In Cross Sahne Yöntemleri Setaris viridis'in Yeni Bir Model Sistemi

Özet

Biz Setaris viridis'e (S. viridis) haçları gerçekleştirmek için bir metodoloji geliştirdik. Yöntem, uygun bir polen öldürmek için önce bir sıcak su tedaviye salkım budama içerir. Haçlar iyi-kontrollü bir büyüme rejimi aşağıdaki gerçekleştirilen ve genellikle 1 tohum / s salkımda başına çapraz tozlaşma 7 kurtarma neden vardır.

Özet

Setaris viridis'in C ₄ otların için gelişmekte olan bir model sistem. Yakından biyoenerji yem stoku switchgrass ve tahıl ürün tilki kuyruğu darı ilgilidir. Son zamanlarda, tilki kuyruğu darı, S. 510 Mb genom italica, ^1,2 sıralı ve çelimsiz göreli S. 25x kapsama genom dizisi olmuştur viridis sürüyor. S. viridis bunun hızlı bir nesil zaman, küçük boy, basit büyüme gereksinimleri, üretken tohum üretimi ³ ve geçici ve sabit dönüşüm ⁴ için geliştirilen sistemler de dahil olmak üzere bir potansiyel mükemmel bir model genetik sistemi yapmak özellikleri bir numarası vardır. Bununla birlikte, S. genetik viridis nedeniyle haç gerçekleştirmek için detaylar yöntemlerinin eksikliği, kısmen, büyük ölçüde keşfedilmemiş olan. Bugüne kadar, hiçbir standart protokol kontrollü haçlar tohumlarının hızlı üretime olanak olacağı kabul edilmiştir.

Protokol presodaklılık burada S. genetik haçlar performans için optimize edilmiştir viridis, katılım A10.1. Biz emasculation sonra yeni geliştirilen çiçeklerden kaynaklanan tohumlarını ortadan kaldırmak için 20-30 çiçeği ve çiçek etiketleme korumak için salkım budamadan sonra emasculation için ılık su ile basit bir ısı tedavisi istihdam var. Ilımlı sıcaklıklarda ısıl işlem, bir dizi test edilmesi ve daldırma süresi değişen sonra, 3-6 dakika için bir optimum sıcaklık ve 48 ° C arasında bir zaman aralığı kurduk. Bu yöntemi kullanarak, 15 haç en az günde bir tek bir işçi tarafından yapılabilir ve salkımda başına 3-5 outcross döl arasında bir ortalama geri kazanılabilir. Bu nedenle, 45-75 outcross döl arasında bir ortalama bir gün içerisinde tek bir kişi tarafından üretilebilir. Bu tekniğin geniş uygulama S. rekombinant kendilenmiş hat nüfus gelişimini kolaylaştıracaktır viridis X S. viridis veya S viridis X S. italica, se dökme yoluyla mutasyonlar haritalamagregant analizi ve genetik analiz için yüksek mertebeden mutantlar yaratıyor.

Giriş

S. viridis yakından biyoenerji besleme stok switchgrass (NAD-ME alt tipi), tahıl ürün tilki kuyruğu darı ve tarım ot beç çim ⁵ ile ilgili bir NADP-ME alt C ₄ çim olduğunu. Setaria, S. ekili formunun 510 Mb genom italica, son ^1,2 dizilenmiş ve ıskarta nisbetle, S. 25x kapsamı genom sekansı edilmiştir viridis, devam (yayımlanmamış). S. viridis bunun hızlı bir nesil zaman, küçük boy, basit büyüme gereksinimleri ve üretken tohum üretimi dahil olmak üzere ^3. bir potansiyel mükemmel bir model genetik sistemi yapmak özellikleri bir numarası vardır. Önemli olan, son şekli S. geçici ve kararlı dönüştürülmesi için geliştirilmiştir transgenik bitkiler ⁴ oluşturmak için fırsat sağlamak viridis'in. Bununla birlikte, S. genetik araçlar gelişiminde önemli bir darboğaz viridis onun recalc olduğunuoutcross için itrance. Bugüne kadar, standart bir protokol kontrol melezlerinden tohumların üretimine izin hızlı olacağı yayınlanmıştır.

