Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Özet

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Özet

Inanılmaz esneklik ve plastisite korurken, tutarlı, kalıplaşmış bir şekilde dış uyaranlara tepki oldukça akışkan organ olmasına rağmen sinir sistemi genellikle vücudun bir kablolu bileşeni olarak tanımlanmaktadır. Merkezi sinir sistemi farklı (MSS), periferik sinir sistemi (PNS) önemli tamir yeteneğine sahiptir, ama biz sadece bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamaya başladı. Bir model sistem olarak Zebra balığı kullanarak, in vivo görüntüleme ve genetik manipülasyon ile çift rejeneratif çalışmalara benzersiz bir fırsat var. Periferik sinir glia ve bağ doku tabakaları ile çevrili akson oluşmaktadır. Aksonlar perinöriyum adlı bir cep kılıf ile bir fasikül içine sarılmış da olan Schwann hücreleri, myelinating veya olmayan myelinating tarafından ensheathed edilir. Bir yaralanma sonrasında, yetişkin periferik sinir remo için muazzam bir kapasite varve aksonal enkaz ve yeniden innerve hedefleri zarar. PNS rejenerasyon tüm periferik glia rollerini araştırmak için, burada canlı transgenik zebrafish motor sinirleri axotomize ticari olarak satılan azot pompalı dye lazer kullanan bir akson transection tahlil açıklar. Biz daha fazla yaralı ve kontrol sinirlerin zaman atlamalı görüntüleme için bu deneyleri birkaç yöntemleri açıklar. Bu deneysel paradigma sadece glia sinir rejenerasyonu oyun değil, aynı zamanda sinir sistemi onarım yöneten moleküler mekanizmaların tanıtılması için bir platform olabilir rolünü değerlendirmek değil kullanılabilir.

Giriş

Zebra balığı nedeniyle optik şeffaflık sinir sisteminin geliştirilmesi çalışma ve transgenesis kolaylığı, hangi birleştiğinde, bir canlı embriyo dinamik hücre davranışları muhteşem görüntüleme sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebrabalıkları ve hemen hemen her memeli sinir sisteminin oluşumu, bu model organizma toplanan hücresel ve moleküler bilgileri için gerekli olan genleri paylaştığından Buna ek olarak, başka bir omurgalı türünün ile doğrudan ilişkilendirilebilir. Nöral gelişim çalışmaları için inanılmaz güçlü olsa da, Zebra balığı ve eşsiz özellikler de yaralanma sonrası sinir sistemi korumak ve yeniden mekanizmaları aydınlatmak için potansiyel var. Zebra balığı larvaları geç larva dönemlerinde onların translusensi korumak ve pigmentasyon etkili melanin üretimini veya pigment hücreleri eksikliği genetik mutantlar farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı ya ile bloke edilebilir. Bu nedenle, bu model organizma kullanarak yaralanma ve rejenerasyon çalışmayaşlı hayvanlarda iyon mevcuttur ve doğrudan sinir sistemini yeniden hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Bu yazıda, verimli ve tekrarlanabilir Zebra balığı larvalarının PNS içinde sinirler zarar nasıl açıklar. Bu yaralanma paradigma periferik glia ve bağışıklık hücrelerinin yanıtları yanı sıra rejenerasyon sırasında bu nüfus arasındaki etkileşimleri de dejenerasyon sadece eğitim için oldukça rahat, ancak.

