One Minute, Porphysomes Sub-Bir-Watt Fototermal Tümör Ablasyon, İçsel fonksiyonlu Nanovesicles

Özet

Biz böylece etkili fototermal tedavi ajanları işleyen, yapı-bağımlı floresan kendini söndürme ve benzersiz fototermal özelliklere sahip porphysomes denilen yeni içsel fonksiyonlu nanovesicles geliştirdi. Bu yüksek basınçlı ekstrüzyon porphysomes kullanılarak formüle edilebilir ve bir ksenograft tümör modelinde bunların fototermal tedavi etkinliğini araştırmıştır.

Özet

Yakın zamanda doğal olarak, çok fonksiyonlu olarak nanovesicles porphysomes geliştirdi. Bir foto-, α pyropheophorbide, bir fosfolipide konjuge edilmiş ve daha sonra lipozoma benzer kesecikler küresel kendi kendine toplandı. Nedeniyle porfirin-lipid çift tabakası içinde porfirin son derece yüksek yoğunluğa, büyük porphysomes sönme katsayıları, yapı bağımlı floresans kendini söndürme ve mükemmel fototermal etkinliğini oluşturulur. Bizim formülasyonda, porphysomes yüksek basınçlı ekstrüzyon kullanılarak sentez edildi ve 120 nm civarında bir ortalama parçacık boyutuna gösterilir. Porphysomes yirmi dört saat sonrası, damar içine enjeksiyon, tümörün lokal sıcaklık hızlı bir şekilde 750 mW (1.18 W / cm ^2), 671 nm lazer ışını bir dakika maruz kaldıktan sonra 62 ° C'ye 30 ° C artmıştır. , Tümörün komple bir ısı ablasyon sonra, oluşan ve iyileşmiş 2 hafta içinde, kontrol gruplarındaki tümörler büyümeye devam etti ve tüm tanımlanan en ulaştı eschars3 hafta içinde d noktasıdır. Bu veriler porphysomes kuvvetli fototermal tedavisi (PTT) ajanları olarak da kullanılabilir şeklini göstermektedir.

Giriş

Porphysomes multimodal görüntüleme ve tedavi ¹ yeteneğine sahip son zamanlarda geliştirilen yeni çok fonksiyonlu nanovesicles vardır. Bunlar, kendi kendine toplanan porfirin çift tabakaları oluşturulur ve büyük sönüm katsayısı ve benzersiz yapısı bağımlı floresans kendini söndürme sonuçlar üretir (83 den fazla, 000/porphysome parçacık) porfirin son derece yüksek bir yoğunluğa, içerirler. Porphysomes iyi in vivo farmakokinetik ve biyolojik dağılım özellikleri vardır: sistemli uygulanmasından sonra 12 saat kadar bir kan yarı ömrü sergilemektedir ve pasif olarak 24 saat sonra enjeksiyon sonrası ² 7.5% ID / g ksenograft tümörlerinin birikir.

Onların eşsiz yapısı ve fizikokimyasal özellikleri multimodal görüntüleme ve görüntü kılavuzluğunda tedavi için porphysome iyi bir aday. Her şeyden önce, porfirin içeren porphysomes tümör birikimi ¹ üzerine tümörlerin floresan görüntüleme için içsel olarak uygundurlar.Buna ek olarak, her bir porfirin, bu nedenle, kolay porphysomes PET görüntüleme ³ için bu tür 64Cu gibi radyoizotop ile etiketlenebilir kenetleme radyoizotoplar için sabit bir sitesi vardır. Porphysomes de eşsiz foto akustik görüntüleme ve PTT yeteneklerini sergilemek böylece porphysome yapısı, sağlam olduğunda Ayrıca, emilen ışık enerjisi lazer ışınlama maruz kalma altında termal dağıldı. Bu porphysomes intravenöz enjeksiyonundan sonra 24 saat, porphysome-birikmiş tümör Lazer ışını, hızlı bir sıcaklık artışı ve güçlü fototermal tümör ablasyon neden olduğu gösterilmiştir. Bu porphysomes altın nano partiküller (AuNPs) gibi yüksek ekstinksiyon katsayısı ile etkin fototermal arttırıcılar olduğu gösterilmiştir ^1. Öte yandan, AuNPs dahil olmak üzere diğer inorganik fototermal maddeler ile karşılaştırıldığında, porphysomes nedeniyle organik doğası Biyogüvenlikle olağanüstü bir avantaj göstermektedir. Porphysomes enzimatik biyolojik olarak parçalanabilir ve minimal akut toksiklik neden1000 mg / kg ¹ kadar yüksek dozda intravenöz farelerde y. Dahası, lipozomların benzer porphysomes büyük sulu çekirdek pasif ya da aktif olabilir terapötik ya da görüntüleme maddeleri ile yüklenir. Optik özellikleri ve porphysomes arasında biyouyumluluk biyofotonik görüntüleme ve tedavi için organik nanopartiküllerin multimodal potansiyel göstermektedir.

Bu yazıda, pyropheophorbide-lipid konjügatlarının sentezi yöntemi, üretim ve yüksek basınçlı ekstrüzyon kullanılarak porphysomes karakterizasyonu bir yöntem sunar. Fareler üzerindeki in vivo PTT tümörde porphysome etkin PTT etkinliğini göstermek için de yapılır bir subkütan ksenograft tümör modeli ile tedavisi.

Protokol

1.. Pyropheophorbide-lipid sentezi

1. ^4, 98.7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoil-2-hidroksi-sn-glisero, (... Zheng ve arkadaşları, Bioconj Chem, 2002, 13 -392, daha önce tarif edildiği gibi Spirulina Pacifica alglerden elde edilmiş) 200 mmol pyropheophorbide birleştirin Lipid: EDC --3-fosfokolin, Avanti Polar Lipids # 855675), EDC 76.3 mg, 48.7 mg DMAP (4 (dimetilamino)-5 ml amilen piridin) 1:1:2:2 Pyro bir oranı için kloroform stabilize : DMPA.
2. 24 saat argon altında oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı karıştırılır. 40 ° C'ye ısıtılarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında kloroform buharlaştınn (Piro sn-1 ya da sn-2 konumunda bağlı) piro-lipid izomerler karışımı elde edilir.
3. 1 mM _CaCI2, 50 mM Tris (pH 8),% 0.5 Triton X-100 ve 5 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda% 10 metanol içinde süspanse piro-lipid izomer karışımı. Bal arısı zehiri de elde edilen fosfolipaz A2 (PLA2) Ekle0.1 mg / ml konsantrasyon ve sn-1-piro lipid sindirimi ve saf sn-2-piro lipid izomer üretmek için 24 saat boyunca 37 ° C'de çözelti inkübe edin.
4. Ek kloroform 2 hacim ve metanol özü 1.25 sayılarını ve daha sonra 40 ° C'de düşük basınç altında döner buharlaştırma ile çözücünün çıkması DCM içinde% 1 MeOH yarılma ürünü yeniden süspanse edin ve izomerik olarak saf piro-lipid için küçük bir diol silika sütunu üzerinde saflaştırılması.

2. Porphysomes hazırlanması

1. Pyropheophorbide-lipid, distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-metoksi (polietilen glikol) (PEG-2000-PE) ve kloroform içerisinde kolesterol ayrı ayrı çözülür, ve sırasıyla konsantrasyonları kaydedin.
2. 65 mol% porfirin-yağ,% 5 mol PEG-2000-PE ve% 30 mol kolesterol birleştirilmesi ile 5 mg / tüpün toplam lipid ağırlığa sahip bir 12X75 mm borosilikat test tüpünde porphysome lipid filmi hazırlayın.
3. Nitro akışı altında lipid filmler Kurugen gaz ve bunları 1 saat daha vakumda kurutuldu sağlar. Gelecek hidrasyon ve ekstrüzyon kadar argon altında -20 ° C de lipid filmler saklayın.
4. Her bir lipid filmi tüpüne 1 ml fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM fosfat, pH 7.4) ilave edin. Tamamen donmuş kadar sıvı azot içinde test tüpü dondurma ve numune her eriyene kadar sonra 65 ° C su banyosunda tüpü eritin. Vortex 30 sn 'lik bir toplam (her vorteks arasında 65 ° C su banyosu içinde 5 saniye yeniden ısıtma ile 10 saniye her biri 3x) için boru.
5. Hiçbir büyük agregalar, hidratlı çözelti içerisinde gözlenebilir kadar ihtiyaç duyulan üzerine 5 ya da daha fazla döngü için donma-çözülme tekrarlayın. Bittiğinde buz üzerinde porphysome süspansiyon bırakın.
6. Dolaşan su banyosu 65 ° C'de termostatlı bir sirkülasyon pompasına thermobarrel ekstrüzyon bağlan içeri yerleştirilmiş iki yığın 100 nm polikarbonat filtre ile yüksek basınçlı ekstrüzyon cihazı (10 mi) bir araya getirin ve yüksek pres için bir azot tankına ekstruder sistemi bağlamakEmin kaynağı.
7. 9 inç cam transfer pipet kullanarak ekstruder odasına porphysome süspansiyonu aktarın. 200 ve 300 psig arasında bir okuma başlangıç ​​ekstrüzyon basıncı olarak görülmektedir kadar nitrojen tankı regülatör üzerindeki kadranı çevirerek basıncını ayarlayın. Yeterli porphysome akış hızı elde edilir ve basınç 800 psig (5440 kPa), maksimum ulaşana kadar kademeli olarak basınç düzenleyici vanasını açın.
8. İlk çekme geçiş tamamlandıktan sonra, basınç kontrol valfı kapatmak ve ekstruder üzerinde basınç tahliye vanası açılarak ekstrüderin basınç serbest bırakın. Yeni presten geçirilmiş porphysome solüsyonu ile ekstrüder doldurun ve nihai çözelti, homojen bir ekstrüzyon sağlamak için en az 10 kat için ekstrüzyon tekrarlayın.
9. UV-Vis spektrometre ile, metanol içinde seyreltilmiş bir numunenin emilimin ölçülmesiyle porphysome nihai çözeltinin konsantrasyonunu belirleyin. Aşağıdaki denklem zekâ kullanarak konsantrasyonunu hesaplayınh 97,000 M yok olma katsayısı ^-1 cm ^-1 pyropheophorbide-lipid için 410 nm'de.

10. Dinamik ışık saçılması ile bir Malvern Zetasizer kullanarak ZS90 porphysomes nihai boyut dağılımı ölçün. PBS içinde seyreltin porphysome çözeltisi ve ortalama sonuçlar için 15 çalışan ile üç ölçümler.
11. Spektroflorometre kullanılarak (% 1 Triton X-100, 1 mM) söndürüldü porphysome floresan emisyonu (PBS içinde 1 mM) ve unquenched porphysome karşılaştırarak porphysome floresans su verme belirler. (Tirton X-100) ilave edilmesinden önce ve sonra, deterjan spektrumlarını almak ve maksimum floresans okuma sinyalinin normalize. 410 nm ve 600-800 nm olarak emisyon dalgaboyu aralığı olarak uyarma ayarlayın.
12. Ileride kullanılana kadar 4 ° C de, argon altında, porphysomes çözüm tutun ve alüminyum f ışıktan korumakyağ.

3. Hayvan Modeli Ksenograft hazırlanması

1. Kültür KB RPMI-1640 hücreleri (% 10 FBS ile) ve 37 ° C de% 5 _CO2 ve nemli bir atmosferde hücreleri sürdürmek
2. Standart hücre kültürü tekniği kullanılarak hasat KB hücreleri. Enjeksiyon zamanına kadar kısa süreli depolama için buz üzerinde fosfat tamponlu salin (PBS) içinde hücre süspansiyonu (20,000 hücre / ml) tutun.
3. Çıplak fareler üzerinde KB ksenograftlarını hazırlayın. Standart diyet ve yatak (Harlan Laboratuvarları verilir; Diyet: bunlar (NU (NCr)-Foxn1 ^nu 6-7 haftalık eski Kategori # Crl): 20 g olduğunda çıplak farenin Charles River Laboratories'den temin edildi Işınlanmış LM-485, # 7912; Yatak: Mısır koçanı yatak, ¼ ", # 7097). Tüm hayvan taşıma araçları (şırınga, forseps, ve hayvan ped) deneylerden önce sterilize edin. % 100 oksijen taşıyıcı gazı içinde% 2 izofluran v / v ile fareler anestezi. Tüm hayvan protokolleri kurum (Üniversite Sağlık Ne tarafından onaylananğ bu durumda) hayvan bakımı ve kullanımı komitesi.
4. Farelerin sağ böğrüne deri altından PBS içinde süspansiyon haline getirilmiş, tümör hücreleri enjekte edilir. Fareler, tümör, 4-5 mm ve 2-3 mm kalınlığında bir çapa eriştiğinde, 10 gün sonra kullanılmak üzere hazırdır.

4.. In vivo Fototermal Tedavi

1. Intravenöz kuyruk damarından (200 ul hacimde 750 nmol pyro içeren) porphysomes enjekte edilir. Porphysomes lazer ışını 24 saat sonrası enjeksiyon Davranış.
2. Bu bölümde, bir kapalı lazer güvenlik odadaki tüm işlemleri yürütmek. Lazer ışınlama sırasında lazer güvenlik gözlükleri takın.
3. Lazer ışınlama ekipmanı kurmak. Bir stand üzerinde bir kelepçe ile lazer fiber ve bir difüzör tutun. Düşük seviyede lazer gücünü ayarlamak ve lazer açın. (DPSS Lazer, LaserGlow Technologies, Toronto, Kanada), AP kullanarak 750 mW (1.18 W / cm ²⁾ için, lazer gücü kalibre çapı 9 mm lik bir ışınlama alanı elde etmek için lazer fiber yüksekliğini ayarlamakower sonra metre ve hayvanları hazırlamak için lazeri kapatın.
4. Burun konisi ile% 100 oksijen taşıyıcı gaz içinde% 2 izofluran v / v ile hayvanların anestezisi yok) izofluran bir insan sağlığı açısından risk tehlike belirgin atma. Hayvan hayvanın arka pençeleri forseps veya parmak ile ayak tutam yaparak derin yeterli anestezi olduğunu onaylayın. Onlar bu prosedüre tepkisiz zaman hayvanlar lazer ışınlama için hazırız.
5. Bir kızılötesi termal kamera (Mikroshot, LumaSense Technologies) tümör sıcaklığını izlemek. Iyice odak ve bir ön PTT Görüntünün yanı sıra PTT ışınlama başlamadan önce düzenli bir beyaz ışık görüntü almak, yakın bir tümöre kamerayı yerleştirin.
6. Yine lazer açın ve 750 mW ışık gücünü artırmak. Tümör tamamen kapalı almak için lazer ışınının merkezinde tümör getirin ve ışınlama zamanlama başlar. Bir dakikalık bir lazer tedavisi için tümör sıcaklık görüntü her 5 sn atın. 1 dakika ile lazer kapatın. Stop% 2 izofluran gaz kaynağı, anestezi hayvan kurtarır kadar bekleyiniz ve tekrar kafese koydu.
7. Üniversite Sağlık Ağı tarafından onaylanmış hayvan protokollere göre 12:12 saat aydınlık ve karanlık döngüsü altında normotermi hayvan odasında fareler tutun. Buprenorfin (0.05 mg / kg, yara nedeniyle ağrıyı azaltmak için lazer ışınlaması bir hafta boyunca deri altına günde iki kez enjekte edilir. Her iki gün, bir kumpas kullanarak tümör çapını ölçmek ve bir fotoğraf çekin. Kullanarak tümör hacmini hesaplayın denklem aşağıdaki gibidir: V = π / 6 · a · bir uzun çapı ve b kısa biri, b, ^2.
8. Bu laboratuvarda tarafından belirlenen uç nokta olarak tümörün uzun çapı, 10 mm ulaştığında _CO2 odası içinde koyarak hayvanlar kurban. CO2 tedavi sonrası servikal dislokasyon gerçekleştirin. Sağkalım eğrisi çizilir.

Sonuçlar

Pyropheophorbide istikrarlı bir lipid monomer (Şekil 1a) halinde fosfolipide konjuge ve konjügatlar, bir yüksek basınç membran bir çekici kullanılarak ekstrüzyon yöntemi ile porphysomes oluşturmak için kendini monte edilir. Bu, nispeten düşük akış hızı ile ekstrüzyon ilk 3 döngüleri sırasında porphysome-lipid süspansiyonu ekstrüde etmek genellikle zordur. Daha ekstrüzyon tekrarlanır olarak, ekstrüde çözeltinin akış hızı giderek artar, ve gerekirse hafif basınç azaltılabilir. Porphysome boyut, konsantras...

Tartışma

Yüksek bir ilaç yükünü muhafaza ederken, ilaç verme teknolojilerin geliştirilmesi olarak, çok fonksiyonlu nanopartiküller ilaç verme aracın doğru izleme için geniş araştırmalar halen devam etmektedir. Porfirin yüklü lipozomlar, daha iyi farmakokinetik özellikler ve porfirin doğrudan uygulanması daha verimli teslimat için geliştirilmiştir, ancak engeller porfirin sınırlı yükleme miktarı ve plazma proteinlerine ^5,6 lipozomlardan porfirin hızlı yeniden dağılımı dahil olmak üzere mevcuttur. Serbest porfirin Lipoz...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Döner buharlaştırıcı	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Model numarası: G560
Yüksek basınçlı ekstruder	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml Thermobarrel Extruder
Isıtmalı banyo sirkülatörleri (Termostatlı sirkülatör)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Polikarbonat filtreler	Avanti Polar Lipids	610005	Gözenek boyutu 100 nm ve membran çapı 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
UV/Görünür Spektrofotometre	Varian Avustralya	Cary 50 Bio UV / Görünür Spektrofotometre
Spektroflorometre	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)	Hitachi	H-7000
Hücre kültürü inkübatörü	SANYO	MCO-18AIC
Güç Ölçer	Thorlabs	PM100D	sensörlü S142C
671nm Lazer	LaserGlow Teknolojileri	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Kızılötesi Termometre	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Lazer koruyucu gözlük	LaserGlow Teknolojileri	AGF6602XX	Optik Yoğunluk: 630-700 nm'de 1,5+