Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Summary

İnsan neuroprogenitor hücreleri (NPC) çoğalan koşullar altında genişletilmiştir. NPC nörotrofinlerin bir kombinasyonunun mevcudiyetinde nöron zengin kültürler içine ayırt edildi. Nöronal belirteçler immunofloresan boyama ile tespit edilmiştir. Nöron saf bir popülasyonu izole etmek için, NPC PEN membran slaytlar üzerinde farklılaştırılmış ve lazer yakalama mikrodiseksiyon uygulandı.

Abstract

Insan fetal beyninden izole Neuroprogenitor hücreleri (NPC) epidermal büyüme faktörü (EGF) ve hücrelerin bol kaynağı sağlamak için fibroblast büyüme faktörü (FGF) mevcudiyetinde çoğalma koşulları altında genişletilmiştir. NPC sinir büyüme faktörü (NGF), yeni bir kombinasyonunun mevcudiyetinde ayırt edildi, beyin-türevi nörotrofik faktör (BDNF), dibutiril cAMP (DBC) ve poli-L-lisin ve laminin ile kaplanmış fare yemekler retinoik asit nöron elde edilmesi için zengin kültürleri. NPC da nörotrofinlerin olmaması, DBC ve retinoik asit ve astrosit zengin kültürler elde etmek için, siliar nörotropik faktör (CNTF) mevcudiyetinde ayırt edildi. Farklılaştırılmış NPC Neun, synapsin, asetilkolinesteraz, sinaptofizin ve GAP43 dahil nöronal belirteçlerin bir panel için immunofloresan boyama ile karakterize edildi. Glial fibriller asidik protein (GFAP) ve STAT3, astrosit belirteçleri, farklı NPC'nin 10-15% olarak tespit edilmiştir. Kolaylaştırmakhücre tipi özel moleküler karakterizasyonu, lazer yakalama mikrodiseksiyon polietilen naftalat (PEN) membran slaytlar üzerinde kültürlenmiş nöronlar izole etmek için yapıldı. Bu çalışmada açıklanan yöntemler nörodejenerasyonun moleküler mekanizması anlayışımızı ilerletmek için değerli bir araç sağlar.

Introduction

Yaşam boyu nöron yan karıncıkların subventricular bölgesinde ve yetişkin memeli beyin ¹ kıvrımlarının subgranular tabakasında meydana geldiği bilinmektedir. Neuroprogenitor hücreler (NPC) bu bölgelerde kaynaklanan nöronları, astrositlerde ve oligodendrositlerin ² farklılaşabildiği multipotent hücrelerdir. NPC nedeniyle, Parkinson hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, felç ve Alzheimer hastalığı (AD) ³ de dahil olmak üzere, çeşitli nörodejeneratif bozukluğu olan hastalarda nakledilen için potansiyel ilgi yarattı. NPC'ler ile çalışmalar genellikle bu nakli açısına odaklanmış ama Nörodejenerasyonun mekanizmasını belirlemek için hüc....

Protocol

1.. İnsan NPC genişleme (Şekil 1)

1. Dondurulmuş fetal beyin (Lonza, Walkersville, MD, USA) ve proliferasyon takviyeleri, EGF (10 ng / ml) ihtiva eden bir ortam içinde neurobasal neurospheres (Şekil 1A) gibi T-75 şişelerinde süspansiyon kültür bunları insan NPC'nin stok ve canlandırmak FGF (10 ng / ml).
2. Kültür içinde 3 gün sonra, 5 dakika boyunca 500 rpm'de bir 15 ml tüp ve santrifüj neurospheres aktarın.
3. Hücre peleti ~ 100 | il yukarıda orta geride bırakarak Süpernatant atılır ve bir Eppendorf tüpüne aktarılır. A 100 ul hücre peleti 2 T-75 şişelerinde bölmek yeterlidir. Neuroprogenitor hücreler in....

Results

NPC genişleme (Şekil 1)

Neurospheres tritürasyon ile tek bir hücre süspansiyonu için ayrılmış zaman, pipet ucu süspansiyon yukarı ve aşağı pipetle bir direnç, böylece tüpün alt dokunun gerekiyor. Öğütülmesinden sayısıdır bireyler ve bir mikroskop altında elde edilen hücre süspansiyonu incelenerek deneme yanılma ile karar verilmesi gereken arasında değişir. NPC yakın temas sırasında proliferasyon, bir daha hızlı olacaktır, çünkü bu hücre süspansiyonunun yeterli yoğunluğu sağlama.......

Discussion

Bu çalışmada, kendi kendini yenileyen insan neuroprogenitor hücrelerin farklılaşması ile nöron-zengin bir hücre kültürü modeli ve lazer yakalama mikro-kesim ile nöronların saf popülasyonu izole etmek için bir yöntem tarif eder. Biz NGF, BDNF, DBC ve NPC nöronal farklılaşma için retinoik asit bir arada kullandık. DBC CREB, nöron ¹² arttıran bir transkripsiyon faktörü aktif hale getirmek için kullanılır. Retinoik asit, hücre döngüsü çıkışına neden ve glial nüfusu ¹³ azaltır. Bu çalışmada açıklanan yö.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nöroprogenitör hücreler (NPC'ler)	Lonza	PT-2599
Nörokült NS-A insan bazal ortamı	Kök hücre teknolojisi	5750
Nörokült NS-A Proliferasyon takviyesi	Kök hücre teknolojisi	5753
Nörokült NS-A Farklılaşma takviyesi	Kök hücre teknolojisi	5754
B-27 Takviyesi (50x)	İnvitrojen	17504-044
İnsan epidermal büyüme faktörü	Kök hücre teknolojisi	2633
Fibroblast büyüme faktörü	Sigma	F0291
Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör	Hücre sinyalizasyonu	3897S
Sinir Büyüme Faktörü	İnvitrojen	13257-019
Dibutiril siklik AMP	Sigma	D-0627
poli-L-lizin	Sigma	P-5899
Fare laminin	Sigma	L-2020
Retinoik asit	Sigma	R-2625
STAT3 antikoru	Hücre sinyali	9132
GFAP antikoru	Hücre sinyali	3670
GAP43 antikoru	İletim laboratuvarları	612262
BDNF antikoru	Millipore	AB1534SP
Asetil kolinesteraz antikoru	Santz cruz	Sc-11409
Sinaptofizin antikoru	Abcam	ab18008-50
NeuN antikoru	Chemicon	MAB377
Sinapsin antikoru	Novus	NB300-104
Anti fare FITC	Jackson İmmüno	115-095-146
	Araştırma Laboratuvarları
Anti Tavşan Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Araştırma Laboratuvarları
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Lamel (Büyük daire kapak kayması)	Fisherbrand	12-545-102
Montaj ortamı (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
Kalem zarı	Uygulanan biyosistemler	LCM0521
Histogene LCM donmuş kesit boyama kiti	Uygulamalı biyosistemler	KIT0401
RiboAmp RNA Amplifikasyon kiti	Uygulamalı biyosistemler	KIT0201
Picopure RNA İzolasyon kiti	Uygulanan biyosistemler	KIT0202
CapsureMacro LCM kapakları	Uygulanan biyosistemler LCM0211