PNS bir organizma çevre ile etkileşim ve hayatta kalmak için izin, merkezi sinir sistemi (MSS) ve cilt, organlar ve vücudun kas arasında bilgi aktarmak için gerekli olan motor ve duyu sinirleri karmaşık bir ağdır. Bu sinirler birlikte, Myelinating ve non-myelinating Schwann hücreleri ve perineurial Glia, yanı sıra bağ dokusu, aksonların örten ve sonuçta sinir olgun formu dahil olmak üzere çevresel glia. Bu sinirlerin yaralanması süreci k başlatırWallerian dejenerasyon ¹⁰ olarak nown. Aksonal parçalanma, bağışıklık işe alım, enkaz temizleme ve yenilenme Bu mekanizma çok kalıplaşmış ve genetik ^1. düzenlenir. Memeli sistemlerde önceki çalışmalarda sinir dejenerasyonu ve ^{rejenerasyon, 1, 2, 6, 8} sırasında Schwann hücrelerinin rolleri tanımlamışlardır. Sabit doku ya da hücre kültürü bu çalışmalarda, Schwann hücreleri sadece enkaz temizleme yardımcı olmak için yaralanma siteye makrofajlar işe değil, aynı zamanda miyelin fagositoz kendilerini destekli. Bu çalışmaların son derece bilgilendirici olmuştur, biz gerçek zamanlı olarak in vivo periferik akson hasarına görsel glial tepkiler daha önce hiç var ve başka çalışmalar bu olaylar sırasında çevre glia farklı sınıflar arasındaki ilişkiyi araştırdık.

Son zamanlarda, çeşitli laboratuarları biz burada açıklamak ne benzer Zebra balığı ve lazer aracılı akson hasarı kullanarak Wallerian dejenerasyon araştırdık ^{4, 5, 7, 9. Bu çalışmaların bazılarında, yüzeysel duyu sinir özel bir yerleşik, iki foton konfokal mikroskop 4, 5, 9 ile genç larvaları axotomized edildi. Başka bir çalışmada, hangi bizimkine çok benzer, ventral motor sinir içinde derin akson bir ticari lazer ablasyon sistemi 7 ile 5 günlük larvaları transeksiyon edildi. Bu deneysel set-up her ikisinde de, odak Wallerian dejenerasyon ve hem de akson ve bağışıklık hücreleri görüntülenmiştir vardı. Bu çalışmalar genişletmek için, daha olgun, miyelinli sinir ve tahlil dejenerasyon ve rejenerasyon sırasında tüm sinir ile ilişkili çevresel glia tepki ile eski larva motor aksonlar yaralanmasına açıklar.}

Bunu yapmak için, biz de yaralı akson birlikte bu nüfus arasındaki etkileşimleri araştırmak üzere 6 motor sinirler ve 7 gün sonra döllenme (DPF) larva transect ve bireysel glial nüfus yanıtları görselleştirmek. Çift ve üçlü tra kullanarakbu Schwann hücrelerinin ve perineurial glia yanı sıra, aksonlar için bir gösterge de dahil olmak üzere çevresel etiket glia nsgenic hatları, böylece oluşan bir ticari olarak temin edilebilen lazer ablasyon sistemi kullanmak bir azot pompalanmış dönen bir disk konfokal sisteme bağlı boya lazeri (dalga boyu 435 nm) akson kesilerde oluşturmak için. Bu deneysel kurulum bize birbirine akson yaralanma ve ilişkileri özgü periferik motor akson yolları ve zaman atlamalı görüntü farklı glial nüfus yanıtları zarar, canlı, larva Zebra balığı görüntülemenizi sağlar. Bu protokol daha farklı bilimsel soruları için farklı transgenik çizgiler veya genetik mutantlar ile, farklı yaşlardaki Zebra balığı sinir yaralanmaları oluşturmak için adapte edilebilir.

