Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Özet

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca ^{2 +} gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Özet

Plazma zarı yaralanması sık görülen bir olaydır, ve yaralar hızla hücresel hayatta kalmasını sağlamak için tamir edilmesi gerekir. Ca ^{2 +} akını ~ 30 saniye içinde, plazma zarı üzerinde mekanik yaraların onarım tetikleyen anahtar bir sinyal bir olaydır. Son çalışmalar, memeli hücreleri aynı zamanda gözenek endositoz ardından lizozomal enzim asit sfingomiyelinaz ekzositozu içeren bir ^{Ca2 +-bağlı} işlemde toksinler oluşturan geçirgenleştirmeden sonra plazma zarı kapatın olduğunu ortaya koydu. Burada, söz konusu toksin streptolizin O ile geçirgen hücrelerin tekrar kapatılmasına ^{Ca2 +} akışı üzerinde de hızlı ve bağımlı olduğunu göstermek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Deney tasarımı sağlar: yaralanma olayı senkronizasyon ve görüntüleme ile, plazma membran bütünlüğünü ve lipofilik boya FM1-43 hücre zarları ile ulaştığı ölçüde miktarının hücrelerin yeteneği kesin bir kinetik ölçümü. Bu canlı tahlil also Eksojen yeteneği hassas bir değerlendirmesi plazma membran onarım hücrelerinin yeteneğini yansıtan FM1-43 akışını engellemek için bu tür sfingomiyelinaz gibi çözülebilir faktörler ilave sağlar. Bu deney, bize, enzimin eklenmesi hücre dışı ^{Ca2 +} yokluğunda permeabilize hücrelerin doğru bağlantı teşvik tarihi sfingomiyelinaz, ^{Ca2 +-bağımlı} Ekzositoz aşağı hareket ilk kez göstermektedir bırakıldı.

Giriş

Bu mekanik yaralanma sonrası plazma zarı tamir bir ^{Ca2 +-bağımlı} bir işlem ^1,2 olduğu yıllardır bilinmektedir. Daha sonraki çalışmalarda yara yoluyla Ca ^{2 + 3,4} akışı yeniden kapatılması için gerekli olan yaralanma yerinde okuyun, hücre içi veziküller ekzositozu bir güçlü işlemi tetikler gösterdi. Hücrelerin sitoplazması içine yüklenmiş bir floresan boya kaybı oranı tamir hızını değerlendirmek için kullanılır, ve yeniden mühürleme yaralanma sonrası ⁵ <30 sn içinde tamamlanmıştır sonucuna varılmıştır. İki model başlangıçta plazma zarı tamir ekzositozu için gereksinimi açıklamak için önerilmiştir: lezyonu boyunca Ca ^{2 +} akını geniş bir "yama" oluşturan, hücre içi veziküllerin başlangıçta homotipik füzyon tetikler önerdi 1) "yama" modeli, bu olur daha sonra yara ⁶ ve zar adde önerilen 2) gerilim azaltma modeli tekrar kapatılması için, plazma zarına uygulanmasıyaranın çevresinde Ca ^{2 +-bağımlı} Ekzositoz tarafından d çift-katlı ⁷ doğru bağlantı kolaylaştıran, plazma zarı gerilimi azaltacaktır. Plazma membranı tamir Ca ^{2 +} tetiklenen Ekzositoz rolü ayrıca lizozomlar yaralı hücrelerindeki eksositosizini ve plazma membranı onarım kolaylaştıran bir Ca ^{2 +} sensor molekülü, synaptotagmin VII, içerdiğini gösteren çalışmalar ile takviye edilmiş ^8,9,10,11 .

Ancak, ek delil yalnız ekzositozu plazma zarı tamir teşvik için yeterli olmadığını belirtti. Plazma membranı üzerinde mekanik gözyaşı ek olarak, hücre hasarı sık rastlanan bir şekilde bakteri ^12,13 veya ^14,15 bağışıklık hücreleri tarafından üretilen gözenek oluşturucu toksinler tarafından permeabilizasyon olduğunu. Mekanik gözyaşı farklı olarak, gözenek oluşturucu proteinler, plazma membranı, bir membran "yama" uygulanarak veya reduc basitçe kapatılmalı edilemez bir kararlı, protein kaplı gözenek oluşturucu kendilerini eklemekmembran gerilimi ing. İlgi çekici çalışmalar memeli hücreleri gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra plazma membran onarım için etkili bir mekanizma var, bu işlem, aynı zamanda, hücre dışı ^{Ca2 +, 12} mevcudiyetini gerektirdiğini gösterdi. Mekanik yaralar ⁵ ile gözlemlediği gibi, bu bulgu, hücre yüzeyinde zar gözenek kaldırılması da hızlı bir süreç olup olmadığı sorusunu gündeme. Işlem Ca ^{2 +} hücre dışı gerektirir ve ~ 30 saniye içinde tamamlanır: Şaşırtıcı bir şekilde, bizim son çalışmalar, gözenek oluşturucu toksinlerle permeabilize hücrelerin tekrar kapatılmasına mekanik deliklerinin onarımında çok benzer özelliklere sahip olduğunu ortaya koydu. Daha ayrıntılı olarak, bu işlem incelenmesi, son zamanlarda lizozomların ^{Ca2 +} ile düzenlenen Ekzositoz ek olarak, plazma zarı tamir asit sfingomiyelinaz (ASM), lisosomal enzim salınması tarafından tetiklenen ve esastır endositoz hızlı bir form içerir öğrendik sadece thzar gözeneklerinin e çıkarılması değil, aynı zamanda mekanik yaralar ¹⁶ tamiri için.

Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine kinetiklerini belirlemek için laboratuarımızda biz lazer yaralı izole kas liflerinin ¹⁷ doğru bağlantı değerlendirmek için daha önce kullanılmış olan bir canlı görüntüleme yöntemi uyarlanmıştır. Bu deney, stabil şekilde floresan yoğunluğunda artan lipid iki katmanlı dış sayfada içine intercalates lipofilik boya FM1-43, özelliklerine dayanır. Plazma membranı iki tabakalı plazma zarı hasarı tespit etmek ve ^18,16,19,20 onarmak için hassas bir tahlil sağlayarak, hücre içi membranlara hücre dışı boya erişir bozulduğu zaman. Gözenek oluşturucu proteinler ile geçirgenleştirmeden sonra hücre yeniden birleştirilmesine değerlendirilmesi için bu tahlil uyarlamak için, membran kolesterolünün ²¹ bağlanan bakteriyel toksin streptolizin O (SLO) ile 4 ° C'de hücreler önceden inkübe edilmiştir. Senkron hücrepermeabilizasyon sonra kolayca gözenek oluşumuna neden transmembran konformasyonda oligomerizasyonu ve değişim aktive ısıtılmış bir mikroskop aşamasında, orta ısınmaya buz hücreleri hareket ile elde edilebilir. Bu yaklaşımın bir avantajı, lazer yaralama ile daha önce yayınlanmış çalışmalar boyunca, daha büyük bir hücre sayısı, hücre popülasyonunun daha iyi örnekleme sağlayan, mikroskobik alan eş zamanlı olarak analiz edilebilir olmasıdır. Gözenek oluşturucu toksinler ile mekanik yaralanma ve geçirgenleştirmeden sonra görülen hücre mühürleme işlemi arasındaki mekanik benzerlikler göz önüne alındığında, biz burada açıklamak tahlil plazma zarı onarım temel sürecine dahil faktörleri diseksiyon için çok yönlü ve güçlü bir yöntem sağlar. Bir örnek olarak, bu onarım sürecinin Ca ^{2 +} bağımlı ve bağımsız adımları belirlemek için bu tahlil kullanmak mümkün olduğunu göstermektedir.

Protokol

1.. ASM Transkripsiyonal suskunluğu

1. Tohum 1.5 x 10 DMEM büyüme ortamı içinde 2 ml ⁵ HeLa hücreleri, 35 mm 'lik cam taban yemekler (MatTek) (DMEM yüksek,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin,% 1 Penn-Strep ile glikoz) ve % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
2. Ertesi gün, büyüme ortamı aspire ve siRNA transfeksiyon karışımı ilave edilmeden önce 2 ml DMEM düşük serum ortamında (% 4 FBS DMEM), en az 1 saat ile değiştirin.
3. SiRNA oligo transfeksiyon karışımı boyunca 4 tüpleri hazırlayın. Tüpler A ve C olarak, transfekte edilecek 35 mm tabak başına 250 ul Optimem indirgenmiş serumu ve 4 ul Lipofektamin RNAiMax ekleyin. Tüp B içinde, Optimem 250 ul transfekte edilecek 35 mm tabak başına, kontrol ortamı GC içeriği oligo (Kontrol siRNA) ve serum ve 8 ul (160 pmol), indirgenmiş ekleyin. Tüp D eklemek Optimem 250 ul 35 mm çanak t başına SMPD1 oligo (siASM) ait serum ve 8 ul (160 pmol) azaldıo transfekte edilebilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. Transfeksiyon için kontrol siRNA kompleksi ve ASM siRNA tüpler C ve D tüpleri oluşturulması için A ve B bir araya getirin. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe reaksiyonları.
5. Ilgili 35 mm cam alt yemekleri içine Kontrol siRNA ve ASM siRNA transfeksiyon reaksiyon yavaş yavaş karışımlarını, damla damla ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO ₂ inkübe. 24 saat sonrası transfeksiyon, hafifçe medya aspire ve taze DMEM büyüme medya ile değiştirin. Verimli ASM demonte için, yemekleri daha canlı görüntüleme önce yaklaşık 31 saat (toplam 55 saat) için 37 ° C /% 5 CO ₂ inkübe edilmelidir.

