Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

9.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50523

⸱

18 Eylül 2013

 ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

Bu makalede

Özet

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Özet

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2), bir serin-tireonin kinaz, kompleks protein etki alanının bir Ras (ROC), ROC etki (COR) bir C-terminali dahil olmak üzere, benzer bir etki organizasyon paylaşan paraloglarıdır ve lösin bakımından zengin ve N-terminalinde ankirin-benzeri tekrarlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri LRRK2 Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde implike ise ancak LRRK1, 1,2 sinyal tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, aydınlatılamamıştır henüz. Bu raporda, bu şekilde, bu hücreler 2 proteinlerin genel fosforilasyon seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan, 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 proteinleri etiketlemek için bir protokol mevcut. Kısacası, afinite LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sonra hücreler tarafından asimile sadece bir kaçinkübasyon süresi ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri, bu şekilde radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi ile (3xflag) LRRK proteinlerin immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerinden izole edilmiştir. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir. Protokol kolayca hücrelerinde ifade edilir ve immüno-çökeltme ile izole edilebilir herhangi bir başka proteinin fosforilasyonunu izlemek için adapte edilebilir.

Giriş

Lösin zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) benzer bir etki organizasyon paylaşan multidomain paraloglarıdır. Her iki protein de etkili ROCO protein ailesine 5,6 proteinleri de sınıflandırma, GTPases (Complex Proteinlerin Ras veya ROC) Ras ailesi, hem de etki ROC (COR) bir C-terminaline yakın bir GTPaz dizisini kodlar. Sadece LRRK2 İlave armadillo Domein 6-8 kodlayan ise ROC-COR etki tandem N-terminal, her iki proteinin de, bir lösin-zengini tekrar etki hem de ankirin benzeri alanı kodlar. Sadece LRRK2 C-terminal bölgesinde 8, içinde bir WD40 alanını şifreleyen ise ROC-COR C-terminal, her iki proteinin de, bir serin-tireonin kinaz etki alanını paylaşırlar. LRRK1 ve LRRK2 kesin hücresel rolleri ancak LRRK1 1,2 işaret tirosin kinaz reseptörü implike edilmiştir, henüz aydınlatılamamıştır varken Parkinson hastalığı 3,4 patogenezinde LRRK2 için bir role genetik kanıtlar.

proteinlerin fosforilasyonu hücrelerinde ortak düzenleyici mekanizmadır. Örneğin, fosforilasyon enzim aktivasyonu için bir sinyal ya da kompleksine protein alımı için gerekli olabilir. LRRK2 hücresel fosforilasyonu yaygın olarak karakterize edilmiştir ve phosphosite eşleme ankirin tekrar ve lösin açısından zengin tekrar etki 9-11 arasında bir küme meydana geldiği hücre fosforilasyon bir çoğunluğu göstermiştir. LRRK1 hücre fosforilasyon siteleri eşlenmesi için henüz rağmen, COS7 hücrelerinden imüno LRRK1 protein lekelerinin fosfoprotein boyaması kullanılarak çalışmalar göstermiştir LRRK1 protein hücrelerinde fosforile 12 olduğunu göstermektedir.

Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK prote etiketlendiins 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece radyoaktif olarak etiketlenmiştir. Afinite etiketi (3xflag), daha sonra, immüno-çökeltme ile diğer hücresel bileşenlerden LRRK proteinleri izole etmek için kullanılır. İmmüno-çökeltiler daha sonra SDS-PAGE ile ayrılmış, PVDF membran ve dahil fosfatlar analizine lekelendi blotlar üzerinde proteinlerin otoradyografi (32 P sinyali) ve batı algılama (protein sinyali) ile gerçekleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Mevcut protokol LRRK2 hücresel fosforlanmasını takip radyoaktif 32 P-etiketli ortofosfat kullanır. Radyoaktif reaktifleri ile tüm işlemleri operatör ve çevreye radyoaktif radyasyon maruziyeti en aza indirmek için uygun koruyucu önlemler kullanılarak gerçekleştirilmesi gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Iyonlaştırıcı radyasyon yayan izotoplar içeren bileşikler, kurumsal ve ulusal düzeyde kontrol kullanımı insan sağlığı ve sıkı lisanslama ve düzenlemeler için zararlı olabilir. Bu protokolde deneyler Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) açık kaynak radyasyon kullanımı konusunda eğitim takip ve üniversitede sağlık, güvenlik ve çevre departmanı tarafından sağlanan iyi laboratuvar uygulamaları yönergeleri takip gerçekleştirilmiştir. Protokolde çeşitli adımlar, yaygın olarak, hücre kültürü, SDS-PAGE, Western blot olarak dağıtılan ve laboratuvarda uygulanan burada protokol detaylar verilmiştir. Bu should deneysel koşullar laboratuvardan laboratuvara değişir unutulmamalıdır; radyoaktif malzemenin uygun kullanımını sağlamak için bu nedenle özel önlemler her yeni laboratuvar ortamında adapte edilmelidir.

Açık kaynak radyasyon kullanımı önce düzenleyici onayına tabidir ve laboratuvar araştırma açık kaynak radyasyon sorumlu düzenleyici kurum ülkeden ülkeye değişir. Kullanıcılar bu işlem, yerel kurallara ve düzenlemelere uyması sağlanması için kurumsal radyasyon güvenlik görevlisi ile başvurmalısınız. Düzenleyici kurumlar ile ilgili bilgiler bulunabilir: Belçika, Nükleer Kontrolü Federal Ajansı ( http://www.fanc.fgov.be , web sitesi, Fransızca veya Hollandaca), Birleşik Krallık, Sağlık ve Güvenlik Yönetim ( http: / / www.hse.gov.uk / radyasyon / iyonlaştırıcı / index.htm ), Amerika Birleşik Devletleri'nde Nuc içindelear Düzenleme Komisyonu ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html Kanada), Kanada Nükleer Güvenlik Komisyonu ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), ve Almanya Das Bundesamt für STRAHLENSCHUTZ in ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Bu protokol ile ilgili güvenlik önlemleri metinde not edilmiştir, radyoaktif yonca sembolü (vurgulanır figure-protocol-1 .)