Protokol

1. Ablasyon ve Canlı Görüntüleme Hazırlık ve Zebra balığı Embriyolar montajı

1. Yumurta suda% 0.8 düşük erime agaroz bir stok hazırlayın. Gerekli ° C kadar 4 de 13X 100 mm tek kültür tüpleri ve mağaza içine kısım.
2. Floresan motor nöronlar ve ilgi glial hücre tipleri etiketlemek için istikrarlı bir şekilde entegre transgenlerin içeren çapraz yetişkin zebrafish. Doğru evreleme için ° C inkübatör sonra ³ 28.5 yumurta su ve yerde Zebra balığı embriyolarının toplayın.
3. Yaklaşık 24 saat sonra döllenme (hpf) de, yumurta su çıkarmak ve yumurta suda 1-fenil 2-tiyoüre (PTU) 0.002% ekleyin. Inkübatör embriyolar dönün.
4. 24 ve 96 hpf arasında, embriyo bir floresan diseksiyon kapsamı istenilen transgenlerin varlığı için taranmalıdır. Tatlı PTU yumurta su seçilen embriyolar yerleştirin ve inkübatör dönmek.
5. Larva 6 gün sonra döllenme (DPF) (veya istenilen yaş) ulaştığınızda, inkübatör kaldırmak, Montaj için birkaç larva seçin ve daha küçük çanak aktarabilirsiniz.
6. Çanak su çıkarmak ve hemen PTU yumurta su yaklaşık 0.02% Tricane ile değiştirin. Larva yaklaşık 5 dakika anestezi oturmak için izin verin.
7. 30 sn için musluk suyu ve mikrodalga ile bir beher% 0.8 düşük erime agaroz bir kısım yerleştirin veya agaroz eriyene kadar. Kültür tüp agaroz dokunmatik (sıcak değil) için ılık hissediyor kadar beher soğumasını bekleyin.
8. Bir anestezi larva seçin ve tek veya çok iyi 35 mm cam alt çanak aktarın. Larva ile transfer edildi herhangi bir su çıkarın, sonra hemen yemeğin altı cam bölümü doldurmak için yeterince sıcak agaroz ile larva kapağı ama büyük bir kubbe oluşturmaz.
9. Agaroz sertleşir gibi, çanak altındaki yan larva konumlandırmak için bir diseksiyon iğne kullanın, sonra sırtında sadece biraz larva yatırın. Bu, yaralanma ve sonraki görüntüleme için bir şart olduğumonte larva çanak altındaki cam dokunmadan. Agaroz katılaşmış ve larva hareketsiz kadar bu pozisyonda larva korumak için diseksiyon iğne kullanın.
10. Agaroz tamamen sertleştikten sonra, yavaş yavaş tamamen agaroz ve larva kapsayacak şekilde çanak yeterli miktarda Tricane su (bu anestezi için kullanılan aynı Tricane olabilir) pipetle.

