Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması Uygulanan Hücrelerinin Permeabilization

9.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50612

⸱

4 Eylül 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chemical Engineering, McGill University, 2Montreal Heart Institute

Bu makalede

Özet

Bu protokol, bir atıl gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelerin geçici nüfuziyet için bir yöntem tarif etmektedir. Bu teknik, plazma zarını bozan mekanik kuvvetlerin kullanılması ile yapışık memeli hücrelerine genetik malzeme ve biyomoleküllerin transferini kolaylaştırır.

Özet

Çeşitli hücre transfeksiyon teknikleri var ve bu üç geniş kategoriye ayrılabilir: viral, kimyasal ve mekanik. Bu protokol, geçici olarak hücrelerin içine normal olarak geçirgen makromoleküllerin transferini kolaylaştırmak için bir inert gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelere nüfuz edilebilir kılınması için mekanik bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, mikro gözenek geçici oluşumu ile sonuçlanan, yapışkan hücrelerin plazma zarı üzerinde kesme kuvvetleri aktarmanın çalışır inanıyoruz. Bu gözenekler oluşturulur sonra, hücreler daha sonra, genetik madde ve diğer biyomoleküllerin geçirgendir. Kullanılan mekanik kuvvetlerin kendi alt-tabakaya kalıcı ya da zarar ayırma hücre riski yoktur. Teknik etkili olan atıl gaz dinamiği dar bir aralık, bu nedenle bulunmaktadır. Bir atıl gaz jet HeLa, HEK293 ve insan abdominal aort endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre çizgileri yapışkan geçirimli de etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, p için uygunbunun gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda potansiyel olarak araştırma ve kullanılabilir gösteren in vivo olarak gösterdiği gibi, in vitro ve hem de yapışık hücre ermeabilization. Ayrıca, değerli bir araştırma aracı olarak kanıtlamak olabilir ki, uzaysal olarak kısıtlayıcı bir şekilde hücrelerin geçirgenleştiren avantajına sahiptir.

Giriş

Biyotıbbın evrim ve hücre mekaniği anlayışı ile, hücre içine biyomoleküllerin teslim birçok araştırma alanları ve tıbbi tedaviler için hayati hale gelmiştir. Farklı teknikler plazma zarı ve hücre sitozolüne yabancı molekülleri tanıtmak için geliştirilmiştir. Viral, kimyasal ya da mekanik teknikler: Bunlar genellikle ya olarak sınıflandırılabilir. Viral teknikleri, viral vektörleri 1 kullanarak, RNA ve DNA gibi genetik malzemeyi transfekte olabilir. Viral teknikleri ancak bunlar immün ve enflamatuar reaksiyonlar 2 için potansiyel var, bazı hücre kuşaklarında yüksek verimliliğe sahip olma eğilimindedir. Genel kimyasal transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat 3, 4 bakteriyel ekzotoksin ve lipofeksiyon 5 ile çökelmesini içerir. Bu teknikler etkili olduğu kanıtlanmıştır, ancak bazı sorunlar, hücre toksisitesi ve non-özgüllük olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, bu tür kalsiyum fosfata gibi tekniklere nadiren çökelme primer hücrelerde 6, en fazla% 70, ancak sadece belli hücre hatlarında transfeksiyon verimliliği sahip olduğu tespit edilmiştir. Artan araştırma çabaları, özellikle klinik kullanımı ve DNA işleyişi çalışma için çeşitli tedaviler tasarımı durumunda, primer hücrelerin içine koymak ediliyor gibi bu notun olduğunu.

