Method Article

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DOI:

10.3791/50607

⸱

October 18th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Environmental Toxicology, Chulabhorn Graduate Institute, 3Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada görülmemiş verimlilik ile DNA hasarı kuyrukluyıldız tahlil tespiti sağlayan bir platform açıklar. Cihaz desenler mikroarreylerinin içine memeli hücreleri ve 96 örneklerinin paralel işleme sağlar. Yaklaşımı temel düzeyde DNA hasarı, pozlama kaynaklı DNA hasarı ve DNA onarım kinetik analizini kolaylaştırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA'ya zarar veren ajanlar yaşlanmayı, hastalığı ve kanseri teşvik edebilir ve çevrede her yerde bulunurlar ve insan hücrelerinde normal hücresel metabolitler olarak üretilirler. İronik olarak, yüksek dozlarda DNA'ya zarar veren ajanlar da kanseri tedavi etmek için kullanılır. DNA hasar tepkilerini ölçme yeteneği bu nedenle halk sağlığı, farmasötik ve klinik alanlarda kritik öneme sahiptir. Burada, sabit bir mikrodizideki hücreleri modellemek için mikrofabrikasyon tekniklerinden yararlanan yeni bir platformu açıklıyoruz. 'CometChip', bir elektrik alanındaki bir matris boyunca DNA göçünün derecesini değerlendirerek DNA hasarının seviyesini tahmin eden, iyi bilinen tek hücreli jel elektroforez testine (diğer adıyla kuyruklu yıldız testi) dayanmaktadır. Bu tahlil ile ölçülen hasar türü, abazik bölgeleri, çapraz bağlantıları ve iplik kopmalarını içerir. Geleneksel tahlilde agaroz içinde rastgele dağılmak yerine, hücreler yerçekimi ile bir agaroz mikrokuyu dizisine yakalanır. Platform ayrıca standart bir mikroskop lamının boyutundan 96 oyuklu bir formata genişleyerek paralel işlemeyi mümkün kılar. Burada, bilinen genotoksik ajanların neden olduğu DNA hasarını ve maruziyetten sonra izlenen hücresel onarım tepkisini değerlendirmek için çipi kullanma protokollerini açıklıyoruz. Biyolojik ve mühendislik ilkelerinin entegrasyonu sayesinde, bu yöntem insan hücrelerinde DNA hasarının sağlam ve hassas ölçümlerini güçlendirir ve genotoksisite testi, ilaç geliştirme, epidemiyolojik çalışmalar ve klinik testler için gerekli verimi sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücre jel elektroforezi (kuyruklu yıldız tahlil aka) (SCGE) deneyi baz lezyonlar, abasic siteler, tek iplikli kırılmalara, çift iplikli kırılmalara, çapraz bağlardan ve hassas alkali içeren DNA lezyonlarının, geniş bir yelpazenin ölçümü için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir siteleri. Deneyin temel ilkesi, Hasarlı DNA hasar DNA'dan daha nedeniyle parçalanma ve süpersarmal yapısı kaybına daha kolaylıkla göç olmasıdır. Göç ölçüde DNA hasarının miktarı ile orantılıdır, ve floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Görüntü yakalama ve bireysel kuyrukluyıldız şeklindeki DNA yoğunluğu profili analizi, daha sonra bir hücreye 1-4 içindeki DNA hasarının seviyesini ortaya çıkarmak için kuyruk böyle kuyruk uzunluğu, kuyruk an, ve% DNA gibi parametre ölçümleri sağlar.

A) alkalin kuyruklu yıldız tahlil ve b) nötr kuyruklu yıldız tahlil: Şu anda kuyruklu testin yaygın olarak kullanılan iki sürümü vardır. Alkalin kuyruklu yıldız tahlil en yaygın olduğuBöylece elektroforezden önce DNA gevşemek için yüksek pH tamponu kullanır ve kullanılan versiyonu, iplikli kırılmalara ve alkali-duyarlı sitelerin her türlü algılar. Bu çift helisleri korumak ve sadece çift tutam kırılmaları 2,5 tespit etmek için nötr bir tampon kullandığından nötr kuyruklu deney, diğer taraftan, daha az uygulanmaktadır. DSBs neden fiziksel ve kimyasal maddeler için, SSB'ler uyum içinde oluşturulur, ve çok daha yüksek düzeyde oluşturulur (örneğin, γIR kaynaklı SSB'ler DSBs daha fazla ortak bir büyüklük sırası vardır). Çoğu DNA zarar pozlarda, DSBs çok daha az sıklıkla DNA hasarının diğer sınıflara göre daha vardır ve dolayısıyla tespit etmek zordur. Biz önceki yayınlarda hem sürümlerinin algılama penceresini göstermiştir. 6,7

