$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1.. İnsan NPC genişleme (Şekil 1)
- Dondurulmuş fetal beyin (Lonza, Walkersville, MD, USA) ve proliferasyon takviyeleri, EGF (10 ng / ml) ihtiva eden bir ortam içinde neurobasal neurospheres (Şekil 1A) gibi T-75 şişelerinde süspansiyon kültür bunları insan NPC'nin stok ve canlandırmak FGF (10 ng / ml).
- Kültür içinde 3 gün sonra, 5 dakika boyunca 500 rpm'de bir 15 ml tüp ve santrifüj neurospheres aktarın.
- Hücre peleti ~ 100 | il yukarıda orta geride bırakarak Süpernatant atılır ve bir Eppendorf tüpüne aktarılır. A 100 ul hücre peleti 2 T-75 şişelerinde bölmek yeterlidir. Neuroprogenitor hücreler ince bölerseniz çoğalırlar başarısız olarak daha az, şişelerin sayısını azaltın.
- Tüpün alt karşı 200 ul ucu tutarken bir 200 ul 50x ucu ile pelet Karışım. Iki eşit parçaya bölün ve hücre süspansiyonu 2 T-75 şişelerinde (1-2 split), sürekli için birine eklemenizfarklılaşması için genişleme ve başka.
- Neurospheres 300-500 mikron orijinal boyutuna ulaşana kadar her 4-5 gün orta değiştirerek genişleme (ilk şişe) için neuroprogenitor hücrelerin kültürü devam etmektedir. (500 rpm, 5 dk) santrifüj ile orta değiştirin, eski orta atmak ve yeni orta ekleyin.
2. Bir Nöron-zengin Kültür içine İnsan NPC Farklılaşma (Şekil 2)
- Bir nöron zengin kültürüne neuroprogenitor hücrelerin farklılaşması, her bir kuyuya 500 ul ilave edilerek poli-L-lisin, 100 ug / ml, 24-çukurlu plaka ve ceket her oyuğuna tek bir lamel yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika için yemekler inkübe edin.
- Poli-L-lisin solüsyonu aspire ve steril su ile plaka yıkayın.
- Daha sonra, kat 5 ug / ml fare laminin 500 ul plakanın kuyuları ve 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS ile kuyu yıkayın.
- 4 gün sonra, splittiHücreleri (adım 1.4) ng, 24 çukurlu levha başına ~ 500 neurospheres yoğunluğunda kaplı kaplar içine 'ayrımı için,' etiketlenmiş şişenin küçük neurospheres aktarın.
- Neurospheres çanak iliştirdiğinizde 6 saat sonra, yayılması orta kaldırmak ve neurobasal orta oluşan farklılaşma orta ekleyin, B27 takviyesi, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), ve retinoik asit (2 uM).
3. Farklılaştırılmış NPC İmmünofloresan boyanması (Şekil 3)
- Iki hafta içinde nöronal farklılaşma ortam içinde neuroprogenitor hücrelerinin kültürü takiben, nöron zengin bir kültür elde edilir. Bir kere PBS içinde nöronları yıkayın ve daha sonra 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde tespit edin. Sabit sonra, hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
- 60 dakika boyunca oda sıcaklığında permeabilizasyon tamponu (% 5 BSA ve PBS içinde% 0.2 Triton X-100) ile hücrelerin inkübe edin.
- 4 ° C i de yemekler O / N inkübena aşağıdaki PBS içinde% 3 BSA içinde poliklonal ve monoklonal antikorların bir kombinasyonu ile çalkalama: neun (1:250) ve synapsin (1:250) asetil kolinesteraz (1:500) ve sinaptofizin (1:250), BDNF (1 : 500) ve GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) ve GFAP (1:1000).
- PBS ile lamelleri üç kez yıkayın ve daha sonra 90 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında anti-tavşan-Cy3 ve anti-fare-FITC sekonder antikor ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PBS ile lamelleri üç kez yıkayın.
- Forseps ile kültürü çanak lamel dışarı almak ve montaj ortamına ters yerleştirin, bir cam slayt üzerine montaj orta 10 ul yerleştirin. Yavaşça, herhangi bir aşırı montaj orta siliyorum ve oje ile kenarları mühür.
- Bir floresan mikroskobunda immunosteyn nöronlar inceleyin.
4. Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (Şekil 4)
- PEN membran slayt üzerinde nöron-zengin kültürüne NPCleri ayırtŞekil 2 için tarif edilen yöntemler kullanılarak poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare var.
- RNAse içermeyen koşullar altında tüm sonraki basamakları gerçekleştirir.
- Hücreleri görselleştirmek için HistoGene Leke (Arcturus) kullanarak kültürleri Leke.
- Veritas LCM sistemi ile tüm slayt yol haritası görüntü kullanılarak astrositlerde yoksun saf nöronal nüfus alanları bulabilirsiniz. Çizim araçlarını kullanarak nöronlar işaretleyin.
- Iki aşamalı bir işlemde, bilgisayar kontrollü hassas ve otomasyon kullanılarak bu alanların lazer yakalama yapın. İlk olarak, IR (Kızıl Ötesi) membran kapağa bağlamak için 70 mW ve 2500 mikro-saniye bir darbenin bir lazer güç ayarına çok yerlerde ateşlenir. Daha sonra, işaretli alanı 10 mV düşük seviyede UV ayarda bir kesme aleti ile eksize edilir.
- Bu süreçlerin kombinasyonu seçici CapSure LCM makro kapaklar üzerine PEN zardan İşaretli alanların yakalar. Kapak kaldırıldığında olduğunda, N ile zareurons kapağa bağlıdır.
- Bir PicoPure RNA izolasyon kiti (Arcturus) kullanarak LCM örneklerinden total RNA izole ve DNase ile tedavi.
- Kiti talimatları izleyerek RiboAMP RNA amplifikasyon kiti kullanılarak izole RNA yükseltin.
- İnsan nörofilaman ağır zinciri (hNFHc) algılamak için TaqMan problar kullanılarak gerçek zamanlı RT-PCR analizi yapın.
Kısaltmalar:
AD, Alzheimer hastalığı, BDNF, beyin türevli nörotrofik faktör, CREB, siklik AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein; DBC, dibutiril siklik AMP, EGF, epidermal büyüme faktörü; FGF, fibroblast büyüme faktörü; GFAP, gliyal fibriler asidik protein, LCM, lazer mikrodiseksiyon yakalama, NGF, sinir büyüme faktörü, NPC, neuroprogenitor hücre, PEN, polietilen naftalat.