Zayıf-saçılma Konular Dijital Inline Holografik Mikroskop (DIHM)

Summary

Zayıf yaymalı nesnelerin üç boyutlu yerleri benzersiz standart bir mikroskop için küçük bir değişiklik içerir dijital inline holografik mikroskobu (DIHM) kullanılarak tespit edilebilir. Bizim yazılım üç boyutlu pozisyon ve bir mikroskopik faz nesnenin geometrisine vermek üzere Rayleigh-Sommerfeld geri yayılma ile birlikte basit bir görüntüleme buluşsal kullanır.

Abstract

Bu kadar küçük kolloidal parçacıkları ve en biyolojik hücreleri gibi hafif-saçılma nesneler, mikroskopi sıkça karşılaşılmaktadır. Nitekim, çeşitli teknikler daha iyi, bu faz nesneleri görselleştirmek için geliştirilmiştir; faz kontrast ve DIC kontrast arttırmak için en popüler yöntemler arasında bulunmaktadır. Ancak, out-of-görüntüleme-düzlem yönünde kayıt konumu ve şekli zorlu kalır. Bu rapor doğru dijital inline holografik mikroskobu (DIHM) kullanarak, konumu ve üç boyutlu nesnelerin geometrisini belirlemek için basit bir deneysel yöntem sunar. Genel olarak, ulaşılabilir örnek hacmi yanal doğrultuda kamera sensörü boyutu ve eksenel yönde aydınlatma uyum ile tanımlanır. Tipik örnek hacimleri LED aydınlatma kullanılarak 200 um x 200 um x 200 um dan, değişir5 mm x 5 mm x 5 mm veya daha büyük bir lazer ışığın kullanımı. Düzlem dalgalar örnek üzerinde olay böylece bu aydınlatma ışığı yapılandırılır. Numune hacmi nesneler daha sonra aydınlatma yönüne dik girişim desen oluşturulması için unscattered ışık ile etkileşime giren ışığı dağıtır. Bu görüntü (hologram) üç boyutlu rekonstrüksiyon için gerekli derinlik bilgileri içerir, ve böyle bir CMOS veya CCD kamera gibi standart bir görüntüleme cihaz üzerinde yakalanabilir. Rayleigh-Sommerfeld'in geri yayılım yöntemi sayısal mikroskop görüntüleri yönlendirmesi için kullanılır, ve Gouy aşamasında dayalı basit bir görüntüleme sezgisel anomali yeniden hacmi içindeki nesneleri saçılma tanımlamak için kullanılır. Bu basit, ancak güçlü bir yöntem mikroskopik örneklerinde nesnelerin konumu ve şekli, bir açık, model içermeyen ölçümü ile sonuçlanır.

Introduction

Dijital inline holografik mikroskobu (DIHM) yüzme mikroorganizmalar ^1,2 ve standart bir mikroskop kurulum minimal değişiklik ile yumuşak madde sistemleri ^3,4 gibi mikroskobik örneklerin, hızlı üç boyutlu görüntüleme sağlar. Bu yazıda DIHM bir pedagojik gösteri laboratuarımızda geliştirilen yazılım etrafında merkezli sağlanır. Bu kağıt, mikroskop kurmak veri toplama, optimize ve üç-boyutlu veri yeniden kaydedilen görüntüleri işlemek için nasıl bir açıklamasını içerir. Ve örnek görüntüleri (DG Grier ve diğerleri ⁵ tarafından geliştirilen yazılım kısmen dayalı) Yazılım sitemizde serbestçe kullanılabilir. Bir tanımı, mikroskop konfigüre hologramlar üç boyutlu hacimli ve yazılım paketini yeniden uzanan bir serbest ışın kullanarak, ilgi konusu edilen miktarlar işlemek için gerekli olan adımların sağlanmaktadır. Kağıt rekonstrüksiyon kalitesini etkileyen faktörlerin tartışılması ile sona eriyorVe rekabet yöntemleri ile DIHM karşılaştırılması.