1.. Hücreler metabolik etiketleme

  1. Etiketleme için hücrelerin hazırlanması.
    1. Kültür HEK293T hücre hatları, standart kültür koşullarına göre (37 ° C,% 5 CO2) 8% fetal buzağı serumu ve gentamisin ile DMEM içerisinde.
    2. Için yeterli hücrelerin açtest numune başına en az 1 x 10 6 hücreleri elde etmek.
    3. Hücreleri tripsinize edin ve de 10 6 hücre / 6 yuvalı plakalar (35 mm çapında) içine plaka.
    4. 24 saat hücreleri kaplama sonra, transfeksiyonla veya lentiviral vektör aracılı transdüksiyon yoluyla 3xflag-LRRK2 proteini ifade.
      1. Transfeksiyon için, katkı maddesi olmaksızın (örnek 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 plasmid 13-15 veya pCHMWS-3xflag-LRRK1 plasmid 15) ve 80 ul DMEM içine doğrusal polietilenimin (PEI doğrusal, 1 mg / ml) içinde 8 ul başına karıştırın .) 15-30 dakika kompleksi için izin daha sonra orta günümüze içine iyi karıştırılması ile hücrelere kompleks ekleyin.
      2. Lentiviral vektör aracılı transdüksiyon için, lentiviral vektör kodlama 3xflag-LRRK1 sulandırmak veya -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, bir kural olarak, iki katı kadar nakleden birimleri ile transduce, fonksiyonel vektör parçacıkların yani sayı, hücre), kültür ortamı içine vardır Lentivector olarak. Ürünün bir açıklaması LV-3xflag-LRRK1 / 2 arasında iyon, daha önce 15 tarif edilmiştir.
    5. Hücreler% 80-100 konfluent (yaklaşık 48 saat sonra, transfeksiyon ya da transdüksiyon) olduğunda, fosfatlar olmaksızın, önceden ısıtılmış (37 ° C) hücreler DMEM ile yıkayın.
  2. 32 P-orto-fosfat ile etiket hücreleri.
    1. Radyasyon ile çalışırken emniyet zihin genel ilkeleri tutun.
      1. figure-protocol-2 Belirlenmiş bir radyasyon alanı 32 P ile tüm işlemleri gerçekleştirmek.
      2. figure-protocol-3 Uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir - laboratuarımızda standart işletim prosedürü altında bu laboratuvar önlüğü, çift eldiven ve koruyucu gözlük içerir.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> 32 P Tüm iş maruziyeti en aza indirmek için 6 mm perspex ekranlar kullanıcılardan korumalı olmalıdır.
      4. figure-protocol-4 Kişisel izleme cihazları her zaman kullanılmalıdır - KUL içindeki tüm sertifikalı açık kaynak radyasyon kullanıcı deneyler sırasında radyasyona maruz izlemek için laboratuvar önlüğü göğüs cebinde bağlı bir film rozeti takıyor.
      5. figure-protocol-5 Tüm deneysel yüzeyler bir Geiger sayacı ile kullanım öncesi ve sonrası radyoaktivite açısından değerlendirilmelidir.
      6. figure-protocol-6 Tüm potansiyel olarak kontamine sarf ra için kurumsal kurallarına sıkı sıkıya bağlı olarak atılmalıdırdioactive atık bertaraf.
    2. Bir laminar akış altında, bir etikete hücrelerin 6-çukurlu plaka başına (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) fosfatlar olmadan DMEM içinde 2.1 ml 'si ile bir Falcon tüpü hazırlayın.
      1. Örneğin, 6-çukurlu bir levhanın her kuyularda etiket hücrelere, 12,6 mi, orta (x = 2,1 6) hazırlanması. Bu 2 ml'lik ortam hacmi içinde% 5 fazla olan hücreler 6-çukurlu plaka gözenek başına kullanılmak üzere sağlanmasıdır.
    3. figure-protocol-7 Iyonlaştırıcı radyasyon ile deneyler yapılacak hangi tezgah hazırlayın. Çalışma alanı emici malzeme koruyucu astar yerleştirildiği üzerine bir dökülme mat ile kaplıdır. Eğer bir su geçirmez yüzeyi ile bir kalemi kullanıyorsanız durumda, emici tarafı yukarıya yerleştirin.
    4. figure-protocol-8 Ayrıca sağlamakbir perspex çalışma alanı üzerine kavanoz ve içinde fosfat serbest ortamın tüp yerleştirin.