2. Lazer Kalibrasyon ve Test

1. Tüm konfokal mikroskop enstrümantasyon, heyecan verici Zebra balığı transgenlerin için uygun diyot lazerler, ve azot pompalı boya lazer açın. "Boş" ışın ayırıcı yerinde olduğundan emin olun, lazer zayıflatıcı tamamen açık olan ve 435 nm Kumarin boya hücre sırada yer alıyor. Bilgisayarda, görüntüleme yazılımını açın.
2. Yerine bir 63x 1.2NA suya daldırma hedefi hareket ve amaç üzerine su hedefleri için daldırma orta küçük bir damla uygulayın. Bir 63x objektif iyi lazer ablasyon doğruluğu ve su sağlayacak immersion 6-7 dpf'e Zebra balığı larvaları ile çalışırken gereklidir daha büyük bir çalışma mesafesi, sağlar.
3. Lazer kalibrasyon için kullanılacak bir aynalı tarafı ile bir cam slayt edinin. Mikroskop sahneye, slayt, ayna tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
4. Aydınlık aydınlatma altında mercek kullanarak, bulmak ve aynada bir çizik ya da aşındırma odaklanın. Aydınlık ışık cam slayt üzerine aşağı parlayan olacak, ancak sadece ayna çizik ya da uzakta kazınmış olan yerlerde hedefi geçecek, mercek ile siyah bakmak için ayna neden ve gravürler noktalar gibi ya da ışık çizgileri.
5. Görüntüleme yazılımı kullanarak bilgisayar ekranında gravür bilgileri ve odaklanır. Lazer kalibrasyon ve güç ayarlarını kontrol penceresini açın. "1" darbe sayısı ve "3"% iletim için zayıflatma plakası olarak ayarlayın. Darbe sayısı lazer ilgi her bölge (RO içinde yangın sayısını temsilI) ve% iletim lazer gücünü temsil eder. Doğru kalibrasyon ayarı 63x 1.2NA suya daldırma hedefi için seçili olduğundan emin olun.
6. Ana araç çubuğundan elips aracını seçin ve tek bir dairesel ROI oluşturmak için bilgisayar ekranında resmi tıklatın. Resmin üzerine rastgele aralıklı 4 dairesel ROI kalmayıncaya kadar bu 3 kez yapın.
7. Bazı sistemler Okülerin için ışık yolu açıksa lazer ateş izin vermez bir güvenlik özelliği içerebilir. Bu durumda, el ile şu anda Okülerin için ışık yolunu kapatmak.
8. Lazer ateş. Bu, her dairesel ROI içinde 4 küçük nokta gravür, 1 yaratacaktır. Lazer ateş yoksa, lazer açık ve doğru bağlandığından ve Okülerin için ışık yolu kapalı olduğundan emin olmak için kontrol edin. Lazer yangınlar ancak gravür görülürse, "boş" ışın ayırıcı yerinde olduğundan emin olmak için kontrol edin. Her şey yerinde ise, gravür ar kadar lazer gücü ve "sıkı bağlamak" artışgörebilir örn. 10'dan büyük ayarı bir lazer güç aşındırma cam için gerekli ise, bu lazer plazma kartuşunun değiştirilmesi gerekiyor gösterebilir.
9. Kazınmış noktalar seçilen ROI içinde merkezli görünüyorsa, hiçbir kalibrasyon (2.12 devam) gereklidir. Noktalar merkezli değilseniz, kalibrasyon ayarı güncelleştirilmesi gerekiyor.
10. Kalibre etmek için, güncelleştirme kalibrasyon ayarı tıklatın. Lazer ateş ve bir görüntü tek kazınmış noktası içeren görünür. Noktası görünmüyorsa, kalibrasyon iptal lazer gücünü artırmak ve tekrar kalibrasyonu başlatın.
11. Nokta ortasına tıklayın. Lazer yine ateş edecek, ve başka bir nokta belirir. Bu noktada tıklatın ve kalibrasyon tamamlandığında ve 9 noktalar bir tablo şekilde görünür kadar bu işlemi tekrarlayın. Kalibrasyon başarılı olduğunu kontrol etmek için adımları 2.6-2.9 tekrarlayın.
12. Mikroskop aşamasından cam slayt çıkarın ve objektif temizleyin. Ocu için ışık yolu açınlars ve "% 100 ILL" ışın ayırıcı ile "boş" ışın ayırıcı değiştirin.