DIHM (Kim ^6'ya bakınız, ilkeleri ve gelişimi genel bir inceleme için) bir süre önce tanımlanmış olmasına rağmen, gerekli işlem gücü ve görüntü işleme uzmanlığı, şimdiye kadar büyük ölçüde alet gelişimine odaklanarak uzman araştırma gruplarının kullanımını kısıtladı. Bu durum, bilgisayar ve kamera teknolojisindeki son gelişmeler ışığında değişiyor. Modern masaüstü bilgisayarlar kolayca işleme ve veri depolama gereksinimleri ile başa çıkabilir; CCD veya CMOS kamera çoğu mikroskopi laboratuarlarında mevcut olan ve gerekli yazılım tekniği geliştirerek zaman yatırım grupları tarafından internette serbestçe kullanılabilir yapılıyor.

Çeşitli yöntemler üç boyutlu bir numune hacmi içinde mikroskobik nesnelerin görüntülenmesi için yapılandırma önerilmiştir. Bunların çoğu görüntülerin bir yığın m tarafından kaydedilmiş olduğu, teknikleri ^7,8 taradığınızechanically numune boyunca görüntü düzlemi çeviri. Tarama konfokal floresan mikroskopi belki de en tanıdık örneğidir. Tipik olarak, bir flüoresan boya örnek kontrast kabul edilebilir bir düzeyini elde etmek amacıyla bir faz nesnesine ilave edildi ve konfokal uzaysal düzenleme floresan emisyonu lokalize etmek için kullanılır. Bu yöntem, kalabalık sistemlerinin ^9-11 üç boyutlu dinamikleri erişilmesine izin kolloid bilimi, örneğin önemli gelişmeler, yol açmıştır. Etiketleme kullanımı floresan konfokal mikroskopi ve DIHM arasında önemli bir fark olduğunu, ancak iki teknikleri diğer özellikleri karşılaştırarak değer. DIHM cihaz hiçbir hareketli parça vardır ki önemli bir hız avantajı vardır. Konfokal sistemlerde mekanik tarama aynalar veri toplama hızı üzerinde bir üst sınır koymanız - 512 x 512 piksel görüntü tipik olarak yaklaşık 30 kare / sn. Farklı odak düzlemleri tür görüntülerin bir yığın fiziksel transl elde edilebilir30 çerçeve yığını için saniyede yaklaşık bir hacim son bir yakalama oranı ile önde gelen çerçeveler arasında örnek sahne veya objektif lens ating. Buna karşılık, modern bir CMOS kamera dayalı bir holografik sistem aynı görüntü boyutu ve çözünürlüğü 2,000 kare / sn yakalayabilir, her çerçeve örnek hacmi bağımsız bir anlık vermek `çevrimdışı 'işlenir. Yinelemek için: Sistem bir flüoresan konu ¹² holografik yeniden gerçekleştirir geliştirilmiştir, ancak floresan örnekleri, DIHM için gerekli değildir. Yanı sıra üç-boyutlu ses bilgileri, DIHM da, niceliksel Faz kontrast görüntüleri ¹³ sağlamak için kullanılabilir, ancak burada tartışma kapsamı dışındadır.

Ham DIHM veri görüntüleri iki boyutlu ve bazı bakımlardan odak dışında da olsa, standart mikroskop görüntüleri benziyor. DIHM ve standart aydınlık alan mikroskobu arasındaki temel fark, nesneleri çevreleyen kırınım halkaları yatıyor in görüş alanı, bu aydınlatma doğasına bağlıdır. Genellikle bir LED veya lazer - DIHM parlak alanında daha tutarlı bir kaynak gerektirir. Hologramın in kırılma halkalar, üç boyutlu bir görüntüyü yeniden oluşturmak için gerekli bilgileri içerir. Direkt bağlantı ve sayısal odaklanma; DIHM verileri yorumlama iki temel yaklaşım vardır. İlk yaklaşım önceden ^3,4 in kırınım deseninin matematiksel bir şekilde bilindiği durumlarda geçerli olup, bu durum küreler, silindirler, ve yarı düzlem engeller gibi basit bir nesne küçük bir avuç karşılanmaktadır. Doğrudan bağlantı, aynı zamanda nesnenin eksenel konumu bilindiği durumlarda uygulanabilir ve görüntü görüntü şablonları ¹⁴ bir indeks tablosu kullanılarak monte edilebilir.

