Yöntem makalesi

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

14.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50568

⸱

21 Ağustos 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

Bu makalede

Özet

Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.

Özet

Güçlü PARP1 inhibitörleri olarak hareket fenantren türevleri mitoz çoklu-centrosomal insan kanser hücrelerinde Sürnümerer centrosomes en iki odak kümeleme engelledi. Fenantridin PJ-34 molekülü en güçlü idi. İlave sentrozom Declustering çoklu centrosomal hücrelerindeki mitotik yetmezliği ve hücre ölümüne neden olur. En katı insan kanser ekstra centrosomes yüksek olay var. PJ-34 aktivitesi canlı bir insan meme kanseri sentrozom oldukça bol olduğu floresan γ-tubulin kodlayan vektörler ve floresan histon H2b mevcut için transfekte edilmiş MDA-MB-231 hücrelerinin konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir kromozomlar. Anormal kromozomlar düzenlemeler ve declustered centrosomes temsil eden de-kümelenmiş γ-tubulin odakları PJ-34 ile tedavi sonrası transfekte MDA-MB-231 hücrelerinde tespit edildi. Iki mil kutuplarda un-kümelenmiş ekstra centrosomes kendi hücre ölümü öncesinde. Bu sonuçlar, FO bağlantılıR, ilk kez İlave sentrozom mitoz de-kümeleme ve hücre ölümüne yol açan mitotik yetmezliği olan insan kanser hücreleri, PJ-34 arasında en son tespit edilen özel sitotoksik aktivitesi. Iki centrosomes ve iki odak iğ ile mitoz geçiren normal hücrelere zarar vermeden sabit hücreler, çok centrosomes ile PJ-34 özel ortadan kanser hücrelerinin konfokal görüntüleme tarafından gözlemlenen önceki bulgulara göre. PJ-34 Bu sitotoksik aktivite diğer güçlü PARP1 inhibitörleri tarafından paylaşılan değildi ve PARP1 inhibisyon bağımsızlığını düşündüren, PARP1 eksik MEF barındıran extracentrosomes gözlendi. Konfokal görüntüleme Canlı mitoz sırasında hücrelerin ortadan kaldırılması yeni moleküller belirlenmesi için yararlı bir araç sundu.

Giriş

Fenantren, PJ-34 de dahil olmak üzere PARP1 inhibitörleri, elde edilen stres koşulları (inme ya da miyokard infarktüsü) 1 altında enerji tüketen PARP1 aracılı DNA-onarım ile oluşturulan apoptotik hücre ölüm pasif hücreleri korumak için tasarlanmıştır. Ancak, son zamanlarda biz PJ-34, bu uyaran PARP1 inhibe göre iki kat daha yüksek konsantrasyonda, sadece insan kanser hücrelerinin 2,3 hücre ölümüne neden olabilir keşfetti. Hücrenin daha hızlı yayılması olduğu, hücrelerin daha verimli ortadan kaldırılması oldu. PJ-34 sitotoksik aktivite ekstra centrosomes mitoz 2 de-kümeleme bağlandı. Birçok insan kanser hücreleri liman 4,5 multicentrosomes. Etkili bir mitoz iki sentrozom barındıran hareketsiz hücreler ya da iyi huylu proliferatif hücrelerin zarar vermeden 72-96 saat içinde, bu hücrelerin ortadan 20 uM PJ-34 ile supernümere sentrozom liman insan meme kanseri hücreleri, MDA-MB-231, inkübasyonu 2,3. İyi huylu hücrelerin insan timus hazırlanan MCF-10, insan meme epitelyal hücreleri, insan endotelyal hücreleri (HUVEC) ve primer mezenkimal hücreler dahildir. Bu hücreler, PJ-34 sitotoksik aktivitesi dirençli bulunmuştur. PJ-34 96 saat inkübasyon sırasında kendi cep döngüsü müdahale ya da centrosomes ve iki odak milli oluşumu 2,3 etkilemedi.

Bipolar centrosome montaj mitoz 4,5 bipolar mili oluşumu için çok önemlidir. Bu nedenle, ikiden fazla centrosomes ile hücre iki kutup 4-9 kendi ekstra centrosomes kümeleme, bir güçlükle anlaşılan moleküler mekanizması geliştirdik. Kendi centrosomes bipolar montaj hatası tutuklamalar G2 / M tutuklama hücre döngüsü ve hücre ölümüne yol açan 4,5 mitotik başarısızlığı bu çok kutuplu bozuk iğ ve anormal kromozomlar ayrışmaya neden olabilir. Ekstra centrosomes de-kümeleme altında yatan moleküler mekanizmalar yoğun incelenmiştir <> 10 destek. Sağlıklı dokuları 5,10 korurken bu ölüm mekanizması anlamak kanser hücrelerinin özel ortadan kaldırılması sağlayacaktır.

Bu nedenle, mitotik felaket hücre ölümü geçiren bileşiklerin konfokal görüntüleme İlave sentrozom kümeleme etkileyen molekülleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir, insan katı cancers.Our sonuç geniş etkili olabileceği seçici bir kanser tedavisinde yeni bir mod, teklif mitoz 2,3, ilaç adayları hedef bu bileşiklerin kanser render.

Biz sabit ve canlı insan kanser hücreleri (mitoz ekstra-centrosomes yüksek çıkması ile) karşı normal hücreler tarayarak fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite belgeledi. Bir adım insan kanser hücrelerinde PJ-34 sitotoksik aktivitesini tanımlamak için kullanılan görüntüleme yöntemleri adım açıklama aşağıda yer almaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Kültürü hazırlanması

MDA-MB-231 hücreleri, ATCC (American Type Culture Collection) satın alındı ​​ve sıvı azot içinde saklandı.

  1. Dulbeco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 at serumu,% 1 L-glutamin ve% 1 Penstrep-Amfoterisin B içeren 10 ml tam ortam içinde 92 mm çapında Petri kabındaki Tohum 10 6, MDA-MB-231 hücrelerinin hücre Veren 80-100 yaklaşık% izdiham çoğalmaya.
  2. Çanak kültür ortamı çıkarın ve atın.
  3. % 0.25 'lik serum tüm izlerini silmek için (w / v) Tripsin-EDTA çözeltisi ile kısa bir hücre tabakası yıkayın.
  4. Hücre tabakası (genellikle 5-15 dakika içinde) dağılana kadar ters mikroskop hücreleri çanak ve gözlemlemek için tripsin-EDTA çözeltisi 2.0 ml ilave edilir.
  5. 18 ml tam büyüme ortamı ekleyin ve yavaşça pipet hücreleri tarafından aspire. Bir tüp aktarın.
  6. 1.200 rpm hücre süspansiyonu santrifüj.
  7. Cu 24 ml hücre pelet yeniden askıyaorta LTURE.
  8. 35 mm cam alt yemekleri (25% izdiham yaklaşık) ve inkübatör yer (% 5 CO 2, 37 ° C) hücre süspansiyonu 2 ml ekleyin.
  9. Çözümler:
    1. Hücre proliferasyonu için tam ortam:% 10 FBS DMEM,% 1 antibiyotik (100 birim / ml penisilin G, 100 ug / ml streptomisin, Pen-Strep-Ampho çözeltisi) ve 2 mM L-glutamin.
    2. % 0.25 tripsin-EDTA ihtiva Tripsin-EDTA solüsyonu,.
  10. Yemekleri:
    92 mm çapında Petri kapları.
    35 mm çapında poli-D-lizin kaplı cam alt kültür tabaklarında.

2. Canlı Konfokal Görüntüleme için Hücreleri hazırlanması

  1. Tohum 2 x 10 1 'de belirtildiği gibi 2 ml komple ortam içinde cam alt kültür kapları içinde 5 MDA-MB-231 hücreleri. Hücre kültürü% 60-70 izdiham (çanak başına 3-4 x 10 5 hücre yaklaşık) ulaştığında, transfeksiyon devam.
  2. Iki plazmit dekoderi ile hücrelerin transfekteüretim protokolü takip, lipozomal transfeksiyon reaktif Jet-PI kullanarak füzyon proteinleri γ-tubulin-GFP (centrosomes floresan tespiti için) ve Histon-KIRMIZI (H2b-KIRMIZI, kromozom floresan tespiti için) ing. Kısaca, 100 ul NaCl (150 mM) ile bir boru her bir plazmit 2 ug karıştırın. Ikinci bir tüp içinde 100 ul NaCl (150 mM) ile transfeksiyon reaktifi (100 ul) karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin. Daha sonra iki çözüm, karışım (hafif vorteks kullanarak) birleştirmek ve çevirme özelliği. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. Transfeksiyon karışımı İnkübasyon sırasında, bir kez PBS ile yıkayın ve hücrelerin herhangi bir ek ile sıcak DMEM, 2 ml (37 ° C) hücre orta yerine.
  4. Yavaşça DMEM hücrelere transfeksiyon karışımı eklenir ve daha sonra 8 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2) inkübatör hücreleri döndürür.
  5. 24 inkübasyondan 8 saat sonra, 2 ml komple ortam ile DMEM değiştirmek ve inkübatör hücrelerin inkübesa.
  6. 24 saat transfeksiyondan sonra, 2 ml komple ortam 20 uM PJ-34 içeren hücrelerin orta yerine.
  7. İlave 18 saat (37 ° C,% 5 CO2) için hücreler inkübe edin.
  8. % 5 CO 2 ve 37 ° C'de hücreleri tutarak görüntüleme odasında en az 16 saat süreyle konfokal görüntüleme yaşamak Konu hücreleri
  9. Buna paralel olarak, aşağıdaki gibi floresan mikroskopi kullanılarak transfeksiyon etkinliği 36 saat sonrası transfeksiyon inceleyin:
    1. Tohum 2 x 10 1 lamel çukur başına 2 ml komple ortam içinde içeren 6 oyuklu plaka 5, MDA-MB-231 hücreleri.
    2. 2.2-2.5 bölümlerde belirtildiği gibi hücrelere transfekte.
    3. 36 saat transfeksiyondan soğuk metanol içinde inkübe edilerek, bir lamel üzerine monte edilmiş, transfekte edilmiş hücreleri sabitleştirmek: aseton (1:1) çözeltisi, 7 dakika, -20 ° C
    4. Sabitleme çözüm aspire ve bir kimyasal kaputu kurumaya monte hücreleri ile lamel sağlar.
    5. DAPI Altın antifade reaktif uzatmak ve inci izin uygulayınE lamel 6 saat boyunca karanlıkta kurumasını bekleyin.
    6. Floresan mikroskop altında slayt inceleyin ve hücrelerin toplam nüfusun (DAPI DNA boyama) gelen transfekte hücreleri (kırmızı ve yeşil sinyalleri) yüzdesini hesaplar. 100-200 hücre sayılmıştır zaman arzu edilen transfeksiyon yüzdesi% 20-40 kadardır.

3. Canlı Konfokal Görüntüleme Tarayıcı Ayarları Teknik Parametreler

  1. Tarama modu XYZT; İğne [havadar] 1.00; Zoom 3.5, Çözünürlük 8 bit; Lazer DPSS 561 nm, Argon, görünür lazer 488 nm, Lazer O / Ne görünür 633 nm; Amaç HCX PL APO CS 63X 1.40 YAĞ UV; Sayısal diyafram 1.4; Kırılma endeksi 1.52; hızı 700 Hz tarama.
  2. Görüntü 3 boyutlu sunum IMARIS görüntüleme yazılımı 7.0 ile hazırlanmıştır.

4. Sabit Hücreler Mitoz konfokal Görüntüleme

  1. Tohum 2 x 10 5, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücreleri (ATCC), normal fare embriyonik fibroblastlar (MEF) veya eksik PARP1 ME2 ml tam orta 6-plaka cam lamelleri F (, Dr Francoise Dantzer tarafından hazırlanan PARP - - /). Lameller, 2 saat boyunca kurutuldu ve 6-çanak her iyi yerleştirilen steril DD su ile yıkama ile takip edilerek,% 96 etanol ile yıkanmıştır.
  2. Orta PJ-34 (10-30 mcM) ekleyin ve gerekli süre (genellikle en fazla 96 saat) için hücreler kuluçkaya yatmaktadır.
  3. Bir kez PBS ile yıkayın lamelleri (fosfat tamponlu tuz), ve buz gibi soğuk metanol ile inkübasyon kullanarak hücreleri gidermek: aseton (1:1) çözeltisi, 7 dakika, -20 ° C
  4. Sabitleme çözüm aspire ve lamelleri kimyasal kaputu kurumaya izin (bu aşamada, lamelleri birkaç hafta -20 ° C tutulabilir).
  5. Hücre zarının geçirgen hale getirilmekte ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBST içinde% 10, NDS (normal eşek serumu) ('engelleyici bir çözüm') ile hücrelerin engellemek için PBST (PBS% 0.1 Tween-20 ile takviye edilmiş) ile bir kere lamelleri yıkayın.
  6. Birincil antibodi ile permeabilize sabit hücreleri inkübeoda sıcaklığında 2 saat için ES (iğ ve sentrozom boyama için). Anti-α tübülin (1:250 seyreltme) ve anti-γ tübülin (1:200 seyreltme) antikorları takip olarak bloke çözelti içinde seyreltilir. Birincil antikorlar, şöyle uygulanır: 6-plaka kapağı (kapağın baş aşağı) üzerinde her bir lamel için çözüm engelleme antikorların bir karışımı, 100 ul (bir damla) uygulanmaktadır. Yavaşça antikorlar damla lamel koymak, numaralı seribaşı hücreleri açılan karşı karşıya. Oda sıcaklığında 2 saat için de antikorların bakan lamelleri inkübe edin.
  7. Kuyularda geri lamelleri yerleştirin ve PBST ile hücreleri 3 kez yıkayın. Daha sonra, floresan ikincil antikorlarla lamelleri hücrelerin etiketlenmesi için 4.6 'de tarif edilen aynı prosedürü kullanmak. , Karanlıkta, 1 saat, RT, ikincil antikorlar ile lamelleri hücreleri inkübe edin. Antikorlar aşağıdaki gibi engelleme çözümü seyreltilir: ve Alexa Fluor 568 (1:1,000 seyreltme Alexa Fluor 488 (yeşil 1:1,000 seyreltme);kırmızı).
  8. Kullanarak lamelleri DAPI (kromozomlar boyama için) ile Altın antifade reaktif uzatmak ve kuruması için karanlıkta oda sıcaklığında gece inkübe monte edin.
  9. Konfokal mikroskobu ile kapak fişleri inceleyin.

5. Hücre Canlılık ATP üretimi ile ölçülür

ATP üretimi bir lüminesan ATP tespit kiti kullanılarak ölçülür.

  1. 96 oyuklu plaka, her bir 800 ul ortam içinde yaklaşık olarak 20.000 hücre tohum hücreleri. Üç boş bir kuyu ortamı arka lüminesans belirlenmesi için kullanılmalıdır.
  2. Yaklaşık 10 mcM 100 mcM ATP standart seyreltme serisi hazırlayın ve buz üzerinde tutmak.
  3. Her bir kuyucuğa 50 ul deterjan ekleyin ve orbital çalkalayıcı, 700 rpm'de 5 dakika boyunca plaka sallayın.
  4. Kit 'substrat tampon' 5 ml 'liyofilize yüzey' bir sulandırın her flakon.
  5. Oyuklara sulandırılmış substrat çözeltisinin 50 ul ekle ve sallayınorbital çalkalayıcı, 700 rpm, 5 dakika süreyle plaka.
  6. 10 dakika karanlıkta plaka tutun.
  7. ELISA mikro okuyucu tarafından her kuyunun lüminesans ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PJ-fenantridin 34 1 çözelti, kararlı suda (Şekil 1). Daha önceki sonuçlar hücre ölümünü ortaya ve PJ-34 ile tedavi edilen sabit çoklu centrosomal kanser hücrelerinin çeşitli ekstra-sentrozom de kümelenmiş. Aksine, normal hızla çoğalan hücrelerde 2,3 etkilenmedi. Centrosomes sabit ekstra centrosomal hücreleri 2 centrine1 ve γ-tubulin karşı antikor çift etiketleme tarafından tespit edilmiştir.

Burada, PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal mi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Konfokal görüntüleme mitoz sırasında canlı çok centrosomal hücreleri (Şekil 3 ve Ek bilgileri) PJ-34 sitotoksik etkisinin gerçek zamanlı belgeler temin yaşıyor. Bu PJ-34 5-9 Mitotik Afet hücre ölümünün indüksiyon düşündüren, ekstra centrosomes de-kümeleme ve hücre ölümüne insan kanser hücrelerinde PJ-34 sitotoksisite atfederek ilk canlı belgelerine oldu. Bunun aksine, süper numerary sentrozom iki odak kümeleme iki focali kümelenmiş ilave sentrozom (Şekil 2, ek bilgi), normal ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu araştırmanın finansman kaynakları: Tel Aviv Üniversitesi teknoloji transferi şirketi, Ramot ve Sheba-Tıp Merkezi (M. CA ve SI.), ICRF ortak bir fon - İsrail Kanser Araştırma Vakfı (M. CA.) Ve İsrail bilim Vakfı ( SI).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
REAGENTS
>DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS (Fetal sığır serumu)İnvitrojen (GIBCO)12657 
Pen-Strep-Ampho çözeltisiBiyolojik Endüstriler, İsrail03-033-1B 
L-glutaminInvitrogen (GIBCO)25030-024 
% 0.25 Tripsin-EDTAInvitrogen (GIBCO)25200 
92 mm Petri kaplarıNunc, Thermo scientific150350 
35 mm poli-D-lizin kaplı cam alt kültür kaplarıMatTek Corporation, ABDP35GC-0-14-C 
Lüminesan ATP algılama test kitiAbcamab113849 
NDS (Normal Eşek Serumu)Jackson ImmunoResearch017-000-121 
Anti &alfa;-tubulin antikoruSigmaT90261:250 seyreltme (IF)
Anti γ-tubulin antikoruSigmaT51921:200 seyreltme (IF)
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare IgGInvitrogenA-110171:1.000 seyreltme (IF)
Alexa Fluor 568 Eşek Anti-Tavşan IgGInvitrogenA-100421:1.000 seyreltme (IF)
DAPI ile ProLong Gold antifade reaktifi (montaj)InvitrogenP36935 
JetPEI (lipozomal transfeksiyon reaktifi)Polyplus101-10 
EQUIPMENT
>Konfokal mikroskopLeica (Mannheim, Almanya)TCS SP5II&nbsp;

Kaynaklar

  1. Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
  2. Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412(2011).
  3. Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78(2009).
  4. Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
  5. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
  6. Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
  7. Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
  8. Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
  9. Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).
  10. Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
  11. Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
  12. Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
  13. Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
  14. Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
  15. Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
  16. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PJ 34Sentrozom K melenmesinin BozulmasCanl Konfokal G r nt lemeMitotik Ba ar s zl kKanser H cresi l mGamma TubulinHiston H2bok Sentrozomlu H crelerPARP1 nhibisyonuMDA MB 231

İlgili makaleler