S. Genetik haçlar italica genellikle çiçek ^6,7,8 gelen anterlerin çıkarılması yoluyla ya da kadın anne ^9-11 çiçek ısıl işlem yoluyla emasculation tarafından yapılmaktadır. Bu tedaviler, anterlerdeki veya non-işlenmiş çiçek Panicles aşağıdaki / erkek anne hafifçe polen serbest stigmas karşı aşındırılmaktadır. Emasculation yılında, anterler çiçekçik açar ve anter exsert başlıyor hemen sonra ince forseps kullanarak kaldırılır, ancak henüz polen ^6-8 döken değil. Bu son bahsedilen yöntemin başka sorunlar arasında çiçek açma ve polen dökülmesi arasında dar bir zaman aralığında yumuşatma yerine güçlüğüdür. Tek bir çiçek açma ve kapama süresi katılım ve çevre koşullarına bağlı olarak değişir, ve 7 dakika arasında olabilir ^{6 S. 12 saat, 2.5 italica. Anterler çiçekçik itibaren exsert olarak polen dökülme oluşur yana, anterler dikkatli ve hızlı bir şekilde kaldırılması gerekir, ve bu nedenle, nedeniyle kendini tozlaşma kirlenmesini önlemek zordur. Tozaklamalar emasculation hemen sonra yapılır ek olarak, günde / kişi başına yapılabilir haçlar sayısı sınırlıdır.}

Alternatif bir yöntem olarak, olgun salkımları ısı-öldürmek Panicles çok sayıda haç yerine avantajı ile polen tanelerini ^9,10,13,14 gelişmekte ılık suya batırılmış olabilir. Fakat, ısıl işlem sıcaklığı ve süresi, farklı deneyler için (20 dakika ¹⁰ 10 dakika ¹⁴ ve 42 ° C, örneğin 47 ° C) arası değişir. Bundan başka, ısı aracılı emasculations etkinliği üzerinde herhangi bir sistematik analiz yayınlanmıştır. S. genetik haç gerçekleştirmek için Böylece, standart ve basit bir yöntem viridis ölçüde S. genetik kaynak geliştirme ve kuruluş hızlanacak araştırma toplum içinde bir model sistem olarak viridis'in.

Biz S. genetik haçlar gerçekleştirmek için standart bir protokol geliştirme ve optimizasyon rapor viridis. Bitkiler çiçek gelişimini senkronize ve prosedürün tekrarlanabilirliği arttırmak için kontrollü ortamlarda altında yetiştirilir. Aşan bir transgenik S. kullanılarak yapılmaktadır Başarılı kontrollü genetik haçlar tanımlanmasını kolaylaştırmak için GUS raportör genini içeren ⁴ erkek ebeveyn olarak viridis'in hattı. GUS transgen hemen hasat sonrası F1 tohumu puanlama sağlar ve böylece emasculation ve polenleşme etkinliğini belirlemek için kolay bir kalitatif analizi sağlayan bir pirinç ubikutin promotör ile tahrik edilir. Biz emascula olmuştur çiçek etiketleme eşliğinde emasculation için ılık su ile basit bir ısı tedavisi istihdam varted emasculation sonra yeni geliştirilmiş çiçeklerden elde edilen tohum ortadan kaldırmak için. Ilımlı sıcaklıklarda ısıl işlem, bir dizi test edilmesi ve ılık suda daldırma süresi değişen sonra, 3-6 dakika ila 48 ° C'lik bir optimum sıcaklık ve zaman süreleri kurduk. Bir şafaktan soğuk tedavi çapraz tozlaşma kolaylaştırmak amacıyla her iki ebeveyn de senkron anthesis'e teşvik bulundu. Biz de diğer setaria katılımların için protokol ve bu yöntemin gelecekte uygulamasında önemli adımlar tartıştık.

Protokol

1.. S. büyüme viridis

1. 31 ° C/22 ° C (gündüz / gece) 8:30-09:00 15 ° C ön-şafak tedavi ile, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık,% 50 bağıl nem için büyüme odası koşulları belirlemek AM. (Şekil 1). Bu koşullar altında, S. viridis A10.1 tohum ekim den anthessiten yaklaşık 21-22 gün sürer.
2. Metro Mix 360 daire (4 x 9 hücreleri) doldurun ve sulama için tek bir hücreyi kaldırmak.
3. Toprak yüzeyine hafifçe sis su.
4. Toprak, hücre başına tek bir tohum yüzeyinde tohum ekmek.
5. Bir toprak tabakası ile tohum kapağı (yaklaşık 0.5 cm)
6. Alttan toprak ve su daireleri yüzeyini sis. Tohum ekiminden sonra alttan sulama tutun.
7. En az üç bitki yapılacak her çapraz kadın anne ve dokuz bitkiler olarak kullanılacak için erkek ebeveyn olarak kullanılacaktır. Tohum ekim tüm bitkilerin aynı gün çiçek olmayacak şekilde şaşırtmalı olmalıdır. Tohum SOWIng, üç günlük bir süre boyunca her gün önerilir.
8. Bitkiler 1-2 kez, bitkiler ve toprak durumun büyüklüğüne bağlıdır bir gün, su. Toprakta fazla su bitkilerin optimum büyüme için uygun değildir, ve toprak ve yaprak dokusunun hasar mantar büyümesine yol açabilir.
9. Jack 15-16-17 100 ppm'lik bir konsantrasyonda kullanılarak, haftada iki kez bitkileri gübreleyin.