İkinci yaklaşım (sayısal odaklanma) çok daha genel ve sayısal optik alanını yeniden iki boyutlu hologram görüntüde kırılma halkaları kullanarak dayanırörnek hacmi boyunca (keyfi aralıklı) odak düzlemleri bir dizi. Birkaç ilgili yöntemler bu ⁶ yapmak için vardır; Lee ve Grier ⁵ tarafından açıklandığı gibi bu iş geri yayılım tekniği Rayleigh-Sommerfeld kullanır. Bu prosedürün sonucu elle mikroskop odak düzlemi (dolayısıyla ismi `sayısal odaklanma ') değişen etkisini çoğaltmak görüntülerin bir yığını. Görüntülerin bir yığın elde edildikten sonra, odak hacmindeki konunun bir pozisyonda olması gerekir. Örneğin yerel yoğunluk varyans veya uzaysal frekans içeriği gibi görüntü analizi sezgisel tarama, bir dizi, numunede ¹⁵ farklı noktalarda odak keskinliğini ölçmek için sunulmuştur. Belirli bir görüntü ekranı metrik (ya da en aza indirilmesi) halinde, her bir durumda, nesne odak olarak kabul edilir.

Bir nesne 'odak' olduğu belirli bir odak düzlemi tespit etmeye, diğer programları aksine, bu çalışmada yöntem p dışarı alırodak düzlemleri geniş bir yelpazesinde uzatabilir ilgi nesnenin içinde yalan oints. Bu yaklaşım, geniş bir konu yelpazesi için geçerlidir ve bu çubuk-şekilli kolloidler, bakteri ya da ökariyotik zincirleri flagella'nın olarak genişletilmiş, zayıf dağılma numunelerinin (faz nesneler) için özellikle uygundur. Nesne odak düzlemi geçer bu tür örneklerde görüntü kontrastı değiştirir, bu yüzden, diğer yandan ise, nesne, odak düzlemi ve koyu merkezi bir tarafında ise bir görüntü odak dışı bir açık merkezi vardır. Onlar odak düzlemi tam olarak yalan zaman saf faz nesneler hiçbir kontrast biraz var. Kontrast inversiyon Bu olgu diğer yazarlar ^16,17 tarafından tartışılan ve anomali nedeniyle ¹⁸ Gouy aşamasına eninde sonunda olmuştur. Bu başka bir yerde, tekniğin sınırları değerlendirildiği holografi bağlamda daha titiz bir zemine koymak olmuştur; pozisyonda tipik belirsizlik EAC 150 nm (yaklaşık bir piksel) mertebesinde olanh yönü ^19. Gouy faz anomali yöntem üç boyutlu genişletilmiş nesnelerin yapısını belirlemek için birkaç iyi tanımlanmış DIHM şekillerinden biridir, ama yine de bazı nesneler yeniden sorunludur. (Kameraya göstererek) optik eksen boyunca doğrudan yalan nesneleri doğru yeniden zordur; nesnenin uzunluğu ve pozisyonda belirsizlikler büyük olur. Bu sınırlamanın nedeni hologramı (kamera kaydedebilirsiniz farklı gri seviyelerinin sayısı) kayıt piksel kısıtlı bit derinliğe parçası. Ilgi konusu nesne odak düzlemine çok yakın olduğunda, bir başka sorunlu yapılandırma ortaya çıkar. Bu durumda, nesnenin gerçek ve sanal görüntüleri yorumlamak zordur karmaşık optik alanlar oluşturacak şekilde, yakın yeniden inşa edilir. Burada ikinci, biraz daha az önemli husustur çıkan kırınım saçakları bu iri taneli INF görüntü sensörünün daha az işgal ve olduğunuormation yoksul kaliteli yeniden yol açar.

