Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Özet

Murine nazofarenksin Streptococcus pneumoniae ile kolonizasyonu ve daha sonra yapışık veya işe alınan hücrelerin çıkarılması açıklanmaktadır. Bu teknik, nazofarenksin yıkanmasını ve sıvının nares yoluyla toplanmasını içerir ve diferansiyel hücre niceliği ve mRNA ekspresyonunun yerinde analizi dedahil olmak üzere çeşitli okumalar için uyarlanabilir.

Özet

Streptococcus pneumoniae tarafından nazofarengeal kolonizasyon akciğerlere veya kan dolaşımına istilanın ön koşuludur¹. Bu organizma, nazofarenksin mukozal yüzeyini kolonileştirebilir, burada konakçının diğer dokularına istila etmek için konak savunmalarını barındırabilir, çoğaltabilir ve sonunda üstesinden gelebilir. Normalde alt solunum yollarında bir enfeksiyonun kurulması zatürre ile sonuçlanır. Alternatif olarak, bakteriler kan dolaşımına yayılabilir ve yüksek ölüm oranları²ile ilişkili olan bakteriyemiye neden olabilir veya doğrudan pnömokok menenjitinin gelişmesine yol açabilir. Nazofarengeal kolonizasyonun kinetiğini ve immün yanıtlarını anlamak S. pneumoniae enfeksiyon modellerinin önemli bir yönüdür.

İntranazal kolonizasyon fare modelimiz insan modellerinden^{uyarlanmıştır 3} ve nazofarenks^4-7konak-patojen yanıtlarının incelenmesinde birden fazla araştırma grubu tarafından kullanılmıştır. Modelin ilk bölümünde, insan yetişkinlerde taşıma olaylarına benzer, kendi kendini sınırlayan bir bakteri kolonizasyonu oluşturmak için S. pneumoniae'nin klinik bir izolesini kullanıyoruz. Burada ayrıntılı olarak açıklanan prosedür, bakteriyel bir inoculumun hazırlanmasını ve ardından inoculumun intranazal bir uygulama yolu ile teslim edilmesi yoluyla bir kolonileşme olayının kurulmasını içerir. Yerleşik makrofajlar, sabit durum sırasında nazofarenksteki baskın hücre tipidir. Tipik olarak, enfekte olmayan farelerde az sayıda lenfosit vardır⁸, ancak mukozal kolonizasyon, bağışıklık yanıtı ve daha sonra konak bağışıklık hücrelerinin işe alınmasıyla sonuçlanacak düşük ila yüksek dereceli inflamasyona (bakteri türlerinin ve suşunun virülansına bağlı olarak) yol açacaktır. Bu hücreler, nares yoluyla trakeal içeriğin bir lavajı ile izole edilebilir ve enfeksiyonun kinetiğini daha iyi anlamak için kolonizasyon bakterilerinin yoğunluğu ile ilişkilidir.

Protokol

Başlamadan önce: Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar Biyolojik Tehlike Seviye 2 (BSL2) Biyolojik Güvenlik Kabininde (BSC) yapılır. Deneylerin başlatılmasından önce lütfen kurumsal yönergelere göre enfeksiyöz bakteriyel patojenlerin kullanımı için uygun Biyolojik Tehlike Onayını almış olduğundan emin olun. Ayrıca, lütfen prosedürü önceden yapmak için gerekli tüm malzeme ve reaktiflere sahip olduğundan emin olun. Bu deneylerde kullanılan fareler Jackson Laboratuvarları, Charles Nehri veya Taconic'ten dişi C57BL / 6 fareleri dahil etti ve 10-14 haftalıktı (burun kolonizasyonu boşluğu veya enfeksiyonu kinetiğinde cinsiyete bağlı önemli farklılıklar bulamamış olsak da). Bu deneylerde kullanılan tüm fareler spesifik patojen içermeyen koşullar altında yetiştirilmiş ve sürdürülmüştür ve yaygın virüslerden, (LCMV, MNV, MPV, reovirüs ECTV ve diğer) bakterilerden(örneğin H. pylori)ve parazitlerden(örneğin pinworm, ektopazitler) dışkı örnek testi ile ve tesis odalarında bulunan sentinel farelerin sık anatomik değerlendirmesinden arındırılmıştır. Bu deneyleri yaparken, 10-12 haftadan küçük olmayan ve 6 aydan büyük olmayan kontrol fareleri kullanmanızı öneririz. Bu yaş aralığından daha genç veya daha yaşlı fareler, daha uzun nazofarengeal taşıma süresine ve enfeksiyonu yayma olasılığının artmasına daha duyarlıdır. Fare arka planı, bir kolonileşme deneyinin sonuçlarını etkileyebilecek bir başka önemli husustur, çünkü birkaç grup farklı genetik geçmişlere sahip farelerin S. pneumoniae D39 (serotip 2) suşu^9,10'a farklı hassasiyetlere sahip olduğunu göstermiştir. S. pneumoniae doğal olarak meydana gelen bir murine patojeni değildir ve tek doğal rezervuarı insan nazofarenksidir. Bulaşma solunum damlacıkları yoluyla gerçekleşir ve fareler solunum salgıları üretmediği için, bireysel fareler bakteriyi diğer farelere iletemez, bu nedenle fareden fareye iletim için endişe yoktur¹¹. Bu yazıda açıklanan prosedürlere görsel bir genel bakış için lütfen Şekil 1'e bakın.

1. S. pneumoniae Kültürünün Hazırlanması

1. Streptococcus pneumoniae'ninsüspansiyon büyümesi için 5 ml triptik soya agarını aşıla.
2. Bakteriyel inoculum 600 nm olarak ayarlanmış bir kilometre sayacı tarafından belirlenen 10⁸ CFU/ ml'lik bir sıvı yoğunluğu ile kütük faz büyümesine ulaşana kadar% 5 CO_2'de 37 ° C'de statik koşullar altında kültür. Bu CFU'ya karşılık gelen tam okuma, seçilen belirli bakteri suşuna bağlı olarak farklılık gösterecektir; S. pneumoniae suşlarının çoğu için_{bu, 0.45-0.55} OD 600 aralığına karşılık gelir. Tipik olarak, sıvı kültüründeki S. pneumoniae suşları, alt kültüre gerek kalmadan, önerilen koşullar altında 1,5-2,5 saat içinde bu yoğunluğa büyüyecektir. Kültürün aşırı büyümesine izin verilmemelidir (0,75'lik bir OD okumasının ötesinde), bakterilerin artık kütük faz büyümesinde olmadığı ve kapsamlı otolizden geçtiği noktayı temsil eder.
3. Her fare yaklaşık 10⁷ bakteri ile aşılanacaktır. Bu nedenle, her 9 farenin kolonize edilmesi için, bir Eppendorf tüpüne 1 ml inoculum pipet ve 1 dakika boyunca 15.000 x g'da döner. Beyazımsı bir pelet görünür olmalıdır. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı çıkarın ve bakterileri 100 μl fosfat tamponlu saline (PBS) yeniden harcamaya dikkat edin, böylece konsantrasyonu 10⁹ CFU / ml'ye çıkarın. Bu aşamada, bakteri canlı kalmalıdır, ancak kolayca çoğalmaz.
4. Birden fazla aliquot kullanıyorsanız, bakteri yoğunluğundaki hafif numuneler arası varyasyonları kontrol etmek için tek bir tüpte birleştirin.
5. Bakterileri aşıya hazır olana kadar maksimum 1 saat boyunca buzda tutun.
6. Tam bir bakteri sayısı elde etmek için, düzgün bakteriyel inoculum ile başlayan kütük açısından seri seyreltme serisi gerçekleştirin. 90 μl steril PBS'ye 10 μl ekleyerek seri olarak 10 kat seyreltin.
7. 10^-5 - 10 -9 seyreltme numunelerinin 3 damlasının yanı sıra,^%5koyun kanı ile desteklenmiş tryptic soya agar (TSA) plakasının ayrı etiketli bölümlerine sadece PBS kontaminasyon kontrolü plakası (Şekil 2). Pipet uçlarının, aşırı bakterileri taşımayı ve sonuçların değişkenliğini artırmayı önlemek için daha yüksek bir CFU konsantrasyonundan daha düşük bir CFU konsantrasyonuna seyreltilen her adım için değiştirildiğinden emin olun. TSA yerine insan kanı agar (HBA) plakaları da kullanılabilir. Birçok S. pneumoniae türü neomisin (5-20 μg / ml'den itibaren) dirençli olduğundan, bu antibiyotik plaka hazırlama aşamasında tercih edilen agar ortamına da eklenebilir. Bu, dirençli olmayan bakterileri ortadan kaldırdığı için numaralandırmayı kolaylaştırır. Her bir bakteri suşu için kullanılacak en uygun antibiyotik konsantrasyonunu belirlemek için her bir suşun antibiyotik duyarlılığı önceden test edilmelidir.
8. 15-30 dakika açıkta kurumaya bırakın, ardından plakaları örtün ve 37 °C ve% 5 CO_2'yeayarlanmış bakteri inkübatörüne baş aşağı yerleştirin. 24 saat boyunca tabakta bakteri kolonileri yetiştirin.
9. Koloni oluşturan birimlerin sayısını ve ilgili konsantrasyonlarını belirleyin. OD₆₀₀ değerinin tespitlerine dayanarak, konsantrasyon 1-4 x 10⁹ CFU/ml aralığında olmalıdır.

2. Murine İntranazal Kolonizasyon

1. Fareleri bir fare kısıtlayıcı aparatına (diyafram oluşturmak için ucu kesilmiş modifiye edilmiş 50 ml Falcon tüp) yerleştirerek, burunlarının kısıtlayıcı aparatın konik ucundan yeni çıkması için başparmakla vücutlarının tabanına sabitleyerek dizginleyin(Şekil 4). Bu cihazın kullanımı, farenin kafasının hareketsiz hale getirilmesine ve nareslerinin hareketi en aza indirecek şekilde ayrılmasına izin verir ve hayvandan pipet ucunu mastikleştirme girişimlerini engeller ve inokülün tamamen teslim edilmesine izin verir. Alternatif olarak, fareler boyundaki sürtünme ve manuel kısıtlama yoluyla hareketsiz hale getirilebilir. İntranazal aşılamadan önce hayvanların anestezisini önermiyoruz. Inoculumun anestezi altındaki hayvanlara idaresi, inokülün bir kısmının akciğerlere yayılmasına neden olur^12,13.
2. Bir P10 veya P20 pipeti kullanarak, hazırlanan kültürün 10 μl'sini biriktirerek her fareyi aşılayarak, her iki nar arasında eşit olarak dağıtarak (inoculum'un aşıyı yavaş yavaş titreterek buruna damlamasına izin verin, farelerin inoculum soluması zaman ayırır). İnoculumun tam teslimatını elde etmek için, farenin burnunu aşırı hareket ettirmeye başladığı herhangi bir noktada yönetimi duraklatın. Fareler nefes verirken burundan bir miktar dışarı atabileceğinden, tüm inoculum narlara enjekte edilmeyebilir; bununla birlikte, dışarı atılan miktar eksicule olma eğiliminde olduğu ve inoculum son derece yüksek miktarda bakteri içerdiğinden, bu kolonileşen bakteri yükünü önemli ölçüde etkilemez. Ek olarak, nazofarengeal mukozada koloniizasyon için mevcut yüzey alanı sınırlıdır ve sonuç olarak biz ve diğerleri, önerilen 10⁷ dozun tüm farelerde tutarlı bakteri seviyeleri elde etmek için yeterli olduğunu ve ilk miktarlarda kolonileşen bakterilerde minimum değişkenlik ile sonuç olduğunu bulduk^14,15 .
3. Uç nokta izlemenizin bir parçası olarak ağırlık göstergelerini kullanıyorsanız fareleri tartın. Uyuşukluk, fırfırlı kürk ve kilo kaybı da dahil olmak üzere klinik semptomlar için fareleri her 12-24 saatte bir izleyin. Fareler tipik olarak kolonizasyon sonrası 3-5 güne kadar hastalık semptomları göstermez ve bunlar, günde ortalama% 5'i kadar kilo kaybından önce gelecektir. Fareler giderek hastalandıkça kambur duruşları üstlenecekler ve hareketlerde azalma ve elleçleme de dahil olmak üzere stimülasyona karşı tepkinin azaldığını göstereceklerdir. Bu aşamada, hastalık tipik olarak sepsis ve / veya zatürreenin göstergesidir ve muhtemelen terminal olacaktır, ancak fareler sonuçları iyileştirmek için günlük 1 ml deri altı salin ile tedavi edilebilir. Hayatta kalan fareler, 7. P1547 suşu ile kolonize edilmiş farelerde izlenen ağırlığın temsili bir sonucu için lütfen Şekil 5'e bakın.

3. Burun Lavajı Örnek Toplama

Başlamadan önce: 26 3/8 G eğimli iğnelerle kaplanmış 1 ml şırınga kullanarak konserve iğneler hazırlayın. İç çapı 0,38 mm olan 2,5 cm'lik PE20 polietilen boru parçalarını keserek her ucun eğimli bir uca sahip olmasını sağlayın. Uzun uçları kullanarak, 2,5 cm uzunluğunda bir PE20 polietilen boru parçasını (iç çapı 0,38 mm) iğne ucuna kaydırın ve boru tarafının delinmesine kaçının. Kanüle iğneler ihtiyaç duyulana kadar% 70 etanolde tutulabilir.

1. Deneysel farelere ötenazi. Servikal çıkık trakeaya zarar verebileceğinden, bu ötanazi yönteminden kaçınılmalıdır. Tercih edilen yöntemimiz izofluran anestezi ve ardından eksanguinasyondur, ancak ötanazi modunu seçerken kurumsal kurallara uyduğunuzdan emin olun.
2. % 70 sulu etanol kullanarak, etanolün narlara erişmesini önlemeye dikkat ederek hayvanın süperoanterior kürkünü, özellikle boynu sterilize edin.
3. Hayvanın boynunun orta çizgisi boyunca tek bir uzunlamasına kesim yapın ve her iki ucunda iki yatay kesik yaparak nefes borusunu hayal etmek için bir açıklık oluşturun.
4. Cildi her iki tarafa da dikkatlice soyun ve altındaki boyun dokusunu ortaya çıkarın.
5. Trakea görünür olmalı, her iki tarafta da boyuna kaslarla çevrili olmalıdır. Trakeanın kendisini net bir şekilde görmek için bunları dikkatlice kesin, çevredeki vaskülatları kesmemeye dikkat edin.
6. Vaskülat kesilmişse ve kan varsa, devam etmeden önce kanamanın durmasına izin verin ve ardından steril PBS dağıtarak ve bölgedeki aşırı nemi hafifçe emmek için steril gazlı bez kullanarak bölgeyi birkaç kez temizleyin.
7. Trakea düzgün bir şekilde maruz kaldıktan sonra, trakeada yaklaşık yarı yolda enine, semilunar bir kesim yapın (Şekil 6).
8. Önceden hazırlanmış konserve iğneye 1.000 μl sterilize PBS hazırlayın.
9. Nefes borusuna buruna doğru akarak, eğimli kenarı ekleme kolaylığı için aşağı doğru tutarak ekleyin (Şekil 7). İğne yerleştirildikten sonra 180° döndürün ve ışık direncini hissedene kadar hafifçe yukarı doğru araştırın.
10. Eppendorf'u farenin burnunun hemen altına örnek toplama için belirleyin.
11. Minimum (~20 μl) miktarda PBS lavaj sıvısı dağıtarak iğnenin doğru yerleştirilmesini test edin - farenin nares etrafında sıvı damlası oluşmalıdır; bu durumda, 3.13 adımına geçin).
12. Test PBS doğrudan hayvanın ağzından çıkarsa, kanülleri geri çekin ve çok hafif bir direnç hissedilene kadar tekrar hafifçe ileri doğru kontrol ederek yeniden konumlandırın - kanülleri burun damağı ve ağız boşluğuna taşıyacağınız için bu direncin çok ötesine itmemeye dikkat edin.
13. Maksimum miktarda hücrenin yerinden edilmesine ve toplanmasına yardımcı olmak için iğne içeriğini hızla dağıtın - içerikler farenin nares'inden ve toplama tüpüne akmalıdır. Numuneyi hemen buza yerleştirin.
14. RNA analizi için numune toplamak için, aynı fare üzerinde 500 μl RNA liziz tamponu içeren bir konserve iğne kullanarak 3.8-3.13) adımlarını yineleyin. Bu, ilk PBS lavajından sonra doğal olmayan hücrelerin çıkarılması gerektiğinden, büyük ölçüde nazofarengeal mukozal epitelden oluşan kalan hücre popülasyonlarından lysate örneğinin toplanmasına izin verecektir. RNA liziz tamponunun epitel denude ve çevre dokuyu yok edeceğini lütfen unutmayın, bu nedenle bu dokuların tutulması isteniyorsa akciğerler gibi organlarla temastan kaçınmaya özen göstermelisiniz. Toplandıktan sonra, numuneyi çıtçıt dondurmak için doğrudan kuru buzun üzerine RNA liziz tamponu içine yerleştirin. Lizis tamponunda, numuneler üreticinin talimatlarına göre saklanabilir ve genellikle birkaç ay boyunca -70 ° C'de stabildir.

4. Nazofarenkste Bakteri Yükünün Belirlenmesi

1. Her murine burun lavajı örneği için seri bir seyreltme serisi hazırlayarak bakterileri nicel hale getirin. Genel olarak, bakteri yükünün 0-10⁴ CFU arasında olması beklenebilir, bu nedenle üç adet 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. 10 -1 CFU/ml. Vortex konsantrasyonuna ilk tüpe 10 μl düzgün burun lavajı örneğini⁽¹⁰⁰ CFU/ml) iyice ekleyin.
2. Bakteriyolojik plakayı kadranlara bölün ve her biri seyreltme serisinin bir üyesiyle (10^{0 -10-3} CFU/ml) kadranları etiketle. Şekil 2'deolduğu gibi% 5 koyun kanı ile desteklenmiş tryptic soya agar plakaları üzerinde 3 damla 10 μl numune ve temiz örnek.
3. 15-30 dakika açıkta kurumaya izin verin, ardından plakaları örtün ve bakteri üremesi için en uygun koşullara sahip bakteri inkübatörüne baş aşağı yerleştirin (tipik olarak 37 °C ve% 5 CO_2).
4. 18-24 saat boyunca tabakta bakteri kolonileri yetiştirin.
5. Her seyreltme için plakada oluşan kolonileri ortalama alarak kolonileşen bakteri sayısını belirleyin (Şekil 3). Şekil 8, 21 güne kadar 3 farklı S. pneumoniae türü ile kolonize edilmiş farelerde, burun lavajlarının kültürü tarafından belirlendiği gibi, farklı zaman noktalarında bakteri yoğunluğunu göstermektedir.

5. Akış Sitometresi için Numunelerin Hazırlanması

Başlamadan önce: Antikor karışımını hazırlayın. Lökosit popülasyonlarının ölçülmesi için, belirtilen seyreltmelerde aşağıdaki karışımı öneririz: PE-Ly6G (klon 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (klon AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (klon 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (klon PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5,5-CD11c (klon N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (klon M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (klon 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (klon GK1,5, 6,67 μg/ml). Bu karışımın 2x konsantrasyonda olduğunu lütfen unutmayın (bkz. adım 5.5). Tüm antikorlar CCS'de seyreltilmelidir Yıkama tamponu (%0.5 fetal baldır serumu, 2mM EDTA, PBS'de % 0.1 sodyum azit) da önceden hazırlanmalıdır. İzotiple eşleşen kontrol antikorlarının bir karışımında, ideal olarak etiketli antikorlarla aynı tedarikçiden ve spesifik antikorlarla aynı konsantrasyonlarda hazırlanmalıdır. İzotip kontrol antikorları ile tedavi edilen numuneler negatif kontrol işlevi görecektir. İzotip kontrol antikorları ile tedavi edilen örneklerde gözlenen herhangi bir floresan arka plan olarak kabul edilmelidir.

1. 1,5 ml Eppendorf tüplerini 4 °C'ye döndürebilen bir santrifüj.
2. Santrifüj burun lavaj örnekleri 2.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca. Dikkatlice süpernatant ve rezerv dışarı pipet. Not: Nazofarenks içindeki az miktarda hücre nedeniyle, istenmeyen kırmızı kan hücresi kirlenmesi olmadıkça hücre peletı görünmez, bu da parlak kırmızı olur. Bu görülürse, örnek atılmalıdır.
3. 50 μl Fc'de örnek yeniden mi? RIIb/CD16-2 (2.4G2) antikoru (Fc reseptörlerini bağlayan ve spesifik olmayan antikor bağlamayı azaltan) 4 μg/ml konsantrasyonda Pul Yıkama Tamponu.
4. Örnek buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
5. Numuneye 50 μl hazır 2x konsantre floresan antikor karışımı ekleyin. İzotip kontrolü görevi görmek için her deney grubundan temsili bir örnek ayırin. Leke karışımı yerine izotip antikor karışımını bu örneğe ekleyin.
6. 1 saat boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
7. 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj örnekleri. 200 μl PBS'de süpernatant ve resuspend atın.
8. 5.7. adımı yineleyin.
9. İkinci yıkamadan sonra, santrifüj numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar 2.000 x g'da.
10. PBS'de (numuneyi hemen çalıştırıyorsanız) veya %2 paraformaldehitte (numuneleri lekelemeden 1-3 gün sonra çalıştırıyorsanız) yeniden dürt.
11. Akış sitometrisi yaparken, numune başına veya tüm örnek aspire edilene kadar maksimum olay miktarını toplayın. Enfekte olmayan, sağlıklı, genç farelerde, bu toplam 1.000-2.000 olay kadar az olacaktır; Bakteriyel bir kolonizasyon olayı sırasında, hayvandaki hastalık durumuna ve yaş ve genetik arka plan gibi faktörlere bağlı olarak bu sayı 2 ila 5 kat daha fazla artabilir. Şekil 9, 450 ileri saçılım ve 300 Yan Dağılım kullanılarak 3 lazer becton Dickenson LSRII akış sitometresinden toplanan temsili akış sitometrisi sonuçlarını gösterir, ancak numune toplamadan önce kullanmayı düşündüğünüz belirli akış sitometresi için parametreleri optimize etmenizi öneririz. Not: Bir numunede eser miktarda kan kirlenmesi bile varsa, toplanan toplam olay beklenenden önemli ölçüde daha yüksek olacaktır ve numune analizden indirimli olmalıdır.

6. Burun Lavajlarının Nicel PCR (qPCR) Analizi

1. Hücre lysates'i adım 3.14 oda sıcaklığından çözün.
2. Tercih edilen RNA ayıklaması ile birlikte sağlanan önerilen protokolü izleyin.
3. RNA ekstraksiyon prosedürünü belirtildiği gibi tamamladıktan sonra, spektrofotometre veya elektroforez bazlı bir yöntem kullanarak RNA miktarını ölçün (Şekil 10). Rutin olarak numune başına 975 ila 3.250 ng toplam RNA elde ediyoruz ve 260/280 nm'lik >1.7 oranı veya 8.1.1±0.13 civarında bir RNA bütünlük numarası (RIN).
4. M-MULV Ters Transkriptaz'ı kullanarak 1.000 ng RNA (maksimum 13 μl) ile üreticinin protokolüne göre cDNA'yı yazıya dökün.
5. Elde edilen cDNA örneklerini 8x ve aliquot'u -20 veya -80 °C'de uzun süreli depolama için 4 ayrı tüpe eşit olarak seyreltin.
6. Gen ekspresyonunu qPCR ile ölçmek için, buz veya soğuk blok üzerindeki triplikat içinde 25 μl numune reaksiyonları hazırlayın: seçtiğiniz qPCR kitinden 12,5 μl 2x qPCR ana karışımı, 0,25 μl referans boyası, 2 μl seyreltilmiş cDNA (adım 7,5), 1 μl karışık ileri ve ters astar (400 nM final), 9,25 μl RNAse-DNAse içermeyen su. Bu protokol, daha önce yayımlanan yöntemlerin bir uyarlamasıdır¹⁶.
7. Genel olarak iki adımlı bir qPCR amplifikasyonu (10 dakika için 95 °C ve ardından 40 döngü x [95 °C x 15 sn, 60 °C x 1 dk]) etkili olduğunu görüyoruz (Şekil 11a); ancak, her astar çifti optimize edilmelidir. Spesifik olmayan bir amplifikasyonun oluşmamasını sağlamak için amplifikasyondan sonra ayrışma (erime) eğrileri yapılmalıdır. amplifikasyon (Şekil 11b)
8. Analiz edilen her gen için rutin olarak standart eğrilerin yanı sıra analiz edilen her 96 kuyu plakası için standart bir kalibratör (akciğer veya dalak homojenasyonundan türetilmiştir) çalıştırıyoruz. Göreli transkript tutarları, önce ham döngü eşiği (Ct) değerlerinin referans boya ile normalleştirilmesi ve elde edilen değerlerin ilgili standart eğri üzerinden dönüştürülmesiyle elde edilir. Bu göreli miktarlar daha sonra standart kalibratöre ve uygun olduğu şekilde bir temizlik genine normalleştirilir.

Sonuçlar

Şekil 1, protokolün ana adımlarını özetleyen bir genel bakış şemasını temsil eder. Şekil 2-3, burada açıklanan protokollere özgü mikrobiyolojik metodolojinin görselleştirilmesini sağlar. Şekil 4, intranazal kolonizasyon yapmak için bir farenin uygun şekilde konumlandırılmasını temsil ederken, Şekil 5 tipik olarak S. pneumoniae suşu P1547 ile kolonize edilen farelerin ağırlığındaki değişiklikleri gösterir. Şekil 6-7, bu iki tekni...

Tartışma

Bu çalışmada, Streptococcus pneumoniae'nin klinik bir izole suşu kullanılarak farelerin intranazal kolonizasyonu ve bakteriye yanıt olarak nazofarenkse alınan bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı yöntemler sunduk. Bakteriyel bir inoculumun besin bakımından zengin medyada nasıl kültürlendirilebileceğini ve başlangıçta nazofarenks ile sınırlı olan farelerde bir kolonileşme olayı oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Daha sonra nazofarenkse katılan yanıt veren immün h...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-Fare Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-Fare Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-Fare CD45.1 eFluor 450 eBioscience		48-0453-82
Anti-Fare F4 / 80 Antijen	APC eBioscience	17-4801-82
Anti-Fare CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-Fare CD11b PE-CY7	eBioscience	25-0112-82
Anti-Fare CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-Fare CD4 eFluor 605NC eBioscience		93-0041-42
Intramedik Polietilen Boru - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Şırınga	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 İntradermal Konik	Becton Dickinson	305110
Tampon RLT Lizis Tamponu	Qiagen	79216
Difco Triptik Soya Agar	Becton Dickinson	236950
Defibrine Koyun Kanı	PML Mikrobiyolojikler	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Ters Transkriptaz	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001