    5. figure-protocol-9 Buzdolabı dışında 32 P etiketli ortofosfat flakon ile kurşun kaplı kabı alın ve radyoaktivite tezgah getirmek. Bir Geiger sayacı kullanan dış radyoaktif kontaminasyon için konteyner izleyin.
    6. figure-protocol-10 24 uCi / ml 'lik bir konsantrasyonda fosfat olmayan DMEM tüpe 32P etiketli ortofosfat seyreltin.
      1. Not: iyi hücreler 6-çukurlu plaka başına 2 ml, bu 5 uCi 32 kültürlenmiş hücrelerin P etiketli ortofosfat / cm 2 karşılık gelir.
      2. figure-protocol-11 TutmakPerspex kavanoza tüp.
    7. figure-protocol-12 32P etiketli ortofosfat geri kalan kısmı ile kap kapatın ve buzdolabında değiştirin.
    8. figure-protocol-13 Radyoaktivite bankta inkübatör ve yerden etiketlenmesine hücreleri ile 6 oyuklu plakalar çıkarın.
    9. figure-protocol-14 Orta süpernatant kaldırmak ve atın. Ihtiva eden fosfat içermeyen ortam 2 ml ekle 32 ortofosfat / oyuk etiketli.
    10. figure-protocol-15 Bir Perspex kutusu içine Kültür levhalarını, daha sonra bir kap fo izlemekBir Geiger sayacı kullanarak r dış radyoaktif kirlenme.
    11. figure-protocol-16 Izotopik metabolik etiketleme için özel bir ökaryotik hücre inkübatör hücreleri ile Perspex kutusu aktarın.
    12. figure-protocol-17 % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 1-20 saat süreyle inkübe edin.
      1. Genel olarak, 3 saat ya da daha fazla olan bir birleşme süresi tavsiye edilir. Istenilen şekilde uygun inkübasyon süresi her özel protein için bir zaman akışı deneylerinde yoluyla değerlendirilebilir.
    13. figure-protocol-18 İsteğe bağlı: bileşik hücreleri tedavi.
      1. (Örneğin, bir enzim inhibitörü gibi) bileşiği, tedavi ile deneylerde bir bileşik, muamele aşaması, bir yapılmasının ardından dahildiretiketlenmesi için izin vermek için bileşik olmadan inkübasyon süresi itial. İstenilen kuluçka süresinden sonra, kültür plakaları içeren bir Perspex kutusu kuluçka makinesinden çıkarılır ve radyoaktivite, tezgah getirildi.
      2. figure-protocol-19 Etiketleme ortam bileşik, istenen konsantrasyonda seyreltilir, içine önceden ısıtılmış fosfat içermeyen ortam çıkarılır ve değiştirilir. Perspex kavanoza yerleştirilir atık toplama için bir 50 ml tüp içinde orta atın.
      3. figure-protocol-20 Hücreler, perspeks kutuya değiştirilir ve arzu edilen temas süresi için hücre kuluçka makinesine yerleştirilir.
  3. figure-protocol-21 Labe lisatlan toplayınyol hücreleri.
    1. figure-protocol-22 Hücrelerden orta çıkarın ve Perspex kavanoza yerleştirilir atık toplama tüpüne atın.
    2. figure-protocol-23 Hücreler Perspex kavanoza yerleştirilmiş bir atık toplama tüpüne çalkalama solüsyonu atarak, soğuk TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, 2 mL / yıkama) ile 2 kez yıkayın.
    3. figure-protocol-24 Her bir oyuğa buz gibi soğuk, immüno-çökeltme (IP) liziz tamponu içinde 0.5 ml ekleyin ve bütün hücrelerin lize gevşetmek amacıyla, yukarı ve aşağı lizat pipetleme lizat toplar.
      1. Proteaz inhibitörü kokteyl ve fosfataz ekleme, IP liziz tamponu vaktinden (0.5 ml / numune +% 5 fazla) of istenen hacmi hazırlanmasıKullanımdan hemen önce taze inhibitör kokteyli.
      2. Liziz tamponu bileşimi Tris 20 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM,% 1 Triton, Gliserol% 10, proteaz inhibitör kokteyli ve fosfataz inhibitörü kokteyl.
    4. figure-protocol-25 Bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve lizat, en az 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
    5. figure-protocol-26 10 dakika boyunca> 5,000 xg'de bir mikrosantrifüj içinde lizatları santrifüjleyin.
    6. figure-protocol-27 Perspex kalkanlar arkasında saklanan özel çöp kutularına radyoaktif atıkların bertaraf edin.