Uygulamada, basit bir gradyan filtre aydınlatma yön boyunca kuvvetli yoğunluk ters çevirmeyi tespit etmek için üç boyutlu bir yeniden hacim uygulanır. Yoğunluğu koyu, ya da tam tersi ışıktan hızlı bir şekilde değişir bölgeler, daha sonra saçılma bölgelerle ilişkilidir. Bu bireysel katkıları toplamı kolaylıkla Rayleigh-Sommerfeld'in geri yayılım yöntemi kullanılarak çevrilir toplam saçılan alanı vermek için zayıf-saçılım nesneler de bu tür elementlerin ²⁰ bir noninteracting topluluğu olarak tarif edilir. Bu yazıda, eksenel yoğunluk gradyan tekniği Streptococcus hücrelerinin bir zincir uygulanır. Hücre gövdeleri faz nesnelerdir (türler E. coli, bir dalga boyu λ = 589 nm'de 1.384 olduğu ^21, ölçülen bir kırılma indeksine sahiptir, Streptococcus soyu benzer olması muhtemeldir) ve bağlı lekeler yüksek yoğunluklu bir zincir olarak görünür incidegrade filtre sonra e örnek hacmi uygulanmıştır. Bu hacim, süzüldü uygulanan standart eşik ve özellik çıkartma yöntemleri hücreleri içinde bu bölgeye tekabül eden hacim pikseller (vokseller) ekstraksiyonunu sağlar. Bu yöntemin özel bir avantajı, eksenel yönde bir nesnenin konumunun açık yeniden izin vermektedir. Benzer yöntemler (en azından, bir mikroskop objektif aracılığıyla görüntülü nesneye yakın olan rekor hologramlar,) bu deplasman işareti belirlemek mümkün olmaktan muzdarip. Rayleigh-Sommerfeld'in rekonstrüksiyon yöntemi de olsa imzalamak bağımsız, bu anlamda, degrade operasyon bize odak düzlemi üzerinde ve altında zayıf faz nesneler arasında ayrım sağlar.

Protocol

1.. Kurulum ve Veri Toplama

1. Donmuş stokta ²² Streptococcus suşu V4051-197 KTY ortamda (düz yüzme) hücreleri bir kültür büyütün. Doymaya değin, 35 ° C ve 150 rpm'de gece boyunca, döner bir çalkalayıcı içinde inkübe edin.
2. Doymuş kültürünün 500 ul taze ortam KTY 10 ml inoküle. Hücreler, λ = 600 nm (yaklaşık olarak 5 x 10 ⁸ hücre / ml), yaklaşık 1.0 'lik bir optik yoğunluğa ulaşana kadar 35 ° C ve 150 rpm'de bir başka 3.5 saat boyunca inkübe edin.
3. Hareketli hücrelerin nihai konsantrasyon elde etmek üzere, taze ortam içinde 1:400 seyreltin.
4. Bir mikroskop lamı üzerinde, yüksekliği yaklaşık 1 mm (örneğin vazelin ile dolu bir şırıngadan) yağ bir halka yapmak ve merkezinde, numune çözeltisinin bir damla yerleştirin. Mühürlemek için kenarlarda ve üst pres hafifçe üzerinde bir cam kapak koyun, bu sıvı sağlanması slayt ve kapak camı hem de temas halindedir. Elde edilen numune odası arou olmalıdırderinlemesine nd 100-200 um.
5. Cam ve lens arasındaki yağın içinde hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, dikkatli bir şekilde cam kapak aşağı bakacak şekilde mikroskop örnek odasına yerleştirin ve.
6. Örnek odasının alt yüzeyinde Odak mikroskop ve odak kondenseri getir.
7. Standart aydınlatmasını kapatın ve mikroskop kondansatör diyafram arkasındaki LED kafasını yerleştirin. Maksimum çıkış için LED güç kaynağını ayarlayın.
8. Onun verdiği ölçüde kondansatör açıklığı kapatmak ve gerekirse aydınlatma objektif lens açıklığı merkezli kadar, kendi montaj LED dürtmek.
9. Bilgisayar ve fotoğraf makinesini açın ve mikroskop kamera bağlantı noktasına tüm ışık yönlendirmek. Görüntü alma yazılımı kare hızını ve görüntü boyutunu ayarlayın.
10. Hala iyi kontrast koruyarak mümkün olduğunca kare pozlama süresi kısa olun. Görüntü doygunluğuyla olmadığından emin olmak için bir görüntü yoğunluk histogramı edinted veya altında maruz.
11. Gerekirse ilgi amacı, hafif (tipik olarak 10-30 um) tarafından defocused, böylece mikroskop yönlendirmesi. Nesne ve odak düzlemi (yani odak düzlemi numune bölmesi içinde yer alması) aynı ortam içinde olmalıdır.

