: Katlanma Özgüllüğü için bir kutucuk belirir.

İkinci Aşama: Kat Kat Özgünlük Hesaplamaları

Katlanma Özgüllüğü Gönderimi

"Build Stage 2" sayfasına girmek için "Begin Stage 2: Fold Specificity"e tıklayın. Şablon esneklik faktörünü, mesafe yüzdesi veya sabit bir mesafe olarak belirleyerek üst ve alt Cα-Cα mesafe sınırlarını tanımlayın. Şablon esneklik faktörünü bir yüzde olarak belirleyerek φ ve ψ dihedral açıları üzerindeki üst ve alt açı sınırlarını tanımlayın. Esnek bir şablon kullanıldığında, üst ve alt mesafe sınırlarının tüm şablon modellerindeki en düşük ve en yüksek mesafe değerleri olarak alındığını unutmayın. Benzer şekilde, üst ve alt açı sınırları tüm modellerdeki en yüksek ve en düşük açı değerlerinden alınır.

"Gönder" butonuna tıklayın.

Dizilim başına oluşturulacak yapı sayısını belirtin ve "Devam Et"e tıklayın. Dizilim başına oluşturulabilecek yapıların üst sınırının 500 olduğunu unutmayın.

Katlanma doğrulaması için gönderim niyetini onaylamak adına "Devam Et"e tıklayın. Birinci Aşama ve İkinci Aşama, İkinci Aşama tamamlanana kadar düzenlemeye kapatılmıştır.

İşlem tamamlandığında, sonuçlar kullanıcıya e-posta ile gönderilir. Sonuçları Protein WISDOM'daki "Main Control Page" (Ana Kontrol Sayfası) üzerinden görüntüleyin (Şekil 11). Burada, tasarlanan dizileri içeren metin dosyaları ile birinci aşamadan gelen ilgili enerji değerleri ve ikinci aşamadan gelen katlanma özgüllük değerleri görüntülenebilir ve indirilebilir. Ayrıca kullanıcı, tarayıcıda birinci aşama sıralamaları ve enerji değerlerinin yanı sıra ikinci aşama sıralamaları ve katlanma özgüllük değerlerini içeren bir tabloyu görüntüleyen "View Results" (Sonuçları Görüntüle) bağlantısına tıklayabilir.

Üçüncü Aşama: Protein-peptit Kompleksleri için Yaklaşık Bağlanma Afinitesi Hesaplamaları

Yaklaşık Bağlanma Afinitesi hesaplamaları, tasarlanan ligand proteinin/peptidin kompleksin geri kalanıyla olan afinitesini hesaplar. Bu hesaplamalar doğrudan Birinci Aşama'dan sonra veya Katlanma Spesifikliği hesaplamaları tamamlandıktan sonra gerçekleştirilebilir.

Yaklaşık bağlanma afinitesi hesaplamasına başlamak için "Sequence #" seçeneğine tıklayın. Kullanıcı, tasarlanan dizilerin listesinin yanı sıra dizi seçim ve katlanma özgüllüğü sıralamalarının sunulduğu "Select Sequence" sayfasına yönlendirilecektir. Hesaplamalar işlemsel olarak çok yoğun olduğundan, yaklaşık bağlanma afinitesi hesaplaması için aynı anda yalnızca bir dizi seçilebilir. Bir dizinin işlemi tamamlandığında, kullanıcı yaklaşık bağlanma afinitesinin hesaplanması için başka bir dizi seçebilir ve bu sonuç önceki sonuca eklenerek tamamlanan tüm dizilerin yaklaşık bağlanma afinitesi görüntülenir. Bir dizi seçilip kaydedildikten sonra, kullanıcı "Main Control Page" sayfasına yönlendirilir.

İşi göndermek için "Begin Stage 2: Approximate Binding Affinity" seçeneğine tıklayın. İşlem tamamlandığında, sonuçlar; dizilim numarasını, yaklaşık bağlanma afinitesini ve Denklem 6'daki bölünme fonksiyonu değerlerini içeren bir ekle birlikte kullanıcıya e-posta ile gönderilir. Sonraki her yaklaşık bağlanma afinitesi işi için bu dosya, tamamlanan tüm dizilimlerin sonuçlarını içerir. Tam sonuçlar (dizilim seçiminden, katlanma spesifisitesine ve yaklaşık bağlanma afinitesine kadar) işin "Main Control Page" sayfasına erişilerek de görüntülenebilir (Şekil 12).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