2. İlgi Proteinlerin Etiketleme analiz

  1. figure-protocol-28 Immün-(IP) ile ilgili bir proteini izole.
    1. figure-protocol-29 Tekrar buza santrifüje lizatları ile mikrosantrifüj tüpleri aktarın ve dengelenmiş flag-M2 agaroz boncuklar 10 ul yatak hacmi ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü içine pipetle süpernatant.
      1. Vaktinden önce dengelenmiş flag-M2 agaroz taneleri ile tüpleri hazırlayın.
      2. Bunun için, 10 ul numune başına yatak hacmi artı% 5 fazlalık karşılık gelen flag-M2 agaroz harç maddenin bir hacmi pipetle.
        1. Genel olarak, boncuklar bir 10 ul yatak hacmi 20 ul bulamaca karşılık gelir. Daha fazla bilgi için ürün veri sayfasına bakın.
      3. IP liziz tamponu 10 hacim (yatak hacmi göre) içinde 3 kez durulama ile boncuk dengelenmesi.
      4. Örnekleri olduğu gibi birçok tüpleri içine 10 ul yatak hacmi / tüp eşit olarak dengelenmiş boncuk dağıtmak. Her numune için bir tanımlayıcı ile tüpleri etiketleyin.
    2. figure-protocol-30 Bir radyoaktif yonca sembolü ile etiketlenmiş 50 ml tüpler (yaklaşık 6 mikrosantrifuj tubes/50 ml tüp) için mikrosantrifüj tüpleri aktarın ve buz üzerinde tutmak.
    3. figure-protocol-31 1-20 saat için 4 ° C 'de karıştırma ucuna uç için bir odanın iç alanında belirlenmiş bir Perspex koruma kalkanının ardında, bir döner cihaz aktarın örnekleri.
    4. figure-protocol-32 Buz üzerinde belirli bir çalışma alanı için örnekleri aktarın.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> mikrosantrifujde (1.000 xg, 1 dak) bayrak-M2 agaroz boncuk bağlı protein aşağı Spin ve bir atık toplama tüpüne süpernatant atın.
    6. figure-protocol-33 1 ml IP yıkama tamponu içinde yeniden süspanse ile proteine ​​bağlı bayrak-M2 agaroz boncuk yıkayın.
      1. IP yıkama tamponu bileşimi: Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 400 mM,% 1 Triton. Ayrıca ko-temizleyici proteaz ile ya da co-temizleyici fosfatazla defosforilasyona bozunmaya duyarlı proteinler için yıkama tamponu içinde proteaz ve fosfataz inhibitörleri önerilir.
      2. figure-protocol-34 Mikrosantrifuj'de proteine ​​bağlı bayrak-M2 agaroz boncuk (1000 xg, 1 dak) Spin ve atık toplama merkezleri haline süpernatant atıntion tüpü.
      3. figure-protocol-35 Yıkama adım 3x tekrarlayın.
    7. figure-protocol-36 Yıkamadan sonra, 1 ml yıkama IP tampon maddesi (25 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, ditiyotreitol (DTT) 2 mM,% 0.02 Triton, beta-gliserofosfat, 5 mM, Na 3 VO 4 0.1 mM) içine boncuklar tekrar süspansiyon.
    8. figure-protocol-37 Mikrosantrifuj'de protein bağlı bayrak-M2 agaroz boncuk (1000 xg, 1 dak) Spin ve bir atık toplama tüpüne süpernatant atın. Tüm aşırı tamponu çıkarın.
    9. figure-protocol-38 40 & m içine süspanse boncuklaru; IP numune SDS yükleme tamponu (Tris-HCl 160 mM pH 6.8,% 2 SDS, 0.2 M DTT,% 40 gliserol, bromofenol mavi 2 mg / ml).
      1. Örnekler hemen analiz veya gizli analizi için -20 ° C dondurucuda saklanabilir.
        1. figure-protocol-39 Radyoaktif örneklerin saklanması için özel bir radyoaktif yonca sembolü etiketli dondurucuda bir perspex kutuda tüp tutucular veya kutulara -20 ° C, yer örneklerinde örneklerin saklanması için.
    10. figure-protocol-40 Perspex kalkanlar arkasında saklanan özel çöp kutularına radyoaktif atıkların bertaraf edin.
  2. figure-protocol-41 SDS-PAGE ve blo üzerinden IP örnekleri çözümlemekPVDF membrana t.
    1. figure-protocol-42 Boncuklar: pelet> 1000 xg'de 1 dakika için 2 dakika ve santrifüj boyunca 95 ° C'ye kadar yükleme tamponu içinde ısı örnekleri.
    2. figure-protocol-43 Bir perspex ekran arkasında radyoaktivite bankta protein jel elektroforezi modülü hazırlayın.
    3. figure-protocol-44 A% 3-8 tris-asetat, SDS-PAGE jelleri üzerine yük örnekleri.
      1. Jel Bu tip yüksek moleküler ağırlıklı (HMW) proteinleri çözmek için uygundur. Diğer jel tipleri, aynı zamanda, bir% 4-20 Bis-Trisin jel veya Tris-glisin 4-20% jeller gibi, uygun olabilir.
      2. HMW proteinlerin boyutları ayırt etmek uygun olan bir moleküler ağırlık işaretleyici içerir.
    4. figure-protocol-45 1 saat boyunca 150 V'ta elektroforez yapın.
    5. figure-protocol-46 Elektroforezisten sonra, plastik muhafazadan jel kaldırmak ve Western lekeleme yolu transfer tampon maddesi ile bir kap için jel aktarın.
      1. Western blotting transfer tampon maddesi bileşimi: Tris 50 mM, 40 mM glisin,% 0.04 SDS,% 20 metanol.
      2. figure-protocol-47 Böyle iyi ayırıcılar ve sopalarla jelin alt bölümü olarak sopa jel parçalarını kesti.
    6. 1 dakika boyunca metanol içinde daldırılarak jel başına bir poliviniliden florür hazırlayın (PVDF) membran, daha sonra transfer tampon maddesi içinde yer.
      1. Membranlar s kesilir jel artı 3 mm kenar olarak ame boyutu.
    7. Radyoaktivite bankta yarı-kuru emme modülü yerleştirin ve kapağını ve üst elektrot plakasını çıkarın.
    8. figure-protocol-48 Yarı-kuru blotlama modülünün yüzeyinde blot sandviç hazırlayın.
      1. Lekeleme modülün alt plaka üzerine transfer tampon ve yerine filtreyi lekeleme (7.5 x 10 cm geniş, kalın 2.5 mm) bir ekstra kalın ıslatın.
      2. figure-protocol-49 Blot filtresi üzerindeki önceden ıslak PVDF membran yerleştirin.
      3. figure-protocol-50 Dikkatlice PVDF zar üzerinde jel yerleştirilir ve hava kabarcıklarını çıkarmak.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> kurutma modülünün alt plaka üzerine transfer tampon ve yerinde ekstra kalın bir lekeleme filtresi ıslatarak leke sandviç tamamlayın. Tüm havayı çıkarın blot sandviç sonunda mevcut kabarcıklar.
        Burada verilen açıklama elektrotlar proteinler membran üzerine aşağıya doğru göç şekildedir BioRad trans-leke SD sistemi ile uyumlu olduğunu unutmayınız. Diğer kurutma sistemleri, aynı zamanda, bu sonuçta dikkate bir lekeleme yöne çekmek için gerekli ya da, tank blotting, yukarıda elektroforez tamponu ile aynı şekilde bertaraf edilmesi için ilave sıvı atığın durumunda olduğu gibi küçük uyarlamalarla bu adımlar ile uyumludur.
    9. figure-protocol-51 Emici bir doku ile tüm fazla tamponunu çıkarın ve üst plaka ile yarı-d kapağı yerleştirmek ry blot modülü.
    10. figure-protocol-52 1-2 saat süre ile 15 V de proteinleri aktarın.
    11. figure-protocol-53 Bu süre boyunca, elektroforez modülünü temizlemek.
      1. figure-protocol-54 Perspex kalkanlar arkasında saklanan özel çöp kutularına radyoaktif atıkların bertaraf edin.
      2. figure-protocol-55 Damıtılmış su (AD) ile elektroforez modülü durulayın ve radyoaktif sıvı atık konteynerine durulama suyunu atın.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> transferinden sonra, lekeleme modülü lekelenen proteinler ile PVDF membran kaldırmak.
    13. figure-protocol-56 İsteğe bağlı: proteinleri görselleştirmek için lekelenen proteinler, Ponceau S boyama yapar.
      1. figure-protocol-57 Ponceau S çözeltisi içeren basit bir leke inkübasyon kabına transfer leke ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
      2. figure-protocol-58 MS hızlı 2x durulayın.
    14. figure-protocol-59 Membran kurutun.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> otoradyografisim gerçekleştirin.
    1. figure-protocol-60 1-5 gün için bir fosforesans plakaya membran Açığa.
    2. figure-protocol-61 Eşdeğer bir Fırtına 840 yakamoz tarayıcı kullanarak veya maruz fosforesans plaka kapalı 32P okuyun ve yüksek çözünürlüklü TIFF olarak kaydetmek.
  4. figure-protocol-62 İmmuno yoluyla protein seviyesini algılar.
    1. figure-protocol-63 Metanol içine batırılarak ile membranlar rehidrate, sonra PBS ile basit bir leke inkübasyon kabına transfer.
    2. figure-protocol-64 % 5 süt ihtiva eden (% 0.1 Triton ile PBS) PBS-T içinde bloke membranlar.
    3. figure-protocol-65 Uygun yıkama adımları ve ikincil antikor inkübasyon anti bayrak antikor ve süreci daha da anti-LRRK2 antikor 13,16 veya lekelerini kuluçkaya yatmaktadır.
    4. figure-protocol-66 LRRK2 göreli protein düzeylerini onaylamak için chemilüminesan algılama gerçekleştirin.
  5. LRRK2 32 P katılmasını ölçmek.
    1. Böyle ImageJ yazılım, Milli INSTIT mevcut ücretsiz bir program olarak uygun yazılım kullanarak leke otoradyogramlar ve imünoreaktivitenin üzerindeki bantların dansiyometrik analizi yapınSağlık web sitesi utes ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Imünoreaktivite seviyesinin üzerinde otoradyografik sinyalinin oranı olarak dahil fosfat seviyelerini hesaplar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyon düzeylerini karşılaştırmak amacıyla, 3xflag LRRK1 etiketli ve LRRK2 HEK293T hücrelerde 15 olarak ifade edildi. Hücreler, 6 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi ve 32 P ile etiketlenmiş ve protokol metinde yukarıda tarif edildiği gibi analiz edildi. Şekil 1, HEK293T hücrelerinde LRRK1 ve LRRK2 metabolik etiketlenmesi için temsili sonuçlar gösterilmektedir. Radyoaktif fosfat birleşme LRRK1 ve LRRK2 her ikisi için gözlemlenmiştir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, 32 P-ortofosfat ile metabolik etiketleme kullanılarak hücre hatlarında LRRK1 ve LRRK2 genel fosforilasyonu seviyesinin tahlil için temel bir protokolü sağlar. Genel bir strateji basittir. Affinity LRRK proteinler 32 P-ortofosfat içeren ortama maruz kalan HEK293T hücrelerinde ifade edilmiştir etiketlendi. 32 P-ortofosfat sadece birkaç saat inkübasyon ve fosfatlar içeren hücre içindeki tüm molekülleri sonra hücreler tarafından asimile edilir ve böylece radyoaktif olarak etiketl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz de bu çalışmayı destekleyen Michael J. Fox Vakfı'na müteşekkiriz. Flanders FWO (FWO proje G.0666.09, JMT kıdemli araştırmacı bursu), IWT SBO/80020 proje Nöro-TARGET, KU Leuven (OT/08/052A ve IOF-KP/07 / 001) - Biz Araştırma Vakfı'na teşekkür verdikleri destek için. Bu araştırma aynı zamanda JMT için King Baudouin Vakfı tarafından yönetilen Fon Druwé-Eerdekens tarafından kısmen desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfor-32 Radyonüklid, 1 mCi, 1 ml su içinde tampon disodyumfosfatPerkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’ s Modifiye Eagle Medium (D-MEM) (1X), sıvı (yüksek glikoz)Invitrogen11971-025Bu besiyeri fosfat içermez
Anti Flag M2 afiinty jelSigmaA2220Kırmızı renkli jel içeren eşdeğer bir ürün için (boncukları daha kolay görselleştirmek için kullanışlıdır), kedi kullanın. Hayır. F2426.
Ekstra kalın kurutma filtresiBio-Rad1703965
Ponceau S solüsyonuSigmaP7170

Kaynaklar

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158(2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472(2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16(2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153(2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

LRRK1 LRRK2İmmünopresipitasyonSDS-PAGEOtoradyografiWestern BlotHEK293T HücreleriFosforilasyon AnaliziRadyoizotop Tespiti
Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.