2. Yeniden yapılanma

Veri işleme ilk adım sayısal görüntülerin bir yığın üreten, farklı derinliklerde bir dizi bir video karesini yönlendirmesi olduğunu. : Bu yapmak için kullanıcı-dostu yazılım burada bulunabilir http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html (ters bir mikroskop kullanılarak elde ve 60X yağ daldırma objektif lens) örnek resimlerle birlikte ve ray için bir sahne dosya render takip.

1. Arayüzünde ilgili kutulara girdi ilgi çerçeve ve ayrı görüntü dosyaları olarak ilgili arka plan,. Bir arka plan görüntüsü bir çerçeve f olduğunuairly hologram yokluğunda, videonun arka temsil eder ve hologram lokalizasyonu ve analiz müdahale edebilecek herhangi bir sabit biçimli gürültüyü bastırmak için kullanılacaktır.
2. Programı çalıştırmadan önce ekranın sol tarafta küresel ayarları kutularının içine değerleri girin. İlk üç çıkış yığın parametreler şunlardır: İlk çerçevenin eksenel pozisyonu ('odak başlat'); yeniden yığını dilim sayısı ('adımların sayısı'); yığını her dilim arasındaki eksenel mesafe ('Adım boyutu') .
3. Doğru oranlarda nesneleri yeniden inşa etmek için, adım büyüklüğü yanal piksel aralığı olarak aynı boyutta olmalıdır. Son iki kutularına 'Pixel / mikron' kutusuna, aydınlatma dalga boyu ve orta kırılma indeksi kameranın yan örnekleme frekansını (1/pixel aralık) girin. Programın varsayılan değerleri örnek verileri yeniden inşa için uygun bulunmaktadır.
4. 'Flip Z-degrade' düğmesine basarsanız obje merkezict hologram karanlık (örneğin çerçeve 2005 ve daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakınız).
5. Açık / kapalı durumunu bant geçiren filtre edin (varsayılan açık). Gradient-çevirme düğmesi altında bir kutuda yer alan bu isteğe bağlı bant geçiş filtresi, gürültülü piksel katkı bastırılması için sorumludur. Bant geçiren filtre hemen nesilden sonra her görüntü dilim uygulanır.
6. / Kapama devletler (varsayılan üzerinde) ara çıkış anahtarı kontrol edin. Intermediate analizi adımları sıkıştırılmamış olarak, iki çıkış videoları yazılır avi dosyaları:. Ilk refocused yığını ('_stack.avi' ile biten dosya adı), ikinci eksenel degrade işleminden sonra yığını (dosya adı biten 'olduğunu _gradient.avi '). İdeal olarak, bu ikinci yığın ilgi nesne karanlık bir arka plana karşı parlak bir nesne olarak vurgulanır içerecektir.
7. Ana pencerede tüm parametreleri, basın 'Çalıştır' ayarladıktan sonra. Seçilen çerçeve yazılımın ana kutusunda belirecektir.
8. Kullanım(sol klik) yakınlaştırma ve (+ sol klik shift) uzaklaştırmak için görüntünün sol araç çubuğunda bulunan büyüteç aracı. Faiz (ROI) bir bölge seçmek için araç çubuğundaki dikdörtgen aracını kullanın. Bu yeniden optimize eder gibi, dikdörtgenin içinde mümkün olduğunca Hologramın saçaklar gibi birçok yakalayın.
9. İki görüntü yığınları oluşturmak için 'Süreç' düğmesine basınız. (Adresinden ücretsiz temin edilebilir ImageJ kullanılarak elde edilen yığınlarını kontrol edin http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Ilgi nesnesi açıkça degrade görüntü yığını görülebilir ise, nesne koordinatlarını çıkarmak için bir sonraki adıma geçin.