De Novo HIV-1 Giriş İnhibitörlerinin Tasarımı

Protein WISDOM'da uygulanan de novo tasarım çerçevesi, birkaç önemli terapötik sistem için inhibitör peptidlerin tasarımında kullanılmıştır (Tablo 1 ve 2). Dikkat çeken sistemlerden biri, HIV-1'in konak hücre reseptörü CD4'e girişini inhibe eden peptidlerin tasarımıdır ve bu sistem, Protein WISDOM arayüzünün pratik kullanımını göstermek için burada temsili bir sistem olarak kullanılmıştır. Peptidler, HIV-1'in konak T...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

De novo protein tasarım çerçevesi, bir dizi seçim aşaması ve bir doğrulama aşaması olmak üzere iki aşamadan oluşur. Çerçeve, katı ve esnek tasarım şablonlarını işleyecek kadar sağlamdır ve tek protein tasarımına veya karmaşık protein tasarımına uygulanabilir. Çerçeve, düzinelerce hastalığa uygulanan çok sayıda protein sistemine başarıyla uygulanmıştır. Bugüne kadar keşfedilen bazı proteinlerin en güçlü inhibitörlerini veya agonistlerini sağlayan bir dizi tasarım deneysel olarak doğrulanmıştır. Bu çerçeve artık P...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

CAF, NSF, NIH (R01 GM52032; R24 GM069 736) ve ABD Çevre Koruma Ajansı, EPA (R 832721-010). Bu araştırmanın bir kısmı, Savunma Bakanlığı, Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi tarafından Hükümet desteği ile mümkün olmuştur. JS, NIH'den (P50GM071508-06) gelen desteği minnetle kabul eder. MLBP, Ulusal Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans (NDSEG) Bursu, 32 CFR 168a'nın desteğini minnetle kabul eder. GAK, DGE-1148900 hibe numarası altında Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu'nun desteğini minnetle kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Kaynaklar