2. Budama ve emasculation önce salkım Etiketleme - 1. Gün

1. Polinasyondan önce öğleden sonra veya akşam, laboratuara büyüme odasına gelen bitkiler taşımak (Sıcaklık (T): 24.06 ° C 21.79% 1.15% ± 0.13 ° C, bağıl nem (RH) ±).
2. Birincil salkımları zaten yeşerdi salkımda çiçek 1/3 1 çiçek zorunda seçin.
3. Aşağıdaki gibi, bu çalışmada, salkımda içinde dört etki tanımlanmıştır (Şekil 2A, ucu, distal orta, proksimal, orta ve baz).
4. İdeal olarak, choosyeşerdi 1-5 çiçeklerle adet salkım, salkımda (distal ucu) ucu kesilmiş, ve yaylı makas veya ince forseps kullanarak proksimal orta ve taban bölümlerinde tüm çiçekler kaldıracaktır.
5. Bir salkım yaklaşık 1/10 yeşerdi çiçekler 1/5 varsa, ucu kesilmiş ve sadece daha düzeltmek için distal, orta ve proksimal orta üst bölümünün alt kısmını korumak, salkımda tabanından çiçek Döşeme.
6. Bir salkım yaklaşık 1/4 yeşerdi çiçekler 1/2 varsa, distal orta bölümünü kesti ve sadece daha fazla düzeltme için yakın orta bölümünü korur.
7. Hafifçe kıllar trim cerrahi makas kullanın.
8. Yeşerdi ve tüm olgunlaşmamış çiçek eşit bölgede dağıtılan yaklaşık 20-30 çiçekler / salkım (Şekil 3) bırakarak tüm çiçekleri sökün. , Olası ısıya karşı hasar çiçeği korunması amacıyla tozlaşma edilecek bölgede kılların muhafaza edilmesine dikkat uygulama.Her başakçık için, en üst olgun floret korumak. En üst floret tozlaşma (Şekil 2B) zamanında anthessiten daha yüksek bir olasılık vardır.
9. Kırmızı kalıcı bir kalem ile her çiçeğin bir tarafını işaretleyin ve salkımda (Şekil 2B) hakkında florets sayısını kaydedin.
10. Emasculation, süresi ve emasculation gerçekleştirildiği sıcaklığın tarihi: aşağıdaki bilgileri bayrak salkım.
11. Salkım kesilmiş sonra, ana salkımda geliştirilmesi için daha fazla kaynak yeniden dağılımını sağlamak için her bir bitkinin bütün tillers çıkarın.

3. Sıcak Su daldırma ile emasculation - 1. Gün

1. Isı tedavisi için 0.1 ° C ± 48 ° C su banyosu ayarlayın.
2. Yavaşça kesilmiş Panicles viraj ve 3-6 dakika boyunca 48 ° C'de sıcak su ile onları daldırma. Salkımda sapını kırmak için değil dikkatli olun.
3. 3-4 salkımları Toge batırılmış olabilirOrada bir zamanda, ısı düzgün dağıtımı için Panicles arasında yeterli boşluk bırakılmıştır. Bu ısıl işlem sırasında sıcak su içinde tüm salkım daldırın gereklidir. Bayrak yaprak (yaprak salkımda için besinleri sağlar salkım subtending) yaprak dokusu ısı hasarını önlemek için sıcak su ile temas etmemelidir.
4. Emasculation istenilen süre için bir kez yapılır, su banyosundan Panicles çıkarıp hafifçe salkımda gelen suyu silkeleyin.
5. Tamamen hadım salkım kapak ve bir bükülme-kravat ile sabitlemek için özel bir mikro-delikli ekmek torbası koyun. Mikro-delikli ekmek torbası salkımda büyüklüğüne göre özelleştirilebilir (video dahil).
6. Ertesi gün kadar geri büyüme odasında bitkiler yerleştirin.

4. Emasculation sonra Geçişi / tozlaşma - Day 2 ve 3. Gün

1. 2 gün ve günde 3 saat 9:00 am, kadın (hadım) Mal ve hareketlaboratuara büyüme odasına e anne haçlar gerçekleştirmek için (T: 1.15% ± 21.79%: 24.06 ° C 0,13 ° C, RH ±).
2. Gözlemleyin ve yeşerdi veya kırmızı kalıcı bir kalem kullanarak çiçeklenme çiçekler başka bir kırmızı nokta ekleyin. Salkımda başına yeşerdi çiçek sayısını kaydedin.
3. Haçlar yapılır ne izlemek için tozlaşma tarih ve etiketi üzerindeki erkek ebeveynin adını kaydedin.
4. Erkek ebeveynlerin anthessiten zirve süresine uyulmalıdır. Odamızın koşullar altında (Şekil 1) erkek ebeveynin Panicles çiçekler 10:10 civarında eşzamanlı açılmasını başlar. Çiçek açma zaman, anterler ve polen salım exsertion tam 20 dakika sonra meydana gelir.
5. Tozlaşma için ideal aşama erkek ebeveynin polen salındığı aşamasıdır. Çiçekler polen sürümden 20 dakika sonra kapanacak. Bu nedenle, anthessiten için süresi akış açıklığının süresi yaklaşık 40 dakikadırers. Çiçeğin sonra yaklaşık 30 dakikalık bir süre boyunca kahverengiye sarımsı beyaz polen rengi değişir kapatır.
6. Sarımsı beyaz anterler erkek ebeveynin çiçekler üzerinde görünür hemen sonra tozlaşma başlayın. Döllemeden üç tekniklerinden birini kullanarak, 2. günde ve 3. günde gerçekleştirilir:
   1. Salkım-to-salkımda tozlanma: erkek gibi bir müstakil salkım kullanarak, yavaşça tozlaşma kolaylaştırmak için hadım salkımda birlikte salkım ovmak ve kontaminasyonu önlemek için erkek salkım atın. Her hadım salkım 2-3 Panicles tarafından tozlaşma edilene kadar tozlaşma işlemini tekrarlayın.
   2. Anter-to-damgalanma tozlanma: forseps sarımsı beyaz antherler çiçeklenme bir çiçek almak ya da anter almak ve fiziksel olarak dişi ebeveyn üzerinde çiçek stigma dokunun kullanarak. Hadım salkımda tek çiçek döllemek için erkek ebeveynden bir çiçek kullanın. Tozlaşma p tekrarlayınrocess hadım salkımda her damgalanma kadar birkaç (2-3) çiçekler / anterleri tarafından tozlaşma olmuştur. Bir büyüteç siperliği giyen tozlaşma gerçekleştirmek için daha iyi görünürlük verecek.
   3. Farklı erkek ebeveynlerin döllemeden arasında, carry-over farklı haçlar arasında polen nedeniyle kirlenmesini önlemek için Kimwipes ile silerek, ardından% 95 etanol içinde forseps daldırma.
   4. Salkım bağlayıcı: emasculation sonra, ertesi gün çiçek açacak erkek ebeveyn 3-4 Panicles seçin. Bir bükülme-kravat kullanan kadın ebeveynin hadım salkımda birlikte bunları bağlamak. Biraz erkek ebeveynin salkımda altında hadım salkım yerleştirin. Panicles üzerinde saydam çantası yerleştirin ve bir ataş ile üssünde çanta sabitleyin. Erkek ebeveynin salkımları anthesis'e başladığınızda bu gün 2 tamamlanmış olabilir.
   5. Günde 2 ve 3. günde, fiske veya facil glasin çanta sallamak sabahı çiçeklenme süresindeitate tozlaşma. (: 00:00 09:00-11 arası) sabah anthessiten tüm süresi boyunca her 15 dakikada bir fiske veya Panicles sarsmaya devam ediyor. Tozlaşma sonra erkek ebeveynin Panicles çıkarın ve hadım salkımda üzerinde yeşerdi çiçek karşı tarafını etiket. Her kadın ebeveynin salkımda üzerinde yeşerdi çiçek numarasını kaydedin.
7. Tozlaşma yapıldıktan sonra, dişi ebeveynin salkım kapağı ve tohum hasat kadar tozlaşma sonra bir bükülme-kravat kullanarak üssünde sabitlemek için özel bir mikro-delikli ekmek torbası koyun.

5. Tohum Hasat

1. Tozlaşma günden itibaren 2 hafta (14-16 gün) sonra hasat tohumları. Tohumların aynı torbaya etiketi yerleştirin. Her iki tarafta kırmızı işaretler var Tohumlar kontrollü genetik çapraz sonuçlandı tohumlarını temsil eder. Bu outcross döl olması beklenmektedir.
2. Temsil ettikleri gibi, kırmızı işaretler olmadan herhangi bir tohum atınemasculation sonra yeni geliştirilmiş çiçek sonucu tohumları. Sadece bir tarafında kırmızı işaretler ile Tohumlar olasılıkla onlar kontrollü haçlar yapıldı anda çiçeklenme değil gibi kendine tozlaşma sonucu tohum temsil edecek.
3. Bir tohum kurutucu içinde 2 gün boyunca 30 ° C 'de kuru tohumları. Laboratuarda mağaza kurutulmuş tohumları (T: 24.06 ° C 0,13 ° C, RH ±: 1.15% ± 21.79%) veya bir tohum odasında (T:% 20 ±% 1: 4.0 ° C 1.0 ° C, RH ±).