Mekanik uyarıcılara yoluyla hücre zarının zamansal bozulması hücre içine yabancı moleküllerin sokulması için bir alternatiftir. Teknikler şunlardır: molekül 7 mikroenjeksiyon, membran 8,9 bozmak için bir elektrik alanı kullanılarak elektroporasyon, sonoporation ile bağlı parçacıklar sürgünler "gen tabancası" ile gösterildiği gibi, hücre zarını, 10-12, partikül bombardımanı bozmak için ultrason dalgaları kullanarak hücrenin 13 içine genleri, ve son zamanlarda, memeli hücreleri geçici olarak 14,15 permeabilize gösterilmiştir akışkan kesme stresi uygulaması. Her ne kadar mekanikal yöntemleri yukarıda belirtilen sorunların bazılarını önlemek için, tipik olarak daha düşük verim ve son derece karmaşık ve uzman düzeneklerinin eşlik eder. Bir atmosferik basınçta ışıltılı tahliye meşale (APGD-t) yüzeyler işlevselleştirilmesiyle ve in vitro 16 yapışık hücreleri ayırmanın ilk hedefi ile McGill de geliştirilmiştir. Tesadüfen çok kullanılan canlı / ölü leke nasılsa bir geçirimli madde eklenmeden hücreleri tarafından alınan edildiğini keşfedildi. Ayrıca, bu sadece meşale yolu ile maç oldu kuyu kısıtlı alanlarda meydana gelmiş gibiydi. APGD-t permeabilization yetenekleri soruşturma devam etti ve kontrol çalışmaları, bu uyarımı olmadan plazma taşıyıcı atıl gaz püskürtüsü da permeabilize hücrelerin mümkün olduğu bulunmuştur. Bu plazma jeti tarafından oluşturulan reaktif türler geçici membran fonksiyonu bozulmuş ilk hipotezi çeliştiğini ve önerilen basit mekanik olduğunucal kuvvetler hücre geçirgenliği neden için yeterli idi. Buradan itibaren, çalışmalar denemek ve ölçmek ve Permeabilization inert gaz jetinin etkinliğin yanı sıra tranfeksiyon yetenekleri 16 bakmak karakterize bizim laboratuvarda devam etti.

Bu çalışmalar sayesinde, mikro-plazma membranında gerçek biçimde yapmak olduğu bulunmuştur ve bu gözeneklerin yaklaşık 5 saniye 15 içinde yeniden mühürlemek için eğilimindedir. Bir piliç embriyo koriyoalantoik zara in vitro ve in vivo olarak tekniğin yarar göstermiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. LabView Programının Geliştirilmesi

  1. Bir kütle akış kontrol cihazı (MKS M100B Mass-Flo Controller) kesin bir gaz akış oranı sağlamak için helyum gazı hattına bağlanmıştır. Bu birim, 0 ve 5 V LabView programındaki bir kontrol döngüsü herhangi bir zamanda gerekli voltaj tespit arasında değişen bir giriş gerilimi ile kontrol edilir. Bilgisayar ve arayüz arasındaki kütle akış kontrolörü bir veri toplama cihazı (NI USB-6009) tarafından gerçekleştirilen ve 12 V güç kaynağı kütle akış kontrol için güç sağlar.
  2. İki pozisyonlama lineer slaytlar 6-plaka, her yön için bir hareketini kontrol etmek için kullanılır. Her derleme bir adım motor ile birleştiğinde bir MA15 serisi Velmex Unislide Meclisi oluşur ve her iki meclisleri Motor Kontrol Stepping tek Velmex VXM tarafından kontrol edilir. Kontrolör, her motorun manuel koşu için izin verir veya harici seri bir komut kabul, kombinasyonu spesifik hareket p izinatterns. Çeşitli desenler sadece istenilen meşale hızı hem de yol boyutları sağlamak için kullanıcı gerektiren, LabView programa programlanabilir.

2. Ekipman hazırlanması

  1. Helyum silindiri ve regülatörü hem açın.
  2. Motor kontrol açın.
  3. LabView programını açın ve tüm koşullarını doğrulayın.
  4. Platform merkezli olduğundan emin olun. , Her kontrol motor aşamada bakmak ve her vagon aşama sonunda da yakın olmadığını doğrulamak için. Program merkezi arabaları ya da elle motor kontrol önündeki koşu denetimleri kullanarak ayarlayın ya.
  5. Bu günün ilk çalışma ise, kurulum düzgün çalıştığından emin olmak için, hücreleri olmadan bir kez programı çalıştırmak için tavsiye edilir.