3. Sıva

1. Çerçeve refocusing Ayrıca bu program x, y, z ilgi nesnesine her vokselın koordinatlarını bulabilirsiniz. Bu işlevi etkinleştirmek için 'Feature Extraction' düğmesine basın.
2. Için, ( ev output.inc: c örneğin) uzantısı içeren bir yol girinçıktı dosyası düzenler. 'Çıkış stilini koordinat' kutusunda 'POV-Ray stili seçin. Bu program, (elde edilebilir serbest POV-Ray ışınizlemeyle yazılım paketi kullanılarak görüntülendi edilebilir bir nesne dosyası yazmasına neden http://www.povray.org/ ).
3. Yukarıda 2. bölümde olduğu gibi görüntüleri reprocess. Program 'Çıktı koordinat kutusuna dosya adının yazılı (x, y, z) bir dizi seçilen ROI koordinatlarını sağlayacaktır. Nesne koordinatları çıkarımı yığını nesil önemli ölçüde daha uzun sürer.
4. Koordinatlar sadece üretilen dosyası olarak (yeniden kodu ile birlikte) örnek POV-Ray dosyası aynı klasörde olduğundan emin olun. Örnek. Pov dosyasını düzenleyin ve hat üzerinde tırnak içinde dosya adını değiştirin
   # "MYFILE.inc arasında"
   rekonstrüksiyon kod tarafından oluşturulan veri dosyasının adı ile.
5. Bir bitmap görüntüsünü işlemek için POV-Ray 'Çalıştır' düğmesine tıklayın. To kamera konumu, aydınlatma ve doku seçenekleri POV-Ray mümkün özelleştirmeleri sadece birkaçı; ayrıntılar için çevrimiçi belgelere bakın.

Results

DIHM yeteneklerini göstermek için, deneyler Streptococcus bakteri zinciri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Zincir kendisi uzun 10.5 mm ölçüldü ve aralık 0,6-1 mikron çapları 6-7 sfero silindirik hücreler (zincirindeki iki hücre bölünmesi yakın) oluşmuştur. 1a Şekiller ve ana arayüzü göstermek 1b yeniden yapılanma ve işleme yazılımı. Sayısal odaklanma prosedürünün örnek bir uzamsal bant geçiş filtresi uygulanmış yerde, Şekil 2'de görülmektedir. 3, Şekil 2'...

Discussion

Bu deney protokolünde en önemli adım, istikrarlı bir deney düzeneği görüntülerin doğru yakalama olduğunu. Fakir arka plan verileri ile, yüksek sadakat yeniden imkansız yanında. Bu oluşturulan görüntüyü düşürebilir gibi, (objektif arkasına bakarak koyu halka gibi görünen) bir iç faz kontrast elemanı ile objektif lens önlemek için de önemlidir. Ilgi nesnesi sapma saçaklar birkaç çift (uygun bir sezgisel defocused desen odaklanılan nesnenin 10 katı lineer boyut var görünüyor olmasıdır imajını görünür odak düzlemi yeterince...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon Eclipse Ti-E ters mikroskop	Nikon Corp.
LED	Thorlabs	M660L3	emisyon dalga boyu λ=660 nm, çizgi genişliği yaklaşık 20 nm
LED güç kaynağı	Thorlabs	LEDD1B
İplik	Adaptörü Thorlabs	SM2T2
İplik Adaptörü	Thorlabs	SM1A2
Çerçeve Kavrayıcı kartı	EPIX	PIXCI E4
Yüksek Hızlı CMOS kamera	Mikrotron	MC-1362