Method Article

Tek Adacık Düzeyde Oksijen mikroçevresinin Nicel ve Geçici Kontrol

DOI:

10.3791/50616

⸱

November 17th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan-Dearborn, 2Department of Surgery/Transplant, University of Illinois at Chicago, 3Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroakışkan oksijen kontrol biyolojik deneyler için hipoksik odaları üzerinde sadece kolaylık ve hız daha fazla bahşeder. Bir zarından difüzyon yoluyla uygulanan, özellikle mikrofluidik oksijen mikro-düzeyde eşzamanlı sıvı ve gaz fazı modülasyon sağlayabilir. Bu teknik, adacık patofizyolojisi çalışmak için dinamik çok kritik parametre deneyler sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek bir teknik glikoz uyarıcı salgılama birleştirme faktörler aynı anda oksijen ve izlenmesi özellikle transplant ortamlarda, adacık hipoksi fizyopatolojik durumlarını modellemek için çok önemlidir. Standart hipoksik odası teknikler aynı anda hem uyarılmalara modüle ne glikoz uyarı-sekresyon bağlama faktörlerin gerçek zamanlı izleme sağlayamaz. Bu zorlukları gidermek için, bir difüzyon membranı aracılığı ile sulu ve gaz fazı modülasyon hem de entegre bir katmanlı mikroakışkan tekniği uygulandı. Bu floresan mikroskobu ile yukarıda belirtilen birleştirme faktörlerin izlenmesi sağlayan saydam polidimetilsiloksan (PDMS) cihazı içinde microscaled adacık etrafında bir uyarım sandviç oluşturur. Buna ek olarak, gaz giriş% 0-21 arasındaki oksijen kantitatif, alt dakika modülasyonu sağlayan microdispensers bir çifti tarafından kontrol edilir. Bu aralıklı hipoksi ada yeni bir fenomen araştırmak için uygulanırt önşartlandırma. Ayrıca, multimodal mikroskobu ile donanmış, bu hipoksik olaylar sırasında ayrıntılı kalsiyum ve K ATP kanal dinamiklerine bakmak başardık. Biz adacıklar okuyan yanı sıra birçok ex vivo dokular değerli bir araç olarak, mikroakışkan hipoksi, özellikle bu eş zamanlı çift faz tekniği öngörülüyor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik hipoksi özellikle adacık nakli için, biyolojide önemli

Dinamik Hipoksi çok biyolojik dokuda önemli bir fizyolojik hem de patofizyolojik bir parametredir. Oksijen değişim, örneğin, anjiyojenezin güçlü bir gelişim sinyaldir. Ayrıca, hipoksi mekansal ve zamansal desenler HIF1-alfa modüle ve pankreas kanseri gibi hastalıklarda rol oynar. Hipoksi aynı zamanda adacık nakli sonuçlarını etkileyen karıştırıcı bir faktör olduğunu. Son zamanlarda, hipoksi veya aralıklı hipoksi (İH) zamansal olarak salınımları "önşartlama" adacık 1 faydalar göstermiştir. Ancak, adacık fizyoloji statik ve geçici hem hipoksi etkisi de öncelikle nedeniyl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Fare Islets hazırlanması

  1. C57BL / 6 fareleri inceleyin ve kollajenaz sindirimi ve Ficoll yoğunluk gradyan ayırma ile izole adacıklar. (2,3 başvurulan JOVE makalelere bakın).
  2. % 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve Petri tabaklarında 20 mM HEPES ihtiva eden RPMI-1640 ortam maddesi içinde inkübe adacıklar (37 ° C,% 5 CO2). Post-izolasyon, kültür deneylerinde kullanılmadan önce 24 saat boyunca adacıklarının. Tutarlı sonuçlar için 1-2 gün içinde adacıklar kullanın.

2. Mikroakışkan Platform Yapımı

  1. Her cihaz katman için şeffaflık PHOTOMASKS üzerinde mikro geometrileri oluşturmak: 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu adacık hipoksi tekniğe Central dakika ölçekli geçici ile aynı mikroakışkan odası içinde, sulu ve gaz fazı stimülasyon modüle etme yeteneğidir. Şekil 1 a) temsil eden bir sonucu olan doku adacığı bölmesi içinde ölçülen çift uyarılması ve b) hızlı bir modülasyon. Odacık içine fluoresein getirilmesi ile gösterilen sulu modülasyonu, karıştırma 3-4 dakika içinde bir denge elde edilir. Ayrıca, oksijen 2 dakika gibi kısa sürelerle ile oksijen bisiklet sağlayan, hızlı, geçici ile 5-21% istifa edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu adacık hipoksi tekniğin entegre çoklu yöntemler mevcut birkaç puan sorun giderme için burayı kaydetti. İlk izole adacıklar aşağılamak nedeniyle asiner hücrelerden sindirim enzimleri kültür çözülmeye devam ediyor. Doku adacığı izolasyonu sonra 1-2 gün için deneyler standartlaştırılması tutarlı sonuçlar elde etmek, böylece önemlidir. İkincisi, sulu akış laminer akışı ve difüzyon arasındaki sınırda konvektif boşluğunu önlemek için hipoksi ve aralıklı hipoksi sırasında durduruldu. Bu adacık önkoşullanmanın süresini sınır.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Sağlık Hibeler R01 DK091526 (JO), NSF 0.852.416 (DTE) Ulusal Enstitüleri, ve Chicago Diyabet Projesi tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
SpinnerLaurellWS-400
SU8MicroChemSU8-2150/SU8-2100
Dijital Ocak GözüPMC Dataplate722A
UV Kürleme LambasıOmniCureS1000
PMDSDow ChemicalSylgard 184
Corona DeğnekETPBD-20AC
Vakum OdasıBel-Art420220000
MikrodağıtıcılarThe Lee CompanyIKTX0322000A
5 V ve 20 V DC GüçRadyo Kulübesi
NI USBUlusal EnstrümanNI USB-6501
TermometreOmega Mühendislik, Inc.
Peristaltik PompaGilsonMinipulse 2
Oksijen SensörüOkyanus OptiğiNeoFox
Fraksiyon ToplayıcıGilson203
PippetteFisher ScientificFinnpipette II 100μ l
Ters Epifloresan MikroskobuLeicaDMI 4000B
50 ml Konik TüplerFisher Scientific
Fura-2 Floresan BoyaMoleküler Probları, Yaşam Teknolojileri
Rhodamine 123 Floresan BoyaMoleküler Probları, Yaşam Teknolojileri
KültürOrtamı Sigma-AldrichRPMI-1640
HEPESSigma-Aldrich
GlikozSigma-Aldrich
Sığır Serumu AlbüminSigma-Aldrich
30 Silikon TüplerdeCole-Parmer1/16 inç x 1/8 inç
1.5 ml Eppendorf TüpleriFisher Scientific
Y-konektörlerCole-Parmer1/16 inç ve 4 mm
Şırınga KonnektörleriCole-Parmerdişi Luer fişi 1/16 inç
Düz KonnektörlerCole-Parmer1/16 inç
Dirsek KonektörüCole-Parmer1/16 inç

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
  2. Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreati....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic HypoxiaOxygen ModulationIslet IsolationFluorescence MicroscopyPDMS DeviceGas Permeable MembraneCalcium DynamicsKATP ChannelIntermittent HypoxiaGlucose Stimulus

Related Articles