3. Kılcal gaz püskürtüsü Nozul Yükseklik hazırlanması

  1. Tutucudan kılcal çıkarın ve yükseklik kadranı sıfır.
  2. 6-delikli plaka o yerleştirinn platformu.
  3. Değiştirin ve kapak kayma edecek kadar kuyunun dibine gaz jet kılcal daha düşük. Tutucuya kılcal elde edin.
  4. Yükseklik kadranının kullanılması, kılcal 3 mm yükseltmek. Kılcal bazında bu yüksekliğe işaretleyin.
  5. Güvenli bir yüksekliğe kılcal kaldırın ve daha sonra 6-çukurlu plaka çıkarın.

4. Hücre Permeabilization Protokol

  1. Cam kapak üzerinde izdiham Kültür yapışkan hücre hattı, standart kültür teknikleri kullanılarak, 6-çukurlu bir plaka içerisinde kayar. HeLa hücreleri için, tohum 6-çukurlu, oyuk başına 2 x 10 5 hücre plakaları ve tedavi öncesi 48 saat için inkübe edilir.
  2. İstenen vektörü içeren çözeltinin uygun hacmi hazırlayın. HrGFPII-1, 1 x PBS içinde 50 ng / ul 'lik bir konsantrasyon HeLa hücrelerinde güçlü bir floresan sinyali transfeksiyondan sonra 24 saat için, içerir. Dekstran çalışmaları için, 10 kDa, yeşil fluoresan dekstran 80 ug / ml önerilir. Bundan sonra, bu çözelti, adlandırılacaktırs "vector çözüm".
  3. Kuyudan hücre kültürü ortamını çıkarın ve 1x PBS ile üç kez çalkalayın.
  4. Kuyuya aşama 4.2 'de hazırlanan vektör çözeltisi 1.370 ul Pipet. Bu, yaklaşık 1.3 mm'lik bir derinliğe sıvı ile sonuçlanmalıdır.
  5. Platformun merkezinde vektör çözeltisi içeren kuyu yerleştirin. Sürgünün üzerinde 3 mm'lik bir meme yüksekliğinin gösteren önceden işaretli seviyeye gaz püskürtme memesi indirin.
  6. LabView programında helyum akış hızını ayarlamak ve kullanılacak istenilen hareket desen seçin. Zaman Permeabilization protokolü başlamak için hazır "Çalıştır" seçeneğini seçin. Kütle akış kontrol cihazı için gerekli akış oranını temin etmek üzere hazırlanıyor sırasında bir ilk gecikme süresi olacaktır. Uygun akış hızı ulaşıldığında, LabVIEW programı istenen permeabilization desen iyi hareket için kademeli motora aktive edecektir. Platformu durduktan sonra, yaklaşık 30 saniye bekleyin ve vektör çözüm kaldırmak.Not: Optimal permeabilizasyon kılcal çapına bağlı olarak, meme çıkışında 100-200 Pa bir dinamik basınç yakınında meydana gelir.
  7. 1x PBS ile de üç kez yıkayın.
  8. Taze kültür ortamı ile iyi doldurun.
  9. Deneylerin istenilen sayıda 4.6 - 4.3 adımları tekrarlayın. Not: onlar üzerinde yürütülüyor gaz jetsız vektör çözümü ile dolu olan kuyuların oluşmaktadır kontrol örnekleri yer alıyor emin olun. Adımlara 4.5 ve 4.6 için devam yaklaşık olarak 1 dakika boyunca, kontrol çukurlarındaki çözelti bırakın.
  10. Bir hrGFP transfeksiyon deneyi çalışan ise, transfekte edilmiş hücreler tarafından malzeme transkripsiyonu izin vermek için 24 saat boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür. Bir dekstran permeabilizasyon deney çalışan takdirde, yaklaşık 15 dakika boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür.

5. Hücre Görüntüleme

  1. İsterseniz, hemen önce görüntüleme, hücre ölümünü değerlendirmek için uygun ölü / canlı leke ile counterstain.
  2. Approp ile Görüntü hücrelertransfeksiyon / permeabilizasyon etkinliğini araştırmak için yaklaşımlarına yön mikroskop.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir 0.86 mm iç çap kapiller ile bir helyum gaz püskürtüsünün kullanılarak 10 kDa yeşil floresan dekstran ile HeLa hücre Permeabilization Şekil 1 'de gösterilmiştir. Hücreler hemen hücre ölümünü görselleştirmek için 2 ul / ml EthD-1 çözeltisi (LIVE / DEAD Canlılık / Sitotoksite Kit) ile geçirgenleştirmeden sonra zıt. Hemen counterstaining ardından, kapak fişleri monte edilmiş ve görüntülenmiştir. Bu şekil, bir kontrol numunesi ile karşılaştırıldığında, üç farklı çıkış basınçlarda helyum gaz püskürtüs...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Inert gaz jet permeabilizasyon yapışık hücre transfeksiyonu için yararlı bir tekniktir. Bu, zararlı kimyasal maddeler ya da viral vektörler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır mekanik kuvvetlerin kullanımı ile hücrelere biyomoleküllerin aktarma yeteneği sağlar. Teknik potansiyel araştırmacılara ve klinisyenlere hassas hücreleri transfect verimli ve nispeten basit bir yol verebilir. Nüfuziyet seçiciliği de araştırmacılar sadece çok uygulamalarda yararlı olabilir, tek bir koloni bazı hücreleri tedavi etmek için izin benze...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Teşekkürler

Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC): Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Vitality hrGFPII-1Agilent Technologies Canada240143-57HeLa hücreleri üzerinde transfeksiyon deneyleri için yeşil floresan proteini
Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, Anyonik, Tamir Edilebilir Yaşam TeknolojileriA.Ş.Geçirgenlik deneyleri içinD22910
CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite KitiYaşam Teknolojileri A.Ş.Memeli hücrelerinin karşı boyanması içinL3224
sırasında slaytları monte etmek içinProlong Gold Antifade ReaktifiInvitrogenP36930
Ultra Yüksek SaflıktaHelium Praxair Canada Inc.HE 5.0UH-T 
Hyclone DMEM / Yüksek Glikoz Ortamı - HeLa hücreleri için 500 mlThermo ScientificSH30022.01
Fetal Sığır SerumuInvitrogen26140079DMEM ortamı için
Penisilin-Streptomisin, sıvıInvitrogen15140-122DMEM ortamı için
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 1xLaboratuvarda üretilmiştir
 Tablo 1. Gerekli reaktiflerin listesi
6-Kuyulu Şeffaf TC ile İşlem GörmüşMikroplakalar Corning3506 
#1 22 x 22 LamelFisher12-542B 
Cam KılcalDamarlar Dünya Hassas AletlerWPI Boyutlandırma Bilgileri
Kimlik (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Sipariş #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Kontrol CihazıMKSM100B01314CS1BVKütle akış kontrolörü, M100B Serisi, harici bir 12 V güç kaynağı gerektirir
USB-6009 DAQ CihazıUlusal Aletler779026-01 
Step motorlu ve kontrolörlü UniSlide DüzeneğiVelmexVelmex tarafından sağlanan Vexta 1.8 derece kademeli motorlarla donatılmış ve bir VXM Step Motor Kontrol Cihazı tarafından kontrol edilen iki seri MA15 UniSlide Tertibatı
;Tablo 2. Gerekli ekipman listesi
dekstranGörüntüleme

Kaynaklar

  1. Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
  2. Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
  3. Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
  4. Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
  5. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
  6. Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
  7. Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
  8. Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
  9. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
  10. Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
  11. Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
  12. Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
  13. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
  14. Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
  15. Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
  16. Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
  17. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
  18. Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101(2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hücre GeçirgenleştirmeAdherent HücrelerHelyum Gaz JetiKütle Akış KontrolörüKonumsal GeçirgenlikMikrogözenek Oluşumuİmmünofloresan MikroskopiGaz Akış HızıKapiler Nozul
Bir atıl gaz püskürtüsünün kullanılması Uygulanan Hücrelerinin Permeabilization
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.