3. Lazer Ablasyon ve glial hücre Davranışların Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Sinir transeksiyonu

1. Cam slayt tutun ve 35 mm cam dipli yemekleri tutmak için uygun bir sahne ile değiştirmek için kullanılan sahne çıkarın. 63x 1.2NA suya daldırma hedefi kullanmaya devam edin.
2. Hedefi suya daldırma orta küçük bir damla uygulayın ve sahne üzerine monte larva ile çanak yerleştirin. Klipler ile çanak stabilize.
3. Mercek ve geniş açılı aydınlatma kullanarak, larva odak ve motor sinirleri bulun. Hemisegments 10-20 sinirler tarama ve kesisi için bir motor sinir seçin.
4. Görüntüleme yazılımı kullanarak bilgisayar ekranında sinir bir canlı görünümü getirin. Z-uçakları seçin ve akson ve zarar görmemiş sinir glial hücreler bir görüntü kazanır.
5. Yakalamak için görüntüleme yazılımı zaman atlamalı görüntüleme ayarları hazırlayınDeneye bağlı olarak 5-30 dakika aralıklarla tüm hücre türlerinin Z-projeksiyonları. Bu ablasyon yapmadan önce geçen zaman için gerekli tüm ayarlarını oluşturmak için iyi, bu nedenle yaralanma tamamlandıktan sonra geçen zaman başlangıç ​​herhangi bir gecikme yoktur.
6. "% 100 ILL" ışın ayırıcı çıkarın ve "boş" ile değiştirin. Okülerin için ışık yolu kapatın.
7. Sinirin canlı görünümüne dönmek. Transeksiyon olacak akson görmek için uygun floresan kanal kullanın.
8. Elips aracını kullanarak, ablasyon için bölgede ince bir eliptik ROI oluşturmak, daha sonra seçilen bölge içinde küçük ROI oluşturun.
9. Lazer ayarları kontrol penceresinde, "2" için darbe sayısını ayarlamak ve zayıflama plaka "18"% iletim. Seçilen ROI içindeki lazer ateş. ROI içinde floresan kalıntıları, lazer gücünü artırmak ise, yaklaşık 10 saniye bekleyin ve tekrar lazer ateş. Eğer flüoresan neden olan bir ayara ulaşana kadar bunu yapınce ROI içinde kaybolur için.
10. 10 veya daha fazla saniye bekleyin ve floresan için tekrar ablasyon alanını kontrol edin. Aslında photobleached olduğunda bir yatırım getirisi başlangıçta, ablasyon görünebilir dikkat edin. Floresan dönerse, lazer gücünü artırmak ve tekrar lazer ateş. Çiçek açma ROI içinde kaybolur ve 10 saniye içinde geri dönmez kadar bu işlemi tekrarlayın. Bu daha az lazer gücü ile başlar ve gerekli gücü artırmak için en iyisidir. Gerekli lazer gücü bireysel mikroskopi sistemleri, Kumarin boya yaş, örnek montaj, larva yaşı ve doku kalınlığına göre değişebilir. Ideal bir lazer gücü bir kez kurulduktan sonra, bu güç ayarı aynı deneyi daha sonra sinirler üzerinde yeniden kullanılabilmektedir.
11. Ablasyon tamamlandığında, zaman atlamalı görüntüleme başlar.
12. Geçen zaman tamamlandığında, verileri derlemek ve Z-projeksiyonları her noktası için renk kompozit oluşturmak için görüntüleme yazılımı kullanın. Davranışını analiz etmek için bir QuickTime film oluşturuneş zamanlı olarak akson ve glial hücreler.

Sonuçlar

Burada tarif edilen tahlil, in vivo olarak aksonal yaralanma gliyal hücreleri ve diğer sinir-ilişkili hücre popülasyonlarının tepkisini tayin etmek için kullanılabilir. Film 1 bu yöntem ve glial hücreleri çevreleyen yanıtı kullanılarak oluşturulan bir sinir hasarının bir örneği gösterilmektedir. Bu deney (nkx2.2a: megfp) Tg uygulandı; Tg (olig2: DsRed) Zebra balığı, perineurial glia EGFP ve motor nöronlar ifade sitozolik DsRed hedefleyen bir zar ifade edildiği. Yaralanma 6 dpf'e ca...

Tartışma

Bu deneysel tasarım en kritik adımlar şunlardır: 1) in vivo görüntüleme ve 2 yaralanma ve sonraki için uygun montaj larva) temiz bir sinir kesisi oluşturmak için lazer kalibrasyon ve doğru güç ayarlarını seçerek bu minimal ekstra doku hasarı ile sonuçlanır . In vivo görüntüleme ve sonraki analiz için başarılı axotomy sağlamak için, tek tek cam alt yemekleri ya ya da bölücüler ile bir cam alt tabak birden fazla larva monte. Lazer kalibrasyon sonra, sinir kesisi için en uygun parametrel...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Feniltiüre	Sigma	P7629-100G
Finquel Trikain Metansülfonat MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
Düşük erime noktalı agaroz	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview Hücre Kültürü Kapları, Cam Altlı, Steril, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
Tek kuyulu cam tabanlı Petri kapları 35 x 10 mm, 12 mm kalınlığında	Willco Wells	GWSt-3512
Tüm bileşenlerle Andor Technology MicroPoint Lazer Sistemi	- Quorum Technologies, Inc. aracılığıyla satın alındı.	2203-SYS
MicroPoint Lazer Courmarin boya (435 nm)	Andor Teknolojisi	MP-27-435-DYE