Kuyrukluyıldız tahlil rutin DNA hasarı ve onarımı ve genotoksisite testinin 1,2,8-15 temel araştırma için kullanılıyor olmasına rağmen, tahlil, numune-sı kötü tekrarlanabilirlik sahip bildirilmiştirörnek, kişiden kişiye ve lab-to-laboratuarı değişkenliği. Görüntü elde etme ve veri analizi zahmetli edilir olduğundan, deney düşük akış kısmen,. Birlikte, bu sınırlamalar geniş ölçekli çalışmalarda nispeten düşük kabul katkıda bulunur. Mühendislik teknolojileri ve ilkeleri entegrasyonu sayesinde, CometChip geleneksel kuyruklu testte 6,7 ile ilişkili verim sorunlarına ve tutarsızlıklar bir çözüm getiriyor. Kısaca, çip oluşturmak için bir kalıp tek bir hücrenin bu kadar küçük çaplı microposts oluşturmak için fotolitografi kullanımıyla mikrofabrike edilir. Kalıp daha sonra jel katılaşmasından sonra mikro oyuk bir dizi ile sonuçlanan, erimiş agaroz üzerine eklemek için kullanılır. Cips farklı hücre tipleri ile uyumlu değişken boyutlu kuyuları ile araştırmacılara sunmak için geliştirilmektedir. Çip yüklemek için, ortam içinde hücreler, yerçekimi ile kuyu içine yerleşmek için izin verilir; fazla hücreler yıkanarak uzaklaştırılmıştır. Trapped hücreler daha sonra bizi kapsüllüdüşük erime noktasına sahip ince bir tabaka ing ve dipsiz 96 oyuklu bir plaka daha sonra, alt yüzeyi üzerinde mikro oyuk yüzlerce 96 macrowells, her birini yaratmak için jel yüzeyine kenetlenir.

Bu protokol jel hazırlama, hücre yükleme, dozajlama ve onarım, hücre parçalanması, elektroforez ve floresan görüntüleme içeren bu yonga ile deneyler için genel prosedürler açıklanmaktadır. Biz alkali ve sırasıyla tahlil nötr sürümlerini kullanan, bilinen DNA zarar veren ajanlar maruz lenfoblast hücreleri ile doz tepki deneyleri iki örnek göstermektedir. İki onarım deneyleri de onarım tepki maruziyet sonrası sistemi kullanılarak değerlendirilebilir nasıl açıklamak için gösterilmiştir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chip 1. Hazırlık

  1. Aşağı bir-iyi dikdörtgen plaka, jel film tarafı içine paketi ve yerden çip jel çıkarın.
  2. Iki kez tekrar, 15 dakika boyunca PBS 1x 25 ml jel yıkayın.
  3. Cam plaka ve buna göre jel etiket yönelimine ayarlayın jel.
  4. Yavaşça jel üzerine ters çevrilmiş dipsiz 96 oyuklu plaka basın; Dibi olmayan plaka kuyuları her jelin alanı içinde olduğundan emin olun.
  5. Cam ile kenetlenmesini sağlamak için, plakanın her yanında 1,5 'bağlayıcı klipsler kullanılır.
  6. Aşırı PBS kapalı aspire iyi her tampon.

2. Yükleme Hücreler

  1. Hücre süspansiyonlarının hazırlanması:
    1. Süspansiyon hücre hatları için, 10 ml / 5 -10 6 hücre bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere ortam içinde hücre süspansiyonu seyreltin.
    2. , Yapışan hücre hatları için normal Ayırma / tripsinizasyon protokolleri takip ve d10 5 -10 6 hücre / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar ortam içinde müstakil hücreleri ilute. Hücrelerin toplam varsa, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir hücre filtresi hücre süspansiyonu geçmektedir.
  2. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hücre süspansiyonu 100 ul ilave edin.
  3. Jel film ile kapak plakası ortam buharlaşmasını önlemek için.
  4. Hücreler 37 ° C inkübatör içinde en az 30 dakika boyunca yük sağlar.
  5. Her kuyudan kuvöz ve aspire medya çipini çıkarın.
  6. Bağlayıcı klipleri ve dipsiz 96-plaka çıkarın; bir açıda cam plaka ile çip tutarken agaroz üzerinde aşırı hücreleri çıkarmak için 1x PBS ile yıkayın.
  7. Bir 4X objektif lens ile parlak bir alan mikroskobu kullanılarak hücre yükleme kontrol edin. Yetersiz yükleme görülürse, adım 2.1 tekrarlayın.
  8. Daha da yüzey (bench) yüklenen çipi yerleştirin. Bir% 1 düşük erime noktalı (LMP) agaroza bindirme çip 37 ° C'de önceden ısıtıldı. Yaklaşık kullanın 2̵1 'dir; LMP agaroz 3 ml her bir yonga için gereklidir.
  9. Üst kaplama 3 dakika boyunca oda sıcaklığında ve daha sonra katılaşan önce tam katılaşma işlemi için 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir buzdolabı için hareket etmesine izin verir.

3. Dozaj ve Onarım

NOT: bazal DNA hasarı seviyesini incelemek Adım 4 atlamak için.

  1. Dikkatli bir şekilde yeni bir 96 oyuklu dipsiz plakanın gözleri ile (önceki kenetlenmeden oluşturulan), çipin kuyu hizalayın. Re-pres bağlayıcı klipleri ile üst ve güvenli bağlama üzerinde dipsiz 96-plaka.
  2. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, istenen doz kimyasal 100 ul ilave et; Buz üzerinde ya da bir zaman istenen miktarda boyunca 4 ° C'de buzdolabında olarak dozajlanması ve / tedavisidir.
  3. Her iyi gelen, aspirat kimyasallar dozajlama ve 1x PBS kullanılarak kalıntı kimyasal uzaklıkta yıkayın sonra. Direkt hasar burada okudu ise, 4. Adıma geçin.
  4. Olarak onarmak için çip hücreleri, onarım kinetiğini incelemek izin37 ° C'de ortam. Lyse belirli zaman noktalarında (Adım 4 geçin).
    Not: tamir bağlı tabanı olmayan 96 oyuklu bir plaka ile çip-üstü gerçekleştirilebilir ya da çip Dibi olmayan 96 oyuklu bir plakanın ayrılmasından sonra, ayrı parçalar halinde kesilebilir.

4. Liziz

  1. Alkalin kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için:
    1. % 1 Triton X-100 lizis stok çözelti (2.5 M NaCl, 100 mM Na-2 EDTA, 10 mM Tris, pH 10), alkalin ekleyerek alkalin lisiz tamponu çalışma yapmak. Her çip için lizis tamponu çalışma yaklaşık 25 ml hazırlayın.
    2. 4 ° C sıcaklıkta alkalin lisiz tamponu çalışan ön soğutma.
    3. Soğuk çalışma alkalin lisiz tampon maddesi içinde çip daldırın ve 4 ° C'de lisis buzdolabında O / N yapmasına izin verin.
  2. Nötr kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için:
    1. Nötr lizis stok çözeltisi (2.5 M NaCI, 100 mM Na-EDTA, 2 den 10 a kadar% 1 Triton X-100 ve% 10 DMSO ilave edilerek nötr bir liziz tamponu çalışma yapmakmM Tris,% 1 N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). Her çip için lizis tamponu çalışan yaklaşık 25 ml hazırlayın.
    2. 43 ° C'de nötral lizis tamponu çalışma öncesi sıcak.
    3. Sıcak çalışma nötr lizis tamponunda çip batığın ve parçalama 43 ° C inkübatör O / N gerçekleştirmek için izin verir.

5. Elektroforez

  1. Alkalin kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için:
    1. 1x PBS ile çip durulayın hızla lizis tamponu çıkarın ve.
    2. Jel film tarafı çift taraflı bant kullanarak aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasında Güvenli çip.
    3. 4 ° C soğuk oda odasına getirin.
    4. Sadece jel kapsayan bir seviyeye kadar soğuk bir alkali elektroforez tamponu (0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA) ile oda doldurun.
    5. 40 dakika için alkalin gevşemek için izin ver.
    6. 1 V / cm ve soğuk odada 30 dakika boyunca 300 mA'da elektroforez çalıştırın. Cha elektroforez tampon seviyesini ayarlayınİstediğiniz çalışan akımı elde etmek mber.
  2. Nötr kuyrukluyıldız analizini gerçekleştirmek için:
    1. Liziz tamponunu çıkarın ve 2 x 15 dak, 4 ° C de nötr elektroforez tamponu (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borik asidin, pH 8.5) ile çip yıkayın.
    2. Jel film tarafı çift taraflı bant kullanarak aşağı bakacak şekilde bir elektroforez odasında Güvenli çip.
    3. 4 ° C soğuk oda odasına getirin.
    4. Sadece jel kapsayan bir seviyeye kadar, soğuk nötral elektroforez tamponu ile hazne (2 mM Na2EDTA, 90 mM Tris, 90 mM borik asidin, pH 8.5) doldurun.
    5. Jel 60 dakika boyunca soğuk odada oturmak için izin.
    6. 0,6 V / cm elektroforezi çalıştırın ve soğuk bir odada 60 dakika boyunca 6 mA. İstenilen çalışma akımı elde etmek odasında elektroforez tampon seviyesini ayarlayın.

6. Floresan Görüntüleme

  1. Col Elektroforez odasından çipini çıkarınd oda.
  2. 4 ° C'de buzdolabında 2 x 15 dakika boyunca nötralizasyon tamponu (0.4 M Tris, pH 7.5) nötralize jeller.
  3. Seçtiğiniz floresan DNA boyası ile çip Leke (yani, SYBR Altın, Etidyum Bromür) fabrika altında önerilen prosedürleri. Floresan mikroskopi kullanılarak.

7. Veri Analizi

Böyle Komet 5.5 gibi standart kuyruklu yıldız tahlil yazılım tarafından kuyruklu Görüntüler analiz edin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu birinci örnekte, H2O 2 kullanılarak oksidatif hasara maruz kaldıktan sonra, insan limfoblastoid hücrelerde DNA hasarına başlangıç ​​seviyelerinin ölçülmesi için yöntem anlatılmaktadır. H2O 2 ile indüklenen taban lezyonları ve tek kordonlu kırılmaları değerlendirmek amacıyla, alkali kuyruklu koşullar kullanılır. Yükleme tamamlandıktan ve hücreler agaroz kaplaması ile kapsüllenmiş sonra, tabanı olmayan 96 oyuklu bir plaka çip üzerinde 96-bölme oluşturmak için yüzey üzerine bastırılır. 96-deliklerin her biri farklı bir türü ya da kimyasalların konsantrasyonu ile dozlanabilir. Burada H2O 2 dört ayrı dozu kullanılmıştır ve 1 x PBS, negatif kontrol olarak kullanıldı. Dizilmiş kuyruklu temsili görüntüleri arıtılmamış Şekil 1A, (üst), 50 uM (orta) ve 100 uM (alt) H2O 2 -exposed örnekleri kuyruklu kuyrukları farklı seviyelerde ortaya gösterilmiştir. Kuyruklu görüntü analizi performan- edilebilirgenellikle her kuyrukluyıldız kuyruk toplam floresan yoğunluğu ve göç mesafeye göre hasar seviyelerini rakamlarla piyasada mevcut yazılımını kullanarak med. Ölçümler genel olarak hesaplanır 50-100 koşul başına kuyruklu ve medyan değeri (ya% kuyruk DNA ya da kuyruk uzunluğu) üzerinde gerçekleştirilir. Şekil 1B H dört farklı konsantrasyonlarına maruz TK6 lenfoblastoid hücre kuyruklu analiz yüzde kuyruk DNA yanıt eğrisini görüntülemektedir 2 O 2. Bağımsız deneyler arasındaki tutarlılık hücrelerinde kimyasal tedaviler çeşitli düzeylerde DNA hasarı yanıtını değerlendirirken bu yaklaşımın etkinliğini göstermektedir.

(Macrowells arasında örneğin) ve aynı deney tekrarları arasında örnekleri arasındaki varyasyon hakkında bilgi edinmek için, inter-örnek ve inter-deneysel değişkenlik sırasıyla Şekil 2A ve 2B çizildi. 96-W her bir deney içinde, her bir gözeell çip farklı bir örneklem eşdeğerdir ve bu nedenle iyi-kuyu varyasyon cihazın arası örnek varyasyonunu göstermektedir. Burada, 96 oyuklu çip 12 kuyu yüklü hücreler TK6 H2O 2 aynı dozu ile muamele edilmiş ve tedaviden hemen sonra lize edildi. Diğer tüm adımlar deney paralel olarak gerçekleştirilmiş ve her bir macrowell en az 50 kuyruklu medians Şekil 2A'da çizilmiştir. Standart sapma 3.99% olan ile medyan ortalama kuyruk 77.53% DNA. Bu verilere göre, örnekler arasında değişkenlik katsayısı Bu deneyde 6,16 geliştirilmiş sağlamlığı gösteren, geleneksel ölçümüne göre birkaç kat daha düşük olan% 5.2 olduğunu hesaplayabilir. Tahlil tekrarlanabilirliği hakkında bilgi edinmek için, 75 uM, H2O ile 2 parçası içinde TK6 hücrelerin maruz kalan ve DNA hasar anında seviyesinin analiz edilmesi. Bu deney, her deney altı kez F ve veri grafiği çizilmiştir tekrarlandıŞEKIL 2B. Aynı deneysel koşullar altında, biz şekildeki gri çubuklar olarak gösterilen, 57.87% 41.76% kadar uzanan sonuçlar elde. Altı tekrar ortalama sadece% 2.04 olan ortalama standart hata ile, 49.57% 'dir. Tekrarlar arasındaki varyasyonu düşük bu yeni aygıt üzerinde gerçekleştirilen kuyrukluyıldız deney yüksek tekrarlanabilir olduğunu ima eder.

Onarım kinetiğini değerlendirmek için, hücreler tedaviden sonra taze medyada kendi DNA onarmak için izin verilir. Çeşitli zaman noktalarında macrowells yokedici zaman DNA hasarına değişikliği ortaya koymaktadır. Bir örneği Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu deneyde, hücreler ilk TK6, çip kapatıldığı 50 uM, H2O 2 ile muamele edilmiş ve 60 dakika sonraki maruz kalma kadar tamir edilmesine bırakılmıştır. Hücreler, sırasıyla 0, 20, 45 ve 60 dakikada parçalanmıştır. Farklı zaman noktalarında Örnek kuyruklu görsel Şekil 3A'da gösterilmiştir, ve zaman içinde, DNA hasarı seviyelerinde değişiklik, Şekil çizilmiştir3B. Bu veriler neredeyse tüm hasar 2 O 2 tedavisi 45 dakika sonrası H içinde tamir olduğunu ortaya koydu. Pek çok değişken hücre hattı ve ikinci kimyasal madde tipi de dahil olmak üzere, tamir hızını etkileyebilir. Bu nedenle araştırmacılar protokolü (yani, onarım süresini uzatmak) soruşturmalarında ek ihtiyaçlarını karşılamak için değişiklik yapabilir. Burada 7-metilguanin lezyonlar da dahil olmak üzere temel neden olduğu bilinen bir alkilasyon maddesi TK6 hücreler farklı genotoksik madde N-metil-N 'Nitro- K -Nitrosoguanidine (MNNG) ile tehdit burada çipi kullanılarak tamir deney başka bir örneği sağlamak ve 3-metiladenin. Bu lezyonlar kendiliğinden depürinasyon ile ya da DNA glikolazdan ile enzimatik olarak ayrılması ile ya da the abazik dönüştürülür. Elde edilen abazik bölgenin sokulmasını içerir alkalin koşullar altında ayrılır ve böylece çip üzerinde tespit edilebilir. Başlangıç ​​maruz uzunluğunda belirgin hasarına önemli bir artış neden olurhücreler onarım sırasında bütün DNA'yı geri olarak kuyrukları ve zaman içinde bu kuyrukları azalır. Alkilasyon ve oksidatif hasar iki esas olarak baz eksizyon onarım yolağı ile tamir edilir, ancak oluşturulan lezyonların miktarı ve onarımında rol oynayan proteinlerin değişir. Bu varyasyonlar, the yanı sıra, elde edilen abazik sitelerinin tamir farklı oranlarda abazik dönüşüm farklı oranlarına yol açabilir. Şekil 4'te, TK6 hücre onarım kinetiği 0.1, 1, maruz bırakılır ve MNNG 3 ug / ml gösterilmiştir. MNNG kaynaklı hasar uzun bir süre kalıcı görünür ve H 2 O 2 -kaynaklı hasar kıyasla daha yavaş bir hızda temizlenir çünkü bu deneyde, biz 2 saat sonrası maruz kalma deney süresini uzattı.

Nötr koşullar kullanılarak DSBs analizi alkalin koşulları kullanılarak tek kordonlu lezyonların analizi için protokole benzer. Ilk hasar düzeylerini göstermek için, TK6 hücreler gir değişken seviyeleri maruz bırakıldı, ve elde edilen hücreler lize edildi ve bir nötr pH değerine (Şekil 5A) ile elektroforez işlemine tabi tutuldu. Bu kuyruklu kuyrukları morfolojisi alkalin deney koşullarında farklı olması dikkat çekicidir. Bu yöntem kullanılarak gözlemlenebilir parçalanmış DNA'nın elde edilmesi için, kullanılan IR dozu alkalin koşulları kullanılarak hasarı görmek için gerekli dozdan daha (0-100 Gy) önemli ölçüde daha yüksektir. Ayrıca, kuyruk uzunluğu nötr kuyruklu tahlil 7 kullanıldığında, DNA hasarının derecesini yansıtan en duyarlı bir parametre olduğunu bulmuşlardır. Analiz edilen doz-yanıt eğrisi, Şekil 5B'de gösterilmektedir. Hücrelerde DNA çift iplik kırılmalarının tamiri de tespit edilebilir ve Weingeist ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. ark. 7. Birlikte ele alındığında, nötr CometChip DNA DSBs yüksek verimlilik analizi için değerli bir araç sunuyor.

1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 1. H2O 2 doz alkali kuyruklu deneyi kullanılarak TK6 hücre cevabı. (A) 50 uM (orta) ve 100 uM maruz işlenmemiş TK6 lenfoblastların (üst) ve TK6 hücreleri (alt) H2O 2'den dizilmiş mikro kuyruklu 4 ° C'de 20 dakika karıştırıldı. Ölçek çubuğu 100 mikron. (B) Y, H2O 2 çeşitli seviyesine maruz TK6 hücre 2 O 2 doz tepkisi. Her veri noktası, en az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA, her bir deneyde de elde edilmiştir, üç bağımsız deneyin, ortalamasıdır. Hata çubukları üç bağımsız deneyler ortalamanın standart hatasını temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-1
Şekil 2. Inter-Numune ve Inter-Deneysel Değişkenlik. (A) Örnek-to-Örnek varyasyon. TK6 insan lenfoblast hücreleri 96 oyuklu çip 12 kuyu içine yüklenmiştir. Her bir kuyucuk 50 uM H 100 ul maruz bırakılmıştır 2 O2 4 ° C'de 20 dakika karıştırıldı. Hücre yok edilmekte ve hemen% Kuyruk DNA için analiz edilmiştir. Her çukurun veriler aşağıda gösterilmektedir. Her kutu medyan her kuyudan en az 50 bireysel kuyrukluyıldızların temsil eder. 12 kuyu ortalama ± standart sapma% 3.99 ve varyasyon katsayısı% 5.2 olduğu hesaplanır, 77.53% 'dir. (B) Deney-to-Deneyi varyasyon. TK6 insan lenfoblast hücreleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 75 uM H2O 2 100 ul maruz kalan, 96 oyuklu bir çip halinde yüklenmiştir. Hücre yok edilmekte ve hemen% Kuyruk DNA için analiz edilmiştir.Aynı deney, 6 kere tekrar edildi ve her bir tekrar veri gri bir çubuk olarak gösterilir. Her kutu, her tekrarında en az 100 bireysel kuyrukluyıldızların ortalama% kuyruk DNA temsil eder. 6 tekrarlarının ortalama burada tekrar bar olarak gösterilen, 49.57% 'dir. 6 tekrarlarının standart sapması% 4.99, ve ortalamanın standart hatası, şekil hata çubuğu olarak temsil edilen,% 2.04 olduğu hesaplanır.

figure-results-2
TK6 lenfoblastlardaki Şekil 3. H tamiri 2 O 2 -kaynaklı hasar. (A) şematik temsili kuyruklu yıldız ile tamir çalışma. TK6 hücreleri hasar maddeleri ile muamele edildi ve liziz önce 37 ° C 'de ortam içinde onarmak için izin verilir. (B) 4 ve # 20 dakika boyunca 50 uM, H2O ile muamele edildikten sonra 2 TK6 hücre onarım kinetiği176 C. Her veri noktası, en az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA, her bir deneyde de elde edilmiştir, üç bağımsız deneyin, ortalamasıdır. Hata çubukları yinelenen deneylerden ortalamanın standart hatasını temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
TK6 lenfoblastlardaki MNNG kaynaklanan hasarı Şekil 4,. Tamiri. TK6 hücreler, 4 ° C'de 30 dakika boyunca 0.1, 1 ve 3 mg / ml MNNG ile muamele edilmiş ve 120 dakika mesaja kadar 37 ° C'de ortam içinde onarmak için izin verilen maruz kalma. En az 50 ayrı kuyruklu medyan yüzdesi kuyruk DNA'sının üç bağımsız deneyin her biri için elde edilmiştir. Hata çubukları, standart hatayı temsil ederÜç bağımsız deneyden ortalamanın.

figure-results-4
40 Gy (orta) ve 80 Gy (alt) gama ışımasına maruz işlenmemiş TK6 lenfoblastların (üst) ve TK6 hücrelerden Şekil 5. Nötr kuyruklu deneyi kullanılarak TK6 hücre İR doz tepkisi. (A), bir mikro dizilmiş kuyruklu. Ölçek çubuğu 100 mikron. Işınlamanın çeşitli seviyesine maruz TK6 hücreleri (B), İR doz tepkisi. Her veri noktası çip üzerinde altı macrowells toplanan en az 300 kuyrukluyıldızların medyan kuyruk uzunluğu (um) temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevre ve insan hücreler içinde her yerde Genotoksinlerin kaçınılmaz stres ve hücresel DNA hasar gösterirler. Aslında, kararlı durumda 18 insan hücrelerinde bulunan DNA lezyonları 1,000s olduğu tahmin edilmiştir. Insanlarda hasar yatkınlık ve onarım kinetik anlamadan sadece temel araştırma anlayış getiriyor, ama aynı zamanda ilaç geliştirme yararlanır. Ironik kanser teşvik etmek için, DNA hasarının yeteneğine rağmen, DNA'ya hasar veren ajanlar, kanser tedavisi DNA hasarı hakkında bilgi alma ve kişiye özel ilaç ile ilgili tamir etmek için çok yüksek seviyelerde kullanılmaktadır. CometChip uzun var DNA hasarı tahlili devrim mikroimalat uygulamaları kullanan yeni araştırma cihazdır. Geleneksel kuyruklu testin aynı ilkeleri üzerine inşa çip önemli oranda daha yüksek ve daha iyi tekrarlanabilirlik sağlar. Biz burada bu çip kullanan yöntemleri açıklanmaktadır. Kendi programını ve sağlamlığı açıklığa kavuşturmak için, sağa sola sonuçlarını göstermekm çip birkaç farklı DNA hasar maddeleri ile hasarını değerlendirmek için kullanılmıştır ve bu DNA onarımını değerlendirmek için burada kullanıldığı pek çok deney. Birlikte, burada sunulan sonuçlar çip kullanan için yararlı bilgiler sağlar ve DNA hasarı ve onarımı üzerinde yapılan araştırmaya geniş uygulanabilirliğini göstermek.

Bu protokolde en önemli adımlardan biri etkili bir hücre yükleme gerçekleştirmek. Birçok hücre hatları süspansiyonu ve yapışık hücreleri de kapsayan, bu sistem üzerinde test edilmiştir. Verimliliği yüklüyor, hücre tipi, hücre boyutu, yükleme konsantrasyon ve zaman gibi pek çok değişkene bağlıdır. Böyle lenfoblastoid hücreler gibi süspansiyon hücre hatları ile çalışmak için en kolay olanıdır. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonu 96, oyuk başına 10 Nisan - 10 Haziran hücrelerden değişebilir ve yükleme süresi 15-30 dakika içerisinde tamamlanır. Daha yüksek hücre yoğunluğu yüklenmesini kolaylaştırır ve mikro oyuk içine yerleşmek için hücreler için gerekli süreyi kısaltır.

Yapışık hücreler için yükleme parametreleri süspansiyon hücreleri farklı olabilir. Bu Çin hamster yumurtalık (CHO) hücreleri, hem hücre çizgileri süspansiyon hücreleri olarak benzer yükleme verimliliğini (alttaki tripsinizasyon) olduğu ve bu nedenle benzer yükleme koşulları kullanarak saptandı. Bu kolayca süspansiyon hücre agregatları oluşturmaz tümör hücreleri gibi diğer hücre tipleri, ek bir işlem gerektirebilir. Süspansiyon, ortam, tripsin, tek bir hücre, hücre süspansiyonları bir filtreden geçen ekleme ve yükleme esnasında hücre kümelerinin oluşumunu bastırabilir. Son olarak, yükleme süresi bakımından, süre 20 dakika ile 1 saat arasında değişebilir mikroçukurlarda yapışık hücre çizgileri yakalamak için gereklidir. Sonuç olarak, kullanıcıların daha ileri tetkikler geçmeden önce en uygun yükleme koşulları belirlemek için pilot deneyler gerçekleştirmeniz tavsiye edilir. Yükleme etkinliği DAPI'nin veya diğer DNA ile kapsüllü hücreler boyanarak daha doğru ortaya parlak bir alan mikroskobu altında görüntülendi veya olabilirfloresan mikroskop altında değerlendirme öncesinde lekeleri.

Bu yöntemin ve çipin bir büyük avantajı esnekliktir. İlk olarak, aşırı hücreler yıkanır, çünkü araştırmacılar, belli çalışma hücre konsantrasyonu ile sınırlı değildir ve mikrodizi homojen kuyruklu yıldıza yoğunluğu sağlar. İkinci olarak, mikro-farklı boyutlarda hücre türlerine uyum sağlamak için, farklı boyutlarda yapılabilir. Birden fazla hücre tek MicroWell yakalanır koşullar altında, çok hücreli kuyruklu kendini kalibre ve verimi, tutarlı sonuçlar, tek bir hücre kuyruklu 6,7 kıyasla,. Mikroarreylerinin hücreleri desenlendirme bir diğer yararı tüm kuyrukluyıldızların nedeniyle odaklanmamış kuyruklu gürültüyü azaltmak ve otomatik görüntüleme ve analiz kolaylaştıran, sabit pozisyonları ile aynı odak düzlemi sonra olmasıdır. CometChip sağladığı verim ve hassasiyet açısından önemli gelişmeler büyük ölçekli çalışmalar için, tahlilin uygulanmasını sağlar. Birlikte ele alındığında, çip sağlamakaraştırmacılar, toksikoloji, klinisyenler ve epidemiyologların DNA hasarı değerlendirmesi için sa değerli bir araçtır.

Kuyrukluyıldız tahlil DNA hasarının geniş bir saptamada mükemmel hassasiyet için bilinen iken, bu deney aynı zamanda düşük özgüllüğü muzdarip. Bu protokol kullanılarak büyük ölçüde tahlilin tekrarlanabilirliğini ve veri akışını arttırır ancak spesifitede bir ilerleme anlamına gelmez. Bununla birlikte, diğer yöntemlerle, tahlil daha yüksek bir kesinlik elde etkili olduğu bildirilmiştir multiplekslemesi. Bir örnek saflaştırılmış lezyon-spesifik enzimlerin dahil. Bu enzimler tespit iplikli kırılmalara ve abasic sitelerine 1,19-21 içine aksi saptanamayan baz lezyonları dönüştürebilirsiniz. Yaygın kullanılan bir örnek oksidatif DNA değişiklikleri 19,22 ortaya onarım endonükleaz formamidopyrimidine-DNA glikosilaz (APG), olduğunu. Enzim sindirimi aşaması, hücre lizizi sonrasında uygulanır için, sistem aynı şekilde tedavi edilebilir aprotokole değişiklikler olmadan sa geleneksel agaroz slayt. Ayrıntılı bir protokol burada tarif edilmemiş olsa da, bu yaklaşım geçmişte birçok geleneksel kuyrukluyıldız tahlil kullanıcılar tarafından adapte edilmiş ve protokolleri kolaylıkla bulunabilir. Bir önceki yayın, floresan ışık hasarını 22 tanımlamak için bu yöntem kullanılır.

Bu yöntemin en büyük avantajı, daha önce neredeyse imkansız olan çalışmalara kapılarını açıyor sağladığı verim vardır. Aynı platform üzerinde 96 örnekleri işleyen yeteneği değil, sadece emek ve zamanı azaltır, aynı zamanda deneysel gürültüyü azaltır ve büyük ölçüde tekrarlanmasını arttırır. Inter örnek varyasyon bu çip 6,7 ile gözlenen varyasyon daha 2 kat yüksek olabilir geleneksel slayt-to-slayt varyasyon, önemli ölçüde daha düşüktür. Azaltılmış gürültü de örnekler arasında daha ince farklar ortaya çıkarılmasını sağlayacak, gelişmiş duyarlılık yol açar. Cihaz bir sta istihdam çünkündard 96-iyi biçimi, genel araştırma ekipmanları ile uyumlu ve teknolojileri HTS. Ortalama bir araştırmacı ~ birkaç gün boyunca 30 cam slaytlar işleyebilir olduğunu varsayarak, 100 numune değerlendirmesini gerektiren bir çalışma düşünün. Her bir örnek üç kez gerçekleştirilmesi gereken olduğu göz önüne alındığında, bu da kaçınılmaz olarak örnek varyasyonu için numune muzdarip olan böyle bir çalışma tamamlamak için yaklaşık bir ay sürer. Bunun aksine, bu çip ile işleme koşulları 100, her biri üçlü halde, sadece bir kaç tabak gerektirir ve üç gün içinde gerçekleştirilebilir. Geçirilendeki Bu önemli gelişme, daha önce ulaşılamaz olan çalışmalara kapıyı açar.

Burada sunulan protokol, standart kuyrukluyıldız tahlilini yapmak için temel prosedürleri ve CometChip platformu kullanmak için gerekli modifiye adımları anlatılmaktadır. Doğal DNA hasar seviyelerini ve sonraki onarım yanıtı hem ölçmek için yeteneği ile, tahlil son derece alakalıbiyolojik ve klinik uygulama çeşitliliği. Genom üzerinde belirli kimyasal maruziyetin etkisi hakkında bilgiler, hastalıkların önlenmesi ve tedaviyi kolaylaştırır. Ayrıca, DNA hasarı duyarlılık ve bireyler 23,24 arasında onarım kapasitesinde varyasyonları belirlemede önemli ilgi de var. Bu teknik, büyük ölçekli çalışmalar için gerekli verimi sağlar. Arası bireysel varyasyonlar hakkında bilgi duyarlı insanları tanımlamak için ve bireyselleştirilmiş tedaviler veya önlemler stratejileri tasarlamak için önemlidir. Burada sunulan teknoloji yakın gelecekte bir standart metodoloji olma potansiyeline sahip, yüksek verim, objektif ve kantitatif DNA hasarı analiz platformu sağlar, birlikte ele alındığında.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CometChip, Wood, Weingeist, Bhatia ve Engelward'ı içeren bir patent başvurusuna dayanarak Trevigen, Inc.'e lisanslanmıştır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, öncelikle 1-R21-R44-ES019498 ve ES021116 kısmi desteği ile 5-UO1-ES016045 tarafından destek oldu. DMW Çevresel Toksikoloji T32-ES007020 yılında NIEHS Eğitim Grant tarafından desteklenmiştir. Ekipman Çevre Sağlığı Bilimleri P30-ES002109 için Merkezi tarafından sağlandı.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
UltraPure LMP Agaroz (düşük erime noktası)Invitrogen16520Birden fazla tedarikçi
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1xGibco by life technologies14190Çoklu tedarikçiler
Kristal NaClMacron Kimyasalları7581-06Çoklu tedarikçiler
Kristal Na2EDTAMacron Kimyasalları4931-04Birden fazla tedarikçi, Tahriş Edici
Kristal Tris (baz)Sigma-AldrichT1503Birden fazla tedarikçi, Tahriş Edici
Kristal Tris (asit)JT.Baker4106Birden fazla tedarikçi
Kristal N < / em >-lauroylsarcosineSigma-AldrichL9150Çoklu tedarikçiler, Solunduğunda oldukça toksik, Tahriş edici
Triton X-100Sigma-AldrichX100Çoklu tedarikçiler, Yutulması halinde zararlıdır., Tahriş edici
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD4540Çoklu tedarikçiler, Yanıcı Sıvı, Hedef Organ Etkisi
Kristalin NaOHMacron Kimyasalları7708-06Çoklu tedarikçiler, Aşındırıcı
Hidroklorik asitVWRBDH3871Çoklu tedarikçiler, Aşındırıcı
Kristalin borik asitSigma-AldrichB6768Çoklu tedarikçiler, Hedef Organ Etkisi, Teratojen, Üreme tehlikesi
CometChipTrevigenDağıtım için geliştirilme aşamasında, gerekli malzemeleri elde etmek için doğrudan Trevigen ile iletişime geçin
1 kuyulu çanakThomas Scientific73521-420
Dipsiz 96 kuyulu plakaVWR655000-06
1.5 'bağlayıcı klipslerZımbaBirden fazla tedarikçi
Cam plakaEtiket Donanım96 oyuklu plakanın boyutuna göre özelleştirilmiş
Baykuş Yatay Elektroforez SistemiVWR27372-131Çoklu tedarikçiler
PowerPac Temel Güç KaynağıBio-Rad164-5050Birden çok tedarikçi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
  2. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
  3. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  4. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
  5. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
  6. Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
  7. Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
  8. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  9. Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
  10. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
  11. Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
  12. Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
  13. Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
  14. McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
  15. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
  16. Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
  17. Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
  18. Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
  19. Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
  20. Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
  21. Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
  22. Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
  23. Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
  24. Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CometChipDNA DamageComet AssayHigh throughput ScreeningMicroarrayed CellsAlkaline LysisElectrophoresisFluorescence ImagingGenotoxicity TestingCell Loading

Related Articles