Yöntem makalesi

İnsan Bağırsak Epitel Hücreleri ve BALB / c Fare makrofajlar kullanarak Tolere edilebilir yağ asitleri ve Kolera Toksin Konsantrasyonları belirlenmesi

DOI:

10.3791/50491

⸱

30 Mayıs 2013

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Kingsborough Community College, 2Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 3New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz önemli ölçüde ve olumsuz yağ asitleri ve toksin çözücü ve hücre yaşam deneyleri bunları kullanarak hücre yaşamını etkilemedi üç yağ asitleri (oleik linoleik ve linolenik asit) ve kolera toksin tolere konsantrasyonlarını belirlemek için yola çıktı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önlenmesi ve insan olmayan ve insan hastalıklarının hafifletilmesi yağ asitlerinin olumlu rol oynamaktadır ve yaygın belgelenmelidir devam etmektedir. Bu roller iltihabı önlenmesi hem de bulaşıcı hastalıklara mukozal bağışıklık dahil olmak üzere bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıklar etkiler içerir. Kolera bakterisi Vibrio cholerae neden olduğu akut bağırsak hastalıktır. Bu gelişmekte olan ülkelerde ortaya çıkar ve eğer tedavi edilmezse, ölümle sonuçlanabilir. Kolera için aşı mevcut olmakla birlikte, her zaman etkili değildir ve diğer önleyici yöntemlere ihtiyaç vardır. Biz sırasıyla fare BALB / C makrofajlar ve insan bağırsak epitel hücreleri kullanarak tolere üç yağ asitleri konsantrasyonları (oleik, linoleik ve linolenik asit) ve kolera toksin belirlemek için yola çıktı. Bu konsantrasyon aralıkları ve hiçbir olan yağ asitlerinin belirli bir konsantrasyonlarını belirlemek için, yukarıda bulunan yağ asitleri ve kullanılan hücre çoğalma deneyleri çözündürülmüşİnsan bağırsak epitel hücre canlılığı için zararlı t. Biz, kolera toksini ile çözülür ve konsantrasyon aralıkları ve istatistiksel BALB / C makrofaj hücre canlılığı azalma yok kolera toksin belirli konsantrasyonlarda tespit etmek için bir ölçüm içinde kullanılabilir.

Bu optimum yağ asidi konsantrasyonları arasında 1-5 ng / ml, ve bu tedavi için <30 ng olması kolera toksininin. Olduğu bulundu Bu veri önlenmesi veya kolera enfeksiyonların azaltılması yağ asitleri için koruyucu mukozal rol bulmak amacı ileride yapılacak çalışmalar yardımcı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oleik, linoleik ve linolenik asitler gibi yağ asitleri, sağlık yararları olmuştur ve belgelendirilmesi devam ediyor. Örneğin, oleik asit, vücut 1,2 lipofilik ilaçların penetrasyonu kolaylaştırır yardımcı doymuş yağ asitleri 3 yerine% 24 oranında azaltır, koroner kalp hastalığı, ve X,-bağlı böyle adrenolökodistrofi 4 gibi metabolizma hastalıkları tedavi etmek için kullanılır yağ asidi metabolizmasının genetik bozukluk. . Memelilerde araşidonik asit, linoleik asit (oleik asit aksine) için gerekli bir öncü vücut tarafından sentezlenir değildir ve bu keten tohumu tüketimi gibi dış kaynaklardan elde edilmelidir ise 5 Çalışmaları gibi linoleik asit birçok yararlı sağlık etkileri gösterir: cilt için anti-aging özellikleri, 6 anti-inflamatuar özellikleri, kolorektal ve prostat kanseri hücreleri 7 azaltılmış çoğalması, 8 ve obezite mücadele yeteneği ve promosyon of kalp-damar sağlığı. 9 linolenik asit, periodontal iltihabı, 10 ve modüle tromboksan ve prostasiklin biyosentezi azaltılmasında rol oynamaktadır. 11

Arpita 12 V. üzerinde safra yağ asitlerinin etkisi ve kolesterol okudu virülans faktörleri ve motilite cholerae 'nin ifadesi. Yamasaki 13 kırmızı acı biber, ve diğer doğal çıkarılan bileşikler, metanol özü potansiyel kolera toksin üretimini azaltır belirtti. Bu mukozal bağışıklık sağlayarak kolera gibi bulaşıcı hastalıkların önlenmesi ve azaltılması, yukarıda yağ asitleri (örneğin, keten tohumu gibi) bakımından zengin olan gıda ürünlerinin kullanımını dikkate almak düşünülebilir. Bu hücre çoğalma deneyleri, insan bağırsak epitel hücreleri Ce üzerinde zararlı etkiler olmadan tolere yağ asitlerinin en fazla konsantrasyonu kullanılarak, yağ asitleri çözünür hale getirmek için ve belirlemek için yapılan araştırmalarll canlılığı. Biz, oleik, linoleik ve linolenik asit daha düşük konsantrasyonlarda hücre canlılığı üzerinde yararlı bir etki sağlamak varsayıldı fakat daha yüksek konsantrasyonlarda bu hücreleri için toksik olacaktır. Ayrıca, kolera toksini ile çözülür ve BALB / C fare makrofaj hücre canlılığını önemli bir azalma olmadan tolere kolera toksin maksimum konsantrasyonu belirlenmiştir. Hatta çok düşük seviyede hücre canlılığı üzerine kolera toksin bir toksik etkisi hipotez. Bir kolera toksin çözündürülmesi ve hücrelerin hayatta kalma önemli bir azalma olmadan tolere edilebileceği toksin miktarının saptanması için kullanılma yöntemi, ileri çalışmalar için bir avantaj sağlar. Örneğin, yukarıdaki yöntemlerin bir arada yağ asitleri kolera enfeksiyonlara karşı mukozal bağışıklık ile ilgili hücre sağlamak olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Bildiğimiz kadarıyla en iyi için, bu rasyonel ve metodoloji araştırılmış değildir.

Biz diBizim ön verilere oleik, linoleik ve linolenik asit kolera enfeksiyona karşı mukozal bağışıklık hücreleri sağlamak olmadığını belirlemek için daha sonra araştırmalarda kullanılabilir nasıl scuss.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Doku Kültürü

  1. Kolera toksini belirlemeleri için Mus musculus makrofajlar (BALB / c fareleri) kullanın. Başlangıçta, her kültür M. satıcının talimatları musculus hücreleri.
  2. % 10 cenin sığır serumu ile tamamlanmış L-glutamin ile Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı içinde BALB / c farenin hücreleri yay, ve% 1 antibiyotik / antimikotik ya da RPMI 1640 baz ortam,% 10 fetal sığır serumu,% 5 L-glutamin ve 1 ile tamamlandı % antibiyotik / antimikotik reaktif.
  3. 37 Bacalı kapakları ile 75 cm 2 Corning matara hücreleri büyütün ° C,% 95 hava ve% 5 CO 2.
  4. Yağ asidi tespitler belirlenmesi için başına üreticinin talimatlarına olarak teslim 24 saat içinde insan bağırsak epitel hücreleri getirin.
  5. 37,% 10 FBS ve 30 ng / ml insana ait EGF ile tamamlanmıştır HybriCare medya havalandırmalı kapak ° C ile 75 cm 2 Corning şişelerinde, insan intestinal epitel hücreleri yayma Antibiyotik kullanmayınÜreticinin talimatlarına göre / antimikotik reaktifler.
  6. Confluency yaklaşık% 70 her gözün (1:3) ile ayrıldı.
  7. Freeze ve standart dondurma protokollerini kullanarak çalışma boyunca tüm hücreleri getirmek.
  8. Not: yağ asitlerinin büyük ölçekli konsantrasyonunun belirlenmesi için, başlangıçta daha hızlı büyüyen, bakımını daha kolay fare makrofaj kullanın. Ince çaplı yağ asidi konsantrasyonunun belirlenmesi için, insan epitel hücreleri kullanır. Tüm kolera toksin tedavisi (tartışma) için fare makrofajlar kullanın.

2. Yağ Asidi ve Kolera Toksin Tedaviler

  1. Gelen, oleik linoleik ve linolenik asit transferi şirketi tarafından sağlanan steril cam şişe cam ampul.
  2. Ayrı bir steril Eppendorf tüpüne her yağ asidi transfer ile 1:6 arasında bir seyreltme% 100 etanol içinde ilk önce çözülür ve daha sonra 10 ug / ml bir son konsantrasyon için RPMI 1640 ortam içinde eksik.
  3. Vortex her çözüm ve transfer bu dondurucuda saklama için cam şişe (-20 ° C).
  4. 2,500 hücre / oyuk 96 yuvalı doku kültür plakaları içinde plakası hücreleri.
  5. MTT testleri için hazırlık olarak yağ asitleri ile hücre tedavisi için 200 ul toplam hacmi getirmek için de uygun olan tam bir ortam ekleyin.
  6. 24 saat çoğalma döneminden sonra, ortamı çıkarın ve taze ortam ile değiştirin.
  7. (Bakınız) içeren kuyucuklara test edilecek her yağ asidi, uygun konsantrasyonlarda ekleyin. 200 ul toplam iyi hacimleri getirmek için eksiksiz bir medya ekleyin.
  8. MTT başlamadan önce 24 saat süre ile muamele edilen inkübe edin.
  9. Cryovials 1 mg / ml çözelti ve kısım bir konsantrasyonda PBS içinde kolera toksin çözülür ve 2-8 ° C'de saklayın kriyotüplerin
  10. Hücre tedaviler için, 1 ng / ml bir son çalışma konsantrasyonu için ya da steril PBS (pH 7.4) ya da eksik DMEM toksin 1:100 seyreltin.
  11. Kolera toksin ile hücreleri tedavi etmek içinyukarıda tarif edildiği gibi MTT testleri, levha hücreler için hazırlama.
  12. 24 saatlik bir süreden sonra proliferasyon, yağlı asit uygulamaları (yukarıda) 'de kullanılan prosedürler takip oyuklara test edilecek kolera toksini uygun konsantrasyonları (eden konsantrasyonları için bkz sonuçlar) ekleyin.
  13. MTT başlamadan önce 24 saat süre ile muamele edilen inkübe edin.
  14. Pozitif (pozitif kağıt boyunca c) ve yağ asidi ve kolera toksin tedaviler, tam ortam ve% 70 etanol ile inkübe hücreleri, sırasıyla hem de negatif kontrol (negatif c) 'de.
  15. Tüm örnekler ve tedaviler pozitif kontroller için daha fazla tekrarlı (Bu çalışmada, n = 6), üç tekrarlamalı (n = 3), en az bir kullanın.

3. MTT

  1. 2.5 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar bir MTT stok çözeltisi hazırlanır.
  2. , Test edilecek olan 96 çukurlu bir levhanın her iyi çözüm çıkarın ve taze tam ortam çözeltisi 200 ul ile değiştirin.
  3. Ilanher kuyuya MTT çözüm d 10 ul.
  4. 37 ° C 3-4 saat için plaka inkübe edin.
  5. Ortam çözüm atın ve her bir oyuğa, izopropanol içinde 0.04 M HCl 100 ul ekleyin.
  6. Beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe plakası.
  7. Her bir yeni bir santrifüj tüpüne çözüm aktarın.
  8. 1 dakika için ya da bir pelet oluşana kadar, oda sıcaklığında, 20,000 x g'de santrifüjleyin.
  9. Bir mikro okuyucuya her numunenin 20-40 ul arasında transfer.
  10. Bir spektrofotometre kullanılarak 570 nm de absorbans okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ Asitleri Optimum Konsantrasyon belirlenmesi

Yağ asitleri için optimum konsantrasyon hücre büyümesi ile karşılaştırılabilir ya da sonuç olarak nispeten düşük bir değişkenlik, kontrol hücreleri bu aştığı maksimum konsantrasyon olarak tanımlanır. Oleik optimum yoğunluğunu belirlemek için, linoleik ve linolenik asit hücreler başlangıçta büyük artışlarla her yağ asidi konsantrasyonlarının değiştirilmesi ve daha sonra daha küçük artımlarla ile muamele edilmiştir. Şekil 1, hücrele...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ asitleri konsantrasyonu ve Kolera Toksin önerisi

Yağ asitleri mukozal bağışıklık geliştirmek nasıl mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, çeşitli çalışmalar, yararlı etkileri araştırmak için çalıştılar. Çalışmamız hücreler hücre sağkalım üzerinde önemli bir etkisi olmadan tolere ki de kolera toksin maksimum konsantrasyon olarak tolere olabilir yağ asitlerinin maksimum konsantrasyonunu belirlemek için yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Üç yağ asitleri (oleik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın yazarları bu çalışmanın sonuçlarından herhangi bir mali ilgi var. Bu çalışma için fon Kean Üniversitesi tarafından FT sağlanmıştır, ancak FT şu anda Kingsborough Community College'de bir çalışanıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Paula Cobos ve laboratuar yardım için Dr Evros Vasiliu teşekkür ve sırasıyla fare makrofajlar sağlar. Ayrıca rehberlik için laboratuar yöneticisi Richard Criasia teşekkür ve malzeme ile yardımcı olur. Son olarak, yazarlar video üretimi ile yardım için Ramanpreet Kaur teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cells/Reagent
Mus musculus makrofajlarATCCATCC RAW 264.7
Dulbecco'nun Modifiye Kartal OrtamıATCC30-2002
L-glutaminATCC30-2115
Fetal sığır serumu Bio-westS0250
Antibiyotik/ antimikotik HiklonSV3007901
İnsan bağırsak epitel hücreleri ATCCATTC CCL-241
HybriCare ortamı ATCC46-X
Oleik AsitSigma-AldrichO1008
Linoleik AsitSigma-AldrichL-1376
Linolenik AsitSigma-AldrichL-2376
Kolera toksiniSigma-AldrichC8052
Equipment
BD Falcon 96 Kuyulu Hücre Kültürü PlakalarıBD Biosciences351172
Dynex Revelations 4.22 yazılımına sahip spektrofotometreDynex91000101

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery. Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).
  2. Tandon, P., et al. X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate. Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).
  3. Kris-Etherton, P. M. The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health. Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).
  4. Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels. Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).
  5. Bozan, B., Temelli, F. Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil. Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).
  6. Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology. J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30(2009).
  7. Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).
  8. Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells. Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).
  9. Granda, M., Sinclair, A. J. Fatty acids and obesity. Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).
  10. Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).
  11. Ferretti, A., Flanagan, V. Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).
  12. Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera. Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).
  13. Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).
  14. WHO | Efforts must be intensified to control Zimbabwe cholera outbreak [WHO PRESS RELEASE] [Internet]. , World Health Organization. Available from: http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/ (2010).
  15. Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak. mBio. 2 (4), 1-6 (2011).
  16. Schaeffler, A., Gross, P., et al. Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity. Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ya Asidi ToleransKolera Toksini KonsantrasyonuMTT AnaliziH cre ProliferasyonuYa Asidi z n rle tirmeToksin Dil syon ProtokolH cre Canl l TestiOptimal Konsantrasyon Aral

İlgili makaleler