  1. Drexler, K. Molecular engineering: An approach to the development of general capabilities for molecular manipulation. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 78, 5275-5278 (1981).
  2. Pabo, C. Molecular technology: Designing proteins and peptides. Nature. 301, 200(1983).
  3. Floudas, C. A. Research challenges, opportunities and synergism in systems engineering and computational biology. AIChE J. 51, 1872-1884 (2005).
  4. Fung, H. K., Welsh, W. J., Floudas, C. A. Computational de novo peptide and protein design: Rigid templates versus flexible templates. Ind. Eng. Chem. Res. 47, 993-1001 (2008).
  5. Ponder, J., Richards, F. Tertiary templates for proteins. J. Mol. Biol. 193, 775-791 (1987).
  6. Dahiyat, B. I., Mayo, S. L. Protein design automation. Protein Sci. 5, 895-903 (1996).
  7. Dahiyat, B. I., Gordon, D. B., Mayo, S. L. Automated design of the surface positions of protein helices. Protein Sci. 6, 1333-1337 (1997).
  8. Su, A., Mayo, S. L. Coupling backbone flexibility and amino acid sequence selection in protein design. Protein Sci. 6, 1701-1707 (1997).
  9. Desjarlais, J., Handel, T. Side chain and backbone flexibility in protein core design. J. Mol. Biol. 290, 305-318 (1999).
  10. Farinas, E., Regan, L. The de novo design of a rubredoxin-like Fe site. Protein Sci. 7, 1939-1946 (1998).
  11. Harbury, P. B., Plecs, J. J., Tidor, B., Alber, T., Kim, P. S. High-resolution protein design with backbone freedom. Science. 282, 1462-1467 (1998).
  12. Koehl, P., Levitt, M. De novo protein design: I. In search of stability and specificity. J. Mol. Biol. 293, 1161-1181 (1999).
  13. Koehl, P., Levitt, M. De novo protein design. II. Plasticity in sequence space. J. Mol. Biol. 293, 1183-1193 (1999).
  14. Kuhlman, B., Dantae, G., Ireton, G., Verani, G., Stoddard, B., Baker, D. Design of a novel globular protein fold with atomic-level accuracy. Science. 302, 1364-1368 (2003).
  15. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Integrated structural, computational and experimental approach for lead optimization: Design of compstatin variants with improved activity. J. Am. Chem. Soc. 125, 8422-8423 (2003).
  16. Klepeis, J. L., Floudas, C. A., Morikis, D., Tsokos, C. G., Lambris, J. D. Design of peptide analogs with improved activity using a novel de novo protein design approach. Ind. Eng. Chem. Res. 43, 3817-3826 (2004).
  17. Fung, H. K., Floudas, C. A., Taylor, M. S., Zhang, L., Morikis, D. Toward full-sequence de novo protein design with flexible templates for human beta-defensin-2. Biophys. J. 94, 584-599 (2008).
  18. Bellows, M. L., Fung, H. K., Floudas, C. A., López de Victoria, A., Morikis, D. New compstatin variants through two de novo protein design frameworks. Biophys. J. 98, 2337-2346 (2010).
  19. López de Victoria, A., Gorham, R. D. Jr A new generation of potent complement inhibitors of the compstatin family. Chem. Biol. Drug Des. 77, 431-440 (2011).
  20. Tamamis, P., López de Victoria, A. Molecular dynamics in drug design: New generations of compstatin analogs. Chem. Biol. Drug Des. 79, 703-718 (2012).
  21. Bellows-Peterson, M. L., Fung, H. K. De novo peptide design with c3a receptor agonist and antagonist activities: Theoretical predictions and experimental validation. J. Med. Chem. 55, 4159-4168 (2012).
  22. Bellows, M. L., Taylor, M. S. Discovery of entry inhibitors for HIV-1 via a new de novo protein design framework. Biophys. J. 99, 3445-3453 (2010).
  23. Sun, J. -J., Abdeljabbar, D. M., Clarke, N. L., Bellows, M. L., Floudas, C. A., Link, A. J. Reconstitution and engineering of apoptotic protein interactions on the bacterial cell surface. J. Mol. Biol. 394, 297-305 (2009).
  24. Smadbeck, J., Bellows-Peterson, M. L. De novo protein design and validation of histone methyltranferase inhibitors. , In Preparation (2013).
  25. Bellows, M. L., Fung, H. K., Floudas, C. A. Molecular Systems Engineering, Process Systems Engineering. Adjiman, C. S., Galindo, A. 6, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 207-232 (2010).
  26. Rajgaria, R., McAllister, S. R., Floudas, C. A. A novel high resolution Cα-Cα distance dependent force field based on a high quality decoy set. Proteins. 65, 726-741 (2006).
  27. Rajgaria, R., McAllister, S. R., Floudas, C. A. Distance dependent centroid to centroid force fields using high resolution decoys. Proteins. 70, 950-970 (2008).
  28. Fung, H. K., Taylor, M. S., Floudas, C. A. Novel formulations for the sequence selection problem in de novo protein design with flexible templates. Optim. Method. Softw. 22, 51-71 (2007).
  29. Fung, H. K., Rao, S., Floudas, C. A., Prokopyev, O., Pardalos, P. M., Rendl, F. Computational comparison studies of quadratic assignment like formulations for the in silico sequence selection problem in de novo protein design. J. Comb. Optim. 10, 41-60 (2005).
  30. CPLEX. Using the CPLEX Callable Library. , ILOG, Inc. (1997).
  31. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Free energy calculations for peptides via deterministic global optimization. J. Chem. Phys. 110, 7491-7512 (1999).
  32. Klepeis, J. L., Floudas, C. A., Morikis, D., Lambris, J. D. Predicting peptide structures using NMR data and deterministic global optimization. J. Comput. Chem. 20, 1354-1370 (1999).
  33. Klepeis, J. L., Schafroth, H. D., Westerberg, K. M., Floudas, C. A. Deterministic global optimization and ab initio approaches for the structure prediction of polypeptides, dynamics of protein folding and protein-protein interactions. Adv. Chem. Phys. 120, 265-457 (2002).