2. Canlı Mikroskopi Ayıraçların hazırlanması

1. Ca ^{2 +} ve ^{Mg2 +} olmaksızın soğuk 1 x PBS içinde 100 ng / ul 'lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici gözenek oluşturucu toksin streptolizin O (SLO) içinde bir çözeltisi hazırlandı. Bu deneylerde kullanılan SLO bir constitutivel olduğukibarca Dr Rod Tweten, Oklahoma Üniversitesi tarafından sunulan aktivitesi için indirgeme maddeleri gerektirmeyen y aktif sistein mutant. Toksin E'de ifade edildi E. coli BL21 DE3 ve daha önce tarif edildiği gibi ^16, yerel koşullar altında arıtıldı.
2. FM1-43 stok solüsyonu hazırlayın: DMSO içinde süspanse FM1-43 liyofilize toz 25 mM çözüm oluşturmak için.
3. Çözelti A hazırlayın: 4 uM (1.5 mi MatTek tabak başına gerekli olan) bir son konsantrasyona kadar Ca ^{2 +} soğuk DMEM FM1-43 stok çözeltisi seyreltilir ve gerektiği kadar buz üzerinde depolanır.
4. Çözelti B hazırlayın: 4 uM (MatTek tabak başına gerekli 1.5 mi) bir son konsantrasyona kadar Ca ^{2 +} ve 10 mM EGTA (Ca ^{2 +} içermeyen DMEM) olmadan soğuk DMEM FM1-43 stok çözelti sulandırarak kadar buz üzerinde saklamak gerekli.
5. Pre-ılık (37 ° C) Eppendorf tüpleri içinde çözüm A ve Çözelti B'nin 1 ml'lik eş payları.
6. Ca ^{2 +} ve C ile DMEM buz çözümler tutun^{2 +} içermeyen DMEM.

3. FM1-43 Tedavi SLO içine Akın ve Tedavi edilmeyen Hücreler Canlı Hücre Görüntüleme

1. , Buz parçaları ile orta boy bir sığ metal kap doldurun buz ile büyük bir cam kap içine ters çevirin ve maruz kalan metal kabın, sadece alt yüzeyini terk ilave buz ilave edin. Hatta termal transfer izin vermek için açıkta kalan metal alt ıslak kağıt havlu yerleştirin.
2. Bir kontrol siRNA tedavi MatTek çanak (Numune 1) alın ve soğuk ıslak kağıt havlu yerleştirin. Yavaşça tüm medya aspire ve soğuk Ca ^{2 +} ücretsiz DMEM ile 3x yıkayın. Son yıkamadan sonra, çanak tüm medya aspire.
3. To görüntü hücreye birleşik FM1-43 no SLO yaralama Ca ² mevcudiyetinde (Örnek 1) ile hücrelerde ^+, 35 mm 'lik cam taban çanak merkez cam lamel soğuk Çözelti B'nin 180 ul ekleyin ve 5 için inkübe dakika buz üzerinde (Tablo 1).
4. 37 ° C'ye kadar ısıtıldı ve (sıcaklık, nem ve _CO2 seviyeleri muhafaza) bir çevre bölmesi ile donatılmış bir konfokal mikroskop sahnede MatTek çanak yerleştirin. 40X NA 1.3 objektif (Nikon) bakarak görüntülenmiş olacak hücre alanını bulun. Varsa, termal sürüklenme düzeltmek için PerfectFocus veya benzer bir cihaz üzerinde açın.
5. Yavaşça 35 mm'lik çanak tarafına önceden ısıtılmış Çözüm A 1 ml ilave edilir ve çevre odası (Tablo 1) ve kapağı yerine takın.
6. (Ultraview Vox Perkin Elmer dönen disk konfokal mikroskopi sisteminde Volocity) uygun görüntüleme yazılımı kullanarak her 3 saniyede 1 kare 4 dakika boyunca görüntü kazanır. FM1-43 Eksitasyon 488 nm bant geçişi ile, bir dikroik filtre kullanılarak bir 488 nm lazer hattı ile gerçekleştirilir ve emisyon ayrımcılık 527 (W55) emisyon filtre kullanımı yoluyla elde edilir. Lazer güç seviyeleri ve kamera duyarlılık 100 milisaniye görüntü pozlama elde etmek için ayarlanır.
7. Tekrar 3,2-3,6 bu adım 3,5 Solution B (Tablo 1) ilave edilmelidir dışında, Ca ^{2 +} yokluğunda hiçbir SLO yaralama (Numune 2) ile kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelerde FM1-43 tespit için yineleyin.
8. Mevcudiyetinde (Örnek 3) veya Ca ^{2 +} yokluğu (Örnek 4), merkez cam lamel SLO ihtiva eden soğuk Çözelti B'nin 180 ul ekle ya SLO yaralandı kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelere FM1-43 akını ölçmek 35 mm'lik cam alt çanak ve aşama 3.3 'de olduğu gibi, buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Tekrar 3.6 ile 3.2 adım, basamak 3,5 (Tablo 1) Çözüm A veya B Çözüm ya ekleyerek ayarlayın.
9. Plazma zarı tamir ASM rolünü belirlemek için, tekrar tüm koşullar (Örnekler 5-8) (Tablo 1) ASM siRNA'nın muamele hücreleri kullanılarak 3,2-3,6 adımları.
10. Üzerinde dışı rekombinant sfingomiyelinaz (SM) rolünü belirlemek için(FM1-43 akını inhibisyonu ile gösterilmiştir), plazma membran onarım kinetiği (Örnekler 9-10), SM ilave aşama 3,5 (0-50 μU) için çözelti A ya da B solüsyonu ve daha sonra canlı hücre sırasında hücrelere ilave edilir 1 ml (Tablo 1) bir toplam hacim içinde görüntüleme.

4. Hücreler içine FM1-43 Akın miktar tayini

1. Filmler elde edilmiştir sonra, görüntü analiz yazılımı (Volocity Suite, PerkinElmer) kullanılarak FM1-43 hücre içi floresan yoğunluğunu ölçmek. Alanında her hücrenin sitozolik bölgede ilgi bir bölgeye çekmek ve video tüm çerçeveler boyunca ortalama FM1-43 floresan yoğunluğunu belirlemek için yazılım araçları geçerlidir.
2. Başlangıç ​​FM1-43 boyama farklılaşmaların ayarlamak için, her bir görüntü için veri zaman, flüoresan yoğunluğundaki kat artış olarak ifade edilir ve her biri farklı bir durum için grafiğe geçirilmiştir. Her bir zaman noktasında her bir bölgesinin floresansta kat artışF _T hücre spesifik bir zaman noktasında ortalama floresan olan _T F / F ₀ olarak hesaplanan, F ve _0, t = 0 (Şekiller 1-2) de ortalama floresan olmasıdır.

Sonuçlar

Lizozomal asit sfingomiyelinaz tükenmiş hücrelerde bakteriyel sfingomiyelinaz (SM) kurtarma plazma zarı onarımı düşük konsantrasyonları.

FM1-43 görüntüleme deneyi kullanılarak, daha önce Ca ^{2 +} mevcudiyetinde yaralama lizozomal enzim ASM eksikliği olan ve SLO maruz kalan hücreler, plazma zarı kusur yeniden birleştirici insan enzimi ¹⁹ hücre dışı eklenmesiyle kurtarılır sahip olduğunu göstermiştir. İnsan ASM lızozomal düşük bir pH optimumuna sahip olduğu için, biz yeniden m...

Tartışma

Mekanik yaralanma ve plazma zarı onarımı ile ilgili önceki çalışmalar, cam boncuklar, micropipetting, kesme, tırmalama ya da kazıma bırakarak kadar, yaralama hücrelerin çeşitli mekanizmaları dayanıyordu. Tüm bu testlerin saati yerine nicel daha nitel olduğunu ve tamir mekanizması kinetikleri üzerinde kesin bir bilgi vermemiştir. Yaralanma bu formları sonra plazma zarı mühürlemek için hücrelerin yeteneği membran geçirgen olmayan boyalar, sitosolik enzim, ATP seviyeleri, ya da uzun vadede kaybı sitoplazma, penetrasyonu hü...

Malzemeler

Material

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reagent
HeLa 229 hücre hattı	ATCC	CCL2-1
DMEM Yüksek Glikoz	İnvitrojen	11965
DMEM Yüksek Glikoz Kalsiyum	İnvitrojen	Yok 20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Azaltılmış Serum	İnvitrojen	31985
Lipofiktamin RNAiMax	Invitrogen	13778
Kontrol ortamı GC içeriği RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Sığır Serumu Isıyla İnaktive Edilmiş	Gemini-Biyoürünler	100-106
Bacillus cereusSigma S7651'den Sfingomiyelinaz
35 mm cam alt tabaklar	MatTek	P35G-0-14<
Ters mikroskop	Nikon	Eclipse Ti
Kamera	Hamamatsu Fotonik	C9100-50
Dönen disk konfokal mikroskop	PerkinElmer	UltraViewVoX
Yazılım analizi yazılım	PerkinElmer	Volocity Suite
Çevre odası	Patoloji Cihazları	LiveCell Sistem Odası

td colspan="4">