Sonuçlar

Bu çalışmada, dizilenmiş S. el dişi ebeveyn, ve bir transgenik S. olarak viridis'in katılım A10.1 Tüm döllemeden için erkek ebeveyn olarak GUS raportör genini ihtiva eden ⁴ viridis hattı (ayrıca A10.1). Optimize edilmiş bir büyüme rejimi, Şekil 1 'de gösterildiği gibi çiçekli senkronize etmek için kullanıldı. Biz emasculation için ısıl işlem sıcaklığı ve süresi çeşitli kombinasyonları test edilmiş ve ^kalan, 3. gün (Şekil 2) üzerine serpildi sırasında hadım salkımda tutulan çiçekler yaklaşık% ^40-80, 2. günde bloomed olduğunu gözlemledik. Isıl işlem çok şiddetli olduğunu, ancak, bir örneğin, 4 çok az dakika, ya da hiç çiçekler için 49 ° C ^2. gününde yeşerdi. Çapraz tozlaşma 2 ^nci ya da erkek ebeveynlerin anthessiten zirve zamana bağlı olduğunu emasculation sonra ^3. gününde gerçekleştirildi.

Bu gözlemler oldu, genç çiçekler emasculation sonra geliştirmeye devam ettiğini ed olgunlaştı ve 3-6 gün sonra kontrol tozaklamalar kendine tozlaşma. 7-10 gün polinasyondan sonra, beyaz renkli çiçekler salkımda görülebilir. Bu beyaz çiçekler nedeniyle ısı hasarı veya kötü tozlaşma birine döllenmemiş edilir. Aynı zamanda, başarılı bir şekilde poline edilmiş olan çiçekler karanlık tohum taşıyan ve 14 gün sonra başlamak yıkıcı başlar. Döllenmeden sonraki ^14. günde hasat kırmızı işaretler ile kara tohumlar açıkça hala yeşil ve paramparça etmedi kırmızı işaretler olmadan tohumlarından ayırt edilebilir. Hasat gecikirse, hem de ve kırmızı işaretler olmadan tohumların anthecium zor hızla hasat havuzlarda kırmızı işaretlerle tohumları ayırmak için yapar, hangi karanlık çevirmek.

Tablo 1 'de özetlendiği gibi geçiş kuralı çeşitli ısı işlemi deneyler gerçekleştirilmiştir optimize etmek. Bir ortalama0-10 tohum / salkım çeşitli ısıl işlem deneylerden elde edildi. Ürünün toplanmasından sonra, tohumlar, bir anthecium sökücü kullanılarak anthecium uzaklaştırılması, ardından bir tohum kurutucu içinde 2 gün boyunca 30 ° C'de kurutuldu. Anthecium uzaklaştırıldıktan sonra, farazi F1 tohumları GUS boyama çözeltisi ile boyanmış ve bu outcross döl 1-2 saat (Şekil 2F), mavi renk boyanmıştır. Bu sonuçlara dayanarak, 3-6 dakika boyunca 48 ° C arasında bir ısı işlemine önerilir. Ayrıca, haçlar emasculation ertesi gün 2 ve 3. günde hem yapılmasını öneririz.

Diğer Setaris katılımların veya türler ile haç yerine, bu tekniğin etkinliğini incelemek, S. arasında haçlar viridis A10.1 ve sekiz farklı S. Bağlanma viridis ve bir S. pumila katılım yapıldı. Gün katılımları arasında çeşitli çiçekli rağmen bulduğumuz her sekiz S. çiçekler Bağlanma viridis ve bir S.pumila katılım predawn soğuk tedaviden sonra 10:20-11:00 zirvede açılış saati ile 10:00-11:00 arasında açılış başlar. Bu predawn soğuk tedavi çeşitli Setaria katılımların uygulanabilir olduğunu gösterir. 5-6 dakika boyunca 48 ° C'lik bir ısı işlemi S. hadım için kullanılmıştır gerçekleştirilen tüm haçlar için dişi ebeveyn olarak kullanılmıştır viridis'in A10.1. Biz, A10.1 ve çeşitli S. üç kırmasına 12 tohumlara bir kurtarıldı viridis katılmalar ve S. arasında tek bir çapraz altı tohumlar viridis A10.1 ve tek bir S. pumila katılım. Bu tohum başarılı bir yoklama melezi kaynaklanan ya da kendini kirlenme sonucu olsaydı Ancak, şu anda biz henüz belli değil. Ne olursa olsun, bu ön sonuçlar, S. için kullanılan büyüme koşulları viridis A10.1 çeşitli S. ile haç oluşturmak için kullanılabilir viridis katılmalar ve muhtemelen Setaria diğer türler.

Sıcaklık ısı tedavisi (° C)	Zaman ısı tedavisi (dk)	# Haçlar	Ort. Döşeme sonra çiçek #	Tozlaşma Günü (emasc gün sonra)	Ort. # Tohumlar (kırmızı) / salkım (ortalama)	Ort. % Gus (+) / tohumlar (kırmızı)	Ort. # HYB tohumları (Gus +)	Min # tohumları HYB	Max # HYB tohumları
47	10	2	27	2. gün	0	0	0	0	0
48	3	3	36	2. gün	5	60	3	1	5
	4	3	25	3 gün	10	50	5	3	7
	5	8	25	2. gün	5	60	3	1	6
	6	3	25	2. gün	4	75	3	0	4
	7	4	24	2. gün	3	33	1	0	4
	7	1	25	3 gün	4	75	3	N / A	N /A
49	1	3	23	2. gün	5	25	1	0	2
	2	7	26	2. gün	8	25	2	0	4
	3	5	22	2. gün	0	0	0	0	1
	4	4	25	2. gün	0	0	0	0	0

Tablo 1. Emasculation için ısıl işlem optimizasyonu. Isıl işlem sıcaklığı ve süresi hem de değiştirme sonuçları. Tozaklamalar emasculation ve başarılı çaprazlamalar s müteakip bir ^(2. gün) ya da iki gün ^(3. gün) yapıldıGUS boyama nüveli

Şekil 1. Bir şafaktan soğuk tedavisi. Sıcaklık ve çiçek üretiminin optimal büyüme ve senkroninin için süreler ile optimize büyüme odası koşulları gösterilmiştir. Yeşil ve kırmızı oklar sırasıyla, haçlar ve emasculation gerçekleştirmek için uygun bir pencere gösterecektir.

Şekil 2. Çaprazlama ve outcross döl GUS boyama için salkım hazırlık. Yaklaşık 1/10 açıldı çiçek gösteren, kesimden önce Sefaria viridis A10.1 (A) A salkım. Salkımda boyunca anthessiten ilerlemesinde dört bölümleri ve yön gösterilir. (C) Bir hadım salkım. (D) Bir hadım salkım AM). (E) erkek ebeveyn bir β-glukuronidaz (GUS taşıyan (transgenik Sefaria viridis A10.1 hattı A salkım) şafak tedavisi (resim 10:30 çekilmiş) sonra çiçeklenme raportör geni). A E ile, çubuk ölçeği =% 70 (v / v) etanol içinde distaining, ardından 2 saat boyunca GUS boyama sonra 1 mm. (F) Putatif outcross soy. Sağdan iki tohum negatif ve pozitif kontroller, sırasıyla.

Şekil 3,. Protokol şeması Akış m şematik bir temsiliS. gerçekleştiren yer ajor adımlar viridis haçlar.

Tartışma

Şafak tedavinin önemi

Outcross döl yüksek bir frekans elde etmek için bu erkek ve kadın ebeveynlerin yüksek senkron anthesis'e olması esastır. Başlangıçta, sıcaklık ve ışık rejimleri sağlanıncaya (31 ° C/22 ° C, gündüz / gece) ve S. kullanılan Tüm döllemeden için viridis'in katılım A10.1. 12:00: sıcaklığı 31 ° C'ye yükselir önce bu şartlar altında, çoğu çiçekler birkaç çiçek açık olsa rastgele 08:00-8 arasında, sabah erken açın. S. Önceki çalışmalar italica günün o zaman gösterir, yer ve sezon anthessiten ^7,15,16 çeşitlilikten katkıda bulunur. Siles vd. ^6. önceki çalışmalarda ^7,15 sonucuna gibi Anthesis, sıcaklık ve nem oranı değişiklikleri ile ilişkili değil, düşük sıcaklık ve yüksek nem ile, başına olduğunu kaydetti. Taklit etmek için: Bu nedenle, (12:00 08:30-9), 30 dakika boyunca 15 ° C arasında bir ön-şafak soğuk tedavi kullanılırdoğal şafak durum. Bu ön-şafak soğuk tedavi ebeveynlerde anthesis'e senkronize destekli. Biz,% 50 bağıl nem seviyesi için ayar haznesi rağmen, haznenin içindeki bağıl nem, sıcaklık 15 ° C ila 22 ° C düştü% 70 üzerinde bir seviyede yükselmiştir ve sıcaklık derecesine kadar% 70 üzerinde kalmaya devam ettiği görülmektedir yavaş yavaş 09:30 sonra 31 ° C'ye yükseldi. 09:00 anda, kadın anne hadım ve erkek ebeveyn bitkileri laboratuara getirilir (T: 1.15% ± 21.79%: 24.06 ° C 0,13 ° C, RH ±). Erkek velilere Çiçekleri 10:10 civarında başlanır ve tozlaşma 10:30-11'de yapılabilir: 12:00. Tüm reaktifler ve ekipman ayrıntılı bir listesini Tablo 2'de verilmiştir.

Emasculation için salkım hazırlama önemi

Bu çalışmada, (Şekil 1) 'de oda koşulları altında, birinci salkım çiçeklenme süresi arasında değişmiştir2-3 gün. Tipik olarak, (Şekil 2A) açık ilk ve açılış öncesinde proksimal ve distalde çiçeklenme uzak ortasında bulunan çiçekler. Salkımda saklandığı çiçek ideal sayı 20-30. Sadece iyi gelişmiş çiçekler (başakçık ¹⁷ üstteki çiçek veya büyük) korunur böylece Dikkat olgunlaşmamış çiçek çıkarılması sırasında alınmalıdır. Çiçeklerin her iki kırmızı işaret ile etiketleme verimli emasculation sonra yeni geliştirilmiş bir çiçek tohumları, varsayılan outcross döl ayırmak için yardımcı olur. Buna ek olarak, geniş ısı hasar çiçeklerini korumak için emasculation önce Panicles üzerindeki kıllar bırakmak için önemlidir, ancak bir seçenek olarak, bir salkım bağlama, özellikle tozlaşma kolaylaştırmak amacıyla yaylı makas kullanılarak emasculation sonra kaldırılabilir tekniği (Şekiller 2C ve 2D) kullanılır.

Optimize edilmiş bir sıcaklıkSıcak su arıtma d tedavi süresi

Sıcak su daldırma yoluyla emasculation için temeli polen stigmatik yüzeyinden daha ısıya daha duyarlı olmasıdır. Ancak, süresi ve ısıl işlem sıcaklığı setaria türler ve katılımların arasında değişebilir. Genel olarak, daha kısa bir tedavi süresi veya daha uzun bir işleme süresi ile daha düşük bir sıcaklık daha yüksek bir sıcaklık emasculation üzerinde aynı etkiye sahip olacaktır. Bu rapor edilmiştir ki, 20 dakika ¹⁰ ya da 10 dakika boyunca 47 ° C'de ¹⁴ işlenen S. boyunca 42 ° C'lik bir ısı işlemi italica polen yaşayabilir olmayan, ancak bu tedavilerin etkinliği tespit edilememiştir. Biz bir tedavi optimize edilmiş sıcaklık ve süresi altında, tüm çiçeklerin polen stigmas açık kalır ise dişi ebeveyn cansız olacak tutulan bu hipotezi aşağıdaki bizim protokol geliştirdik. Ancak, çeşitli sıcaklık etkilerini karşılaştırma ve analiz ettikten sonra veTedavi dönemleri (Tablo 1), biz bu nedenle tamamen kendi kendine döllenmeden kaynaklanan tohum ortadan kaldırmak zordur, ısıl işleme duyarlılık her salkımda tutulan çiçekler arasında farklılık bulundu. Bu tedaviler S. 3-6 dakika boyunca 48 ° C 'de gerçekleştirilen zaman outcross soyu üretme verimi büyük olduğu sonucuna viridis katılım A10.1.

Anthessiten ve çapraz tozlaşma puant

Çiçekler olgunluğa ulaşmak ve açmak üzereyken, anterler sarımsı beyaz renklidir ve polen gibi kısa sürede anterler çiçeklerden ⁸ exsert olarak dökülür. Çiçekler kapatmak başladığınızda polen döken sonra Başçıklar yavaş yavaş kahverengi açmak. Bir kez yayımlanan, polen canlılığı bilinmemektedir. Bu nedenle, kısa sürede erkek ebeveyn açılmasını veya taze açılan çiçeklerden polen kullanmak önemlidir. Bizim oda koşullarında (Şekil 1), flowe çoğunluğu altındaerkek ebeveynlerin rs 10:10 açılmaya başlar ve açılmış çiçekler 10:30 de polen döken. Böylece, tozlaşma gerçekleştirmek için istenen pencere 10:30-11:00 olduğunu. Stigmas yakın çiçeklerden sonra kavuzludur dışında kalır ve polen açık olabilir. Bu, daha önce gözlenen ve S. doğrulanmıştır italica stigmas Siles vd. ⁶ ile yaklaşık 48 saat sonrası çiçek açılması için açık olan, bu nedenle ısıl işlem aşağıdaki çanta Panicles önemli ve kontrollü haçlar yaptıktan sonra olduğunu. Yukarıda tartışıldığı gibi, biz Gün 2 ve 3. Gün sonrası emasculation hem performans tozaklamalar öneririz.

Tozlaşma için yöntemler

Üç tozlaşma teknikleri etkinliğini karşılaştırılmıştır. Çiçeklenme çiçekler sınırlayıcı değilseniz, salkım-to-salkımda tozlanma en verimli bir tekniktir ve outcross döl daha yüksek bir sayı verecektir. Çiçeklenme salkımları, o bir yüksek frekans sınırlayıcı iseanter to-leke yöntemi kullanıldığı zaman, projeni utcross üretilecektir. Biz başarılı bir şekilde hem yöntemlerinden outcross soyu almış. "Bağlayıcı ekspresyona tabi tutulması" yöntemi S. geçiş kullanılmıştır italica ⁶ ama biz erkek ebeveynin polen dökülme için zaman penceresi kısa olan bu yöntem en etkili yöntem olarak bulundu. Ayrıca, daha az tozlanma üzerinde kontrol ve S. üzerindeki kıllar var viridis salkımları da mercek yüzeyine polen hareketini engelleyebilir.

Tohum hasat, kurutma ve depolama

Ürünün toplanmasından sonra, tohumlar, 2 gün boyunca 30-33 ° C'de kurutulur olmalıdır. Gerekirse Anthecium, GUS boyama için kaldırılmalıdır. Tohumlar kuru, serin bir yerde muhafaza edilmelidir (T: 1.15% ± 21.79%: 24.06 ° C 0,13 ° C, RH ±) T (kısa süreli depolama (iki yıldan az) veya bir tohum odasında: 4.0- Uzun süreli depolama için% 20 ±% 1): 10 ° C 1.0 ° C, RH ±.Kötü depolama koşulları, düşük canlılık oranları ⁸ neden olabilir. Biz gözlemledim ki S. çimlenme oranı viridis A10.1 4 gün sonra hasat ekilir zaman, yaklaşık% 5, ancak laboratuar (T% 1.15 ±% 21.79: 24.06 ° C 0.13 ° C, RH ±) muhafaza edildikten sonra,% 90-96 kadar arttırılabilir 110 için gün sonrası hasat Çimlenme kırmak için -80 ° C'de üç günlük bir tabakalaşma izledi. -80 ° C de katlama, kuru tohumlar hava geçirmez bir kapta (örneğin, mikro santrifüj tüpü ya da kapalı bir plastik torba içinde para zarf) yerleştirilebilir ve ekimden önce 3 gün süreyle -80 ° C'de tutulmuştur. Laboratuvarda depolama alanı 16 ay sonra (T: 24.06 ° C 0.13 ° C, RH ±:% 1.15 ±% 21.79),% 90-95 arasında çimlenme yüzdesi yine de elde edilebilir. Buna ek olarak, dinlenmesi kırmak için, tohum hasat sonra 2 gün boyunca 30-33 ° C'de kurutulabilir, ve bundan sonra da bunu takiben -80 ° C'de üç günlük bir tabakalaşma verilmişanthecium önce dikim. Bu işlemlerden sonra,% 33'e varan tohum çimlenme oranları elde edilebilir.

Avantajları, sınırlamaları ve olası değişiklikler

Burada S. haçlar gerçekleştirmek için ilk standart protokol sağlar emasculation için bir ısıl işlem ile viridis A10.1. Fiziksel emasculation aksine, bu protokol daha az invaziv ve bir laboratuar kurmak için nispeten kolaydır. Bu genellikle bir salkım kırpmak için yaklaşık 15 dakika sürer ve yaklaşık 15 salkımları kesilmiş ve / kişi / gün geçilebilir. 3-5 outcross döl / salkımda ortalama varsayarsak optimum şartlarda elde edilebilir, 45-75 outcross döl toplam tek bir günde bir kişi tarafından üretilebilir. Ayrıca, bu teknik, büyük olasılıkla da optimize olacak olsa da, diğer Setaria türlerde geçer uygulanabilir. Büyüme odası alanı sınırlı ise, bitkiler bir şafaktan Akne tedavi edici olmadan yeşil ev veya büyüme odalarında yetiştirilen olabilironlar optimize odacık koşullarına taşınmış önce salkım çıkana kadar tment.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Makas, bahar	World Precision Instruments, Inc	14126
Forseps, Dumostar Biyoloji Cilalı	SPI Malzemeleri	TD5BP-XD
Cerrahi Makas	FST (Güzel Bilim Araçları)	14005-12
Europack Şeffaf Polipropilen Mikro Delikli Kabuklu Ekmek Torbaları 6 "x28"	http://www.pjpmarketplace.com	361001
Flats	T.O. Plastik	715401C
metro karışımı 360	Hommert Uluslararası	10-0356-1
Jack'in 15-16-17	Hommert Uluslararası	07-5925-1
Kimwipes	VWR Uluslararası	34120
Sharpie Ultra İnce Nokta Kalıcı İşaretleyiciler, Kırmızı	Zımba	37002
Donegan DA-10 OptiVisor Kafa Bandı Büyüteç, 3.5x Büyütme, 4" Odak Uzaklığı	Amazon	DA-10, B0015IP380
12"24/7 Paketleme El Darbeli Mühürleyen Isı Yalıtım Makinesi Poli Sızdırmazlık Ücretsiz Eleman Kavrama	Amazon	N/A
su banyosu	VWR bilimsel	Model: 1166
BDW bitki büyüme odasında yürümek	Conviron	BDW 40