  34. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Ab initio prediction of helical segments of polypeptides. J. Comput. Chem. 23, 246-266 (2002).
  35. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. Prediction of beta-sheet topology and disulfide bridges in polypeptides. J. Comput. Chem. 24, 191-208 (2003).
  36. Klepeis, J. L., Floudas, C. A. ASTRO-FOLD: A combinatorial and global optimization framework for ab initio prediction of three-dimensional structures of proteins from the amino acid sequence. Biophys. J. 85, 2119-2146 (2003).
  37. Klepeis, J. L., Pieja, M. T., Floudas, C. A. A new class of hybrid global optimization algorithms for peptide structure prediction: Integrated hybrids. Comput. Phys. Commun. 151, 121-140 (2003).
  38. Klepeis, J., Pieja, M., Floudas, C. Hybrid global optimization algorithms for protein structure prediction : Alternating hybrids. Biophys. J. 84, 869-882 (2003).
  39. Klepeis, J. L., Floudas, C. Analysis and prediction of loop segments in protein structures. Comput. Chem. Eng. 29, 423-436 (2005).
  40. Mo¨nnigmann, M., Floudas, C. Protein loop structure prediction with flexible stem geometries. Proteins. 61, 748-762 (2005).
  41. McAllister, S. R., Mickus, B. E., Klepeis, J. L., Floudas, C. A. A novel approach for alpha-helical topology prediction in globular proteins: Generation of interhelical restraints. Proteins. 65, 930-952 (2006).
  42. Floudas, C. A., Fung, H. K., McAllister, S. R., Mönnigmann, M., Rajgaria, R. Advances in protein structure prediction and de novo protein design: A review. Chem. Eng. Sci. 61, 966-988 (2006).
  43. Subramani, A., Wei, Y., Floudas, C. A. ASTRO-FOLD 2.0: An enhanced framework for protein structure prediction. AIChE J. 58, 1619-1637 (2012).
  44. Wei, Y., Thompson, J., Floudas, C. Concord: a consensus method for protein secondary structure prediction via mixed integer linear optimization. P. Roy. Soc. A-Math. Phy. 468, 831-850 (2011).
  45. Subramani, A., Floudas, C. β-sheet topology prediction with high precision and recall for β and mixed α/β proteins. PLoS One. 7, e32461(2012).
  46. Rajgaria, R., Wei, Y., Floudas, C. A. Contact prediction for beta and alpha-beta proteins using integer linear optimization and its impact on the first principles 3D structure prediction method ASTRO-FOLD. Proteins. 78, 1825-1846 (2010).
  47. Subramani, A., Floudas, C. A. Structure prediction of loops with fixed and flexible stems. J. Phys. Chem. B. 116, 6670-6682 (2012).
  48. Güntert, P., Mumenthaler, C., Wüthrich, K. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA. J. Mol. Biol. 273, 283-298 (1997).
  49. Güntert, P. Automated NMR structure calculation with CYANA. Methods Mol. Biol. 278, 353-378 (2004).
  50. Ponder, J. TINKER, software tools for molecular design. , Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine. Louis, MO. (1998).
  51. Cornell, W. D., Cieplak, P. A 2nd generation forcefield for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules. J. Am. Chem. Soc. 117, 5179-5197 (1995).
  52. Lilien, R. H., Stevens, B. W., Anderson, A. C., Donald, B. R. A novel ensemble-based scoring and search algorithm for protein redesign and its application to modify the substrate specificity of the gramicidin synthetase a phenylalanine adenylation enzyme. J. Comput. Biol. 12, 740-761 (2005).
  53. Lee, M. R., Baker, D., Kollman, P. A. 2.1 and 1.8 A°Cα RMSD structure predictions on two small proteins, HP-36 and S15. J. Am. Chem. Soc. 123, 1040-1046 (2001).
  54. Rohl, C. A., Baker, D. De novo determination of protein backbone structure from residual dipolar couplings using rosetta. J. Am. Chem. Soc. 124, 2723-2729 (2002).
  55. Rohl, C. A., Strauss, C. E. M., Misura, K. M. S., Baker, D. Protein structure prediction using rosetta. Methods Enzymol. 383, 66-93 (2004).
  56. DiMaggio, P. A., McAllister, S. R., Floudas, C. A., Feng, X. J., Rabinowitz, J. D., Rabitz, H. A. Biclustering via optimal re-ordering of data matrices in systems biology: Rigorous methods and comparative studies. BMC Bioinformatics. 9 (458), (2008).
  57. DiMaggio, P. A., McAllister, S. R., Floudas, C. A., Feng, X. J., Rabinowitz, J. D., Rabitz, H. A. A network flow model for biclustering via optimal re-ordering of data matrices. J Global Optimization. 47, 343-354 (2010).
  58. Daily, M. D., Masica, D., Sivasubramanian, A., Somarouthu, S., Gray, J. J. CAPRI rounds 3-5 reveal promising successes and future challenges for RosettaDock. Proteins. 60, 181-186 (2005).
  59. Gray, J. J., Moughon, S., et al. Protein-protein docking with simultaneous optimization of rigid-body displacement and side-chain conformations. J. Mol. Biol. 331, 281-299 (2003).
  60. Gray, J. J., Moughon, S. E., et al. Protein-protein docking predictions for the CAPRI experiment. Proteins. 52, 118-122 (2003).
  61. Kuhlman, B., Baker, D. Native protein sequences are close to optimal for their structures. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 97, 10383-10388 (2000).
  62. Jmol: an open-source java viewer for chemical structures in 3d. , Available from: http://www.jmol.org (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein Tasar mBilgisayar Destekli Protein Tasar mSekans Se imiKatlanma zg nlBa lanma Afinitesiablon G nderimiMutasyon SetleriBiyolojik K s tlamalar
Protein AKIL: A Tezgahı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.