Üretim ve Farelerde arteriyel Lezyonlarının 3-Boyutlu kantitasyonu Optik Projeksiyon Tomografi ile

Özet

Kardiyovasküler hastalığın hayvan modellerinden arteriyel lezyonların ex vivo analizi klasik olarak histolojik ve immünohistokimyasal tekniklere dayanır. Bunlar 3 boyutlu lezyonlarda 2 boyutlu ölçümler sağlar. Bu el yazması, optik projeksiyon tomografisi kullanılarak 3 boyutlu kantitatif analiz için arteriyel lezyonların oluşumunu açıklamaktadır.

Özet

uygun hayvan modellerinde üretim ve vasküler lezyonların analizi lezyon oluşumu patogenezi ve yeni tedavilerin eylem hakkında önemli bilgiler üreten, kardiyovasküler hastalık araştırmalarına bir köşe taşıdır. Ateroskleroz eğilimli farelerde lezyon indüksiyon cerrahi yöntemler ve diyet modifikasyonu kullanımı dramatik hastalık gelişimi ve yeni tedavilerin potansiyeline katkıda bulunan mekanizmaların anlaşılmasını geliştirdi.

Klasik, lezyonların analizi 2 boyutlu histolojik teknikler kullanılarak ex vivo yapılır. Bu makalede, arteryel lezyonların 3 boyutlu kantitatif optik yansıtma tomografi (OPT) uygulanmasını tarif etmektedir. Bu teknik, tahribatsız olarak, standart histolojik ve immünohistokimyasal analizler bir yardımcı olarak kullanılabilir.

Neointimal lezyonlar fare femur sanat tel yerleştirilmesi veya ligasyonu ile uyarılan edildiAterosklerotik lezyonların iken ery apo-eksikliği olan farelerde bir aterojenik diyet uygulaması ile elde edildi.

Lezyonlar tamamlayıcı histolojik ve immünohistokimyasal analizi ile takip autofluorescent emisyonunun OPT görüntüleme kullanılarak incelenmiştir. Altta yatan vasküler duvar açıkça ayırt lezyonlar OPT. Lezyon boyutu lezyon hacmi ve maksimum enine kesit alanına hesaplanmasına imkan veren, planimetrisi kullanılarak 2-boyutlu bölümler içinde hesaplanmıştır. OPT kullanılarak oluşturulan veriler tekniğin doğruluğunu ve analiz geleneksel yöntemlerle (yerine alternatif daha) bir tamamlayıcısı olarak potansiyel teyit histoloji kullanılarak elde edilen ölçümler ile uyumlu idi.

Bu çalışma aterosklerotik lezyonların ve neointimal görüntülenmesinde OPT potansiyelini gösteriyor. Bu vasküler yeniden rutin 3 boyutlu ölçümü için hızlı, çok gerekli ex vivo tekniği sağlar.

Giriş

arteriyel lezyonların oluşumu kardiyovasküler hastalık ¹ ile ilişkili yüksek morbidite ve mortalite merkezindedir. Lezyon oluşumu yaralanması ² arteriyel dizginsiz bir inflamatuvar yanıt kaynaklandığı düşünülmektedir. Restenotik lezyonlar hızla (stent implantasyonu sonrası, örneğin), akut mekanik hasar takip geliştirmek oysa Aterosklerotik lezyonlar arter duvarına kronik zedelenme yanıt yavaş yavaş oluşturur. Arteriyel lezyonu gelişimine katkıda mekanizmaları genellikle ilgili genetik manipülasyonlar ¹ ile kombinasyon halinde, uygun bir hayvan modelinde kullanılması ile önemli ölçüde açıklığa kavuşturulmuştur.

Bu, in vivo ve ex vivo saptanması ve küçük hayvanların lezyon analizi için geliştirilmiş yöntemlere gelişimi ile değişmektedir, ancak lezyon boyutu ve bileşimi analizi, klasik (ex vivo 2 boyutlu dokusu üzerine yoğun bir şekilde bağlı olan ^{3). Arteriyel lezyonların Histolojik analiz emek yoğun, zaman alıcıdır ve 3-boyutlu yapının sınırlı bilgi içerir. Örneğin, lezyon yükü genellikle bir lezyonun enine kesit alanı ölçülerek değerlendirilir (ya rastgele seçilen alanlarda veya maksimum tıkanma yerinde). Bu genel lezyon yükünün eksik analizini sağlar. 3 boyutlu görüntüleme teknolojisi bu soruna olası bir çözüm sağlar ama şaşırtıcı birkaç uygun yaklaşım tarif edilmiştir tüm montaj. Bu manyetik rezonans görüntüleme (MRG) 4 ve X-ray bilgisayarlı tomografi (BT) 5 için tek foton konfokal mikroskopi için çok büyük ama çok küçük fare arterlerin boyutu ağırlıklı olarak bağlı olabilir. Farelerde aterosklerotik lezyonların çalışma ex vivo MR uygulanması ve mikro CT hatta nispeten büyük damarlarda sınırlı çözünürlük sunan göstermektedir. Bu eklendi, nispeten uzun kazanım süreleri gerekliverimi sınırlayan (ve tarama maliyetlerini artırmak) 4,6.}

(Örneğin optik koherens tomografi ^3,7 ve fotoğraf-akustik tomografi ⁸ gibi) yeni optik görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesi fare arterlerde lezyonların görüntüleme geliştirmek için çok potansiyel sunmaktadır. Benzer bir potansiyel fare embriyoları analizini sağlamak için geliştirilen optik projeksiyon tomografi (OPT) ile gösterilir. OPT çapı ⁹ ~ 0,3-10 mm arasında değişen görüntü örneklerinde için tasarlanmıştır. İletim görüntüleme polikromatik görünür ışığa yarı saydam örnek opaklığını kaydeder ve anatomik yapıların tanımlanması için de kullanılabilir. Endojen belirli dalga boyunda (örneğin, kolajen, elastin) ve örnek eksojen fluorophores uyarma sonrasında ışık yayılmasının görüntülenmesi kayıt emisyonu. Farklı doku bileşenleri türü ve otofloresan türlerinin yoğunluk farklı olabilir, çünkü bu, aynı zamanda (anatomik bilgi sağlayabilirMevcut). Buna ek olarak, immüno veya gen ifadesi dağılımı, uygun floresan probları ¹⁰ kullanımı ile tespit edilebilir. Her iki görüntüleme modu (iletim veya emisyon), ışık örnek dönerken (0.9 ° 'lik artışlarla genellikle 400 görüntü) olarak iteratif görüntü yakalama izin vermek için bir şarj çiftli cihaza odaklanmıştır. Bunlar (örneğin koni algoritması kullanarak filtre arka projeksiyon () veya yinelemeli rekonstrüksiyonu gibi) standart tomografik rekonstrüksiyon yöntemleri ile hacminin hesaplanması için kullanılabilir.

Daha önce Kirkby ve ark., ^11'de tarif edildiği gibi bu, video, aterosklerotik ve neointimal lezyon, hızlı bir şekilde ölçülebilir ve uygun maliyetli 3 boyutlu analiz için tercih bizim yeni bir uygulamasını göstermektedir. tekniği üç yaygın olarak kullanılan model lezyon büyüklüğü ölçülmesi için uygun olduğu gösterilmiştir: (i) femoral arter tel yaralanması; Apolipoprotei (ii) femoral arter bağlanması, ve (iii) diyetin neden olduğu aterosklerozunn E eksikliği (apo ^{- / -)} fareler.

Protokol

Fare Femoral Arter içinde neointimal Lezyonlarının 1. Cerrahi İndüksiyon

1. Hayvanları kullanarak deneyler ulusal ve kurumsal etik şartlarına uygun olarak yapılmalıdır. Tüm cerrahi uygun aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır. Neointimal lezyonların indüksiyonu Roque ve ark., ¹² ve SATA ve ark., ¹³ tarafından tarif edilen tekniğin bir modifikasyonu kullanılarak elde edilir.
2. Erkek C57BL6 / J fareler tartılır (Yaş 10-12 hafta, ağırlık 25-30 g) indüksiyon odasında% 4-5 izofluran sunarak uyuşturan. Anestezinin sonra, 37 ° C 'de vücut ısısını korumak için ısıtılmış mata fare aktarın. Maske ile izofluran (% 2-3) 'in uygulanmasını devam edin.
3. Anestezi uygun bir düzeyde (ayak tutam tepki olmaması) neden sonra, buprenorfin uygulanması ile analjezik örtü sağlamak (0.1 mg / ^kg-1). Sonra sırtüstü pozisyon An fare koyunsol hindlimb ventral yüzeyi tıraş d.
4. Popliteal arter ve karın duvarı ile çatallanma arasında, femoral sinir femoral arter ve ven izole etmek künt diseksiyon kullanın, üst hindlimb kasları ortaya çıkarmak için bir kesi yapmak ve. / V lignokain% 1 w kullanarak gerektiği gibi yarayı yıkayın.
5. (Popliteal arter hemen dalı altında) (karın duvarına yakın) ve distal proksimal femoral arter ve kan akışını kontrol etmek için ven etrafında geçici birleşik harfleri (6/0 Mersilk) yerleştirin. Sonra (femoral arter ile şubeye uzak yaklaşık 2-5 mm) popliteal arteri izole ve distale Arter. Popliteal arter altında ikinci bir çözdü bitişik harfleri yerleştirin.
6. Proksimal geçici ligature basınç uygulayarak kanamayı önleyen femoral arter dal hemen distalinde popliteal arterde küçük bir kesi (Arteriyotomi), emin olun. Düz Advance, 0.014 "kılavuz teli çoğaldığınıKarın duvarı yönünde femoral arter boyunca 1-1.5 cm ve 30 saniye (Şekil 1A) yerinde bırakın.
7. Kılavuz teli çıkarın ve bu amaçla yerleştirilen bitişik harfleri kullanarak ve femoral arter tıkamak için özen, arteriotomi üzerinde popliteal arteri Arter.
   NOT: ligasyon kaynaklı yaralanma için. Intraluminal yaralanma olmadan neointimal biçimlenme femoral veya popliteal arter (Şekil 1B ve 1C) bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. Bu takip 1,1-1,5 adımları elde etmek için. Ancak, arteriyotomi yapmazlar ama ya (i) (adım 1.6 kaçınarak) popliteal arter ile şube noktada femoral arter veya (ii) Arter femoral arterin hemen distalinde popliteal arteri Arter. Sonra adım 1.8 ile devam edin.
8. Geçici bitişik harfler çıkarın süreksiz dış sütür (5/0 Mersilk) ile yarayı kapatmak ve EMLA krem ​​(% 2.5 lidokain,% 2.5 prilokain) uygulanır. Hayvanlar yeniden izin ver bilinç (genellikle 5-10 dk) kazanmak ve onların kafes etrafında serbestçe hareket ediyor emin olun (hafif topallık etkilenen bacakta belirgin olabilir ama bu ameliyattan sonra ilk 2-3 gün içinde çözmelidir) oda tutan dönmeden önce. Fareler ameliyat sonrası tek başına ev sahipliği zorunda değilsiniz.
9. Hayvanlar kadar 3 ay boyunca kurtarmak için izin verin. Küçük lezyonlar 7 gün tel yaralanma sonrası ~ görünmeye başlayacak ve 21-28 gün sonra ~ istikrarlı bir maksimum boyutu ulaşacaktır.

Apolipoprotein E Aterosklerotik Lezyonlarının 2. İndüksiyon ^{- / -} Fareler

1. 12 hafta boyunca erkek, 6 hafta (evde yetiştirilen) eski ApoE boş fareler için, batı diyet (Araştırma Diyetler, ABD% 0.2 kolesterol) uygulayınız.
2. Aterosklerotik lezyonlar genellikle aort kavsi ve onun büyük dalları (Şekil 2) brüt inceleme üzerine görebilir.

3. Analiz Arter Lezyonları kullanarak Optik Projeksiyon Tomografi (OPT)

nt "> NOT: fare femoral arter ve aortik ark örneklerinde lezyonların OPT görüntüleri optik projeksiyon tomografleri kullanılarak elde edilmiştir.

1. % 10 nötr tamponlu formalin, ardından heparinize (10 U / ml) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile terminal anestezi (80 mg / kg sodyum pentobarbital) kapsamında transkardiyak perfüzyon tespit ve kanları tümüyle alınarak fareler öldürülür.
2. Uygun şekilde femoral arter veya aort arkı ve ana dalları (sol karotid arter, sol subklavyen arter, brakiyosefalik gövde), yalıtmak ve yabancı peri-adventisyal malzeme çıkarmak. Gerekli olana kadar% 70 etanol içinde depolamadan önce% 10 tamponlu formalin ile O / N sonrası düzeltme.
3. % 1.5 düşük erime noktalı agaroz gömme arterler, Whatman 113 V kağıt ile ön-filtre edildi. Manyetik OPT her örnek takın mount o doğrultusunda damar ekseni ile siyanoakrilat yapıştırıcı ile monte edilir. Konik şekle aşırı agaroz Trim. En az 12 saat süre ile% 100 metanol içinde kurutmak.
4. Cbenzil alkol ve benzil benzoat karışımı içinde (12-24 saat) daldırılarak emizle kaplar (1: 2 h / h).
5. Kalibre tomografi temizlenir örnekleri yerleştirin. 1024 x 1,024 çözünürlüğü ayarlayın ve ilgi tüm alanı görülebilir sağlayan bir optik büyütme belirler. OPT hacim Z ekseni aynı çözünürlüğe yeniden bir izotropik (yani, 1.024 x 1,024 x 1,024), voksel boyutu ~ 200 mikron. Imar eserler olması muhtemel olduğu gibi bu kararın aşırı tahminini temsil edebilir. O parlak alan, iletim kanalı içinde görüş alanının merkezinde kendi ekseni üzerine döner, böylece örnek konumunu ayarlayın.
6. GFP1 filtre emisyon kanalı (uyarma filtresi 425 nm bant geçiren nm 40 ile; emisyon filtresi: 475 nm uzun geçiş) ise, numune odak ve elde edilen görüntünün dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için pozlama süresini ayarlamak (aşırı doygunluk kaçının). 0.9 ° dönme adım, sadece GFP1 emisyon kanalında gemi tarayın.
7. Bitiminde DataViewer yazılımı kullanarak veri toplama kalitesini teyit etmektedir. Tarayıcıdan numune çıkarın.
8. Işlem, normal olarak mum, parafin önce, sonraki histolojik analiz,> 24 saat boyunca% 100 metanol içinde yer örneği sağlamak için.

4. Görüntü İmar ve Analizi

Filtre edilmiş geri yansıtma ile Tomografi yeniden yapılandırılması NRecon yazılım veya benzeri kullanılarak gerçekleştirilir. Rekonstrüksiyonları gruplar halinde, sahipsiz yapılabilir.

1. Kaymaları dengeleyebilir ve görüntü yoğunluk seviyelerini ayarlayarak görüntü kalitesini artırmak.
2. DataViewer yazılımını kullanarak görüntü rekonstrüksiyon kalitesini kontrol edin.
3. Analiz için numune uygun bölümü belirlenmesi. Lümen boyutları kaydedildi isteniyorsa gemiler arasında tutarlı Bu uzunluk tutun.
4. El her 50 yeniden inşa kesitler içinde 1 uygun sınır izleme tarafından lezyonların taslağını tanımlayın.
5. Bilgisayar tarafından oluşturulan interpolations doğru olduğundan emin olmak için her Interleaved kesite edin. Gerektiğinde el ile sınır ayarlayın.
6. Yalnızca lezyon seçilir, böylece gri-seviyeli eşiğini ayarlayın ve ölçüm veri ihracat.
7. Her tarama için, lezyon içeren bir ilgi dikey bölgesini tanımlamak ve medya ve neointimaya arasındaki sınırı iz (yani., Internal elastik lamina pozisyonu) her 50 ^inci tarama hattı için. Yazılımda interleaved tarama hatları için intima / media sınırları katmak ve doğrulamak ve gerektiğinde uygun düzeltin. Daha fazla kademeli bu beyaz piksel neointima temsil siyah piksel lümen temsil ettiği bir ikili görüntü setini üretmek için elle tanımlanmış yoğunluğu eşiğine üç boyutlu hacmi tanımlanır.
8. Alınan ölçümler şunlardır: toplam lezyon hacmi (nesne hacmi), lümen hacmini (toplam hacim - nesne hacmi) ve lezyonun ve çapraz mezhep lümen dağılımıçalışılan kabın eksenel uzunluğu boyunca uğratarak alanı.

Sonuçlar

Sağlıklı (lezyonsuz) fare femoral arterlerin ön tarama (n = 5) iletim görüntüleme yararlı görüntüleri vermedi gösterdi. Yayılan sinyalin hiçbir absorbans / saçılma olduğu gibi bu iletim imaging.However için çok şeffaf (yerine çok opak) olma temizlendi arterlerin bir sonucuydu, bu emisyon görüntüleme için faydalıdır. Bunun aksine, femoral arter ⁽¹⁴ elastin için 410 nm eksitasyon zirve ile tutarlıdır) 405-445 nm'de uyarma sonrasında büyük sinyal ile emisyon kanalına güçlü autofluoresce. Bu görüntülerden yeniden 2 boyutlu dilim açıkça lümenin ve adventisyanın ve lümen medya ayırt.

Murin femoral arter 28 gün telsiz sonra (n = 6) ya da ligasyonu (n = 5) neden olduğu hasarı neointimal koyulaştırıcı olmayan tomografik salım çıkıntılar belirgindi (Şekil 3A) hasat edildi. Yeniden 2-DIMENS olarakional dilimleri, eş neointimal lezyonlar zayıf emisyon (Şekil 3B ve Şekil S1) tarafından medya ayırt edilebilir.

Aterosklerotik farelerin OPT emisyon arkus tüm montaj örnekleri görüntüleri ve ana dalları (n = 8) ön görülen anatomik dağılım ile özdeşleşmiş lezyonlar (örn., Aort kavsi, brakiyosefalik arter ve kökenleri daha az eğrilik sol karotis ve sol subklavian arterlerin (Şekil 4A). kesit görüntüleri bu (Şekil 4B, S2 ve S3 Rakamlar), tipik olarak eksantrik lezyonlar ve kolayca medya ve lümen ayırt olduğunu göstermiştir.

OPT aşağıdaki histolojik analiz için İşleme arterler başarıyla histolojik (Amerika Birleşik Devletleri Trichrome, Picr kullanılarak boyanan kesitler ile OPT tahribatsız doğa doğruladıosirius kırmızı) ve immünohistokimyasal (α-SMA, Mac-2) teknikleri (Şekil 3C ve 4C).

OPT ile lezyon boyutu ölçümü aynı arter ¹¹ alınan histolojik kesitlerin görüntü analizi kullanılarak elde edilen ölçümler ile uyumlu olduğu gösterilmiştir.

Telsiz (R ² = 0.92) ve ligasyon kaynaklı (R ² = 0.89) neointimal lezyonlar ve aterosklerotik plakların (R = 0.85 ²⁾ için OPT ve lineer regresyon ile yakından ilişkili histoloji ile elde edilen lezyon alanının planimetrik ölçümleri. OPT önemli bir faydası 3 boyutlu analizini sağlamak için yeteneğidir. Bu teknikle lezyonların hacimsel ölçümü geliştirerek, telsiz lezyon hacimleri kaydetmek başardık (0,1100 ± 0,0091 ^{mm, 3,} n = 6) ve ligasyon-yaralı femoral arter (0,0200 ± 0.0089 mm ^3, n = 5) ve aynı zamanda aterosklerotik brakiyosefalik arterlerde (0.180 ± 0.018 mm ^3; n = 8). Ölçümler son derece tekrarlanabilir (sırasıyla varyasyon% 5,4 katsayıları,% 11.4 ve% 4.8, n = 4) olan lezyonun her türlü. Tel hasarlı damarların neointimal lezyon önceki açtığı hasar daha yüksek derecede uyumlu ligasyon ile üretilen, daha büyük (p <0.0001) vardı.

oluşturulan veriler de (Şekiller bkz S1 - S3) lezyon profillerinin (Şekil 5) olarak ifade edilir ve dinamik, nitel değerlendirme için render olabilir. Bu yaklaşım açıkça farklı yaralanma prosedürlerine yanıt lezyon oluşumu kapsamını gösterdi ve yaralı damarlarda lezyon oluşumu düzensiz dağılımı vurguladı.

Şekil 1: fare femoral arter lezyon oluşumunu başlatmak için Yöntemler & #.160; popliteal arter bir arteriyotomi vasıtasıyla femoral artere kılavuz tel, bir anjiyoplasti (A) retrograd yerleştirme hasarı ve endotelyumun çıkarılması germek için yanıt olarak lezyon oluşumunu teşvik eder. Kan akışı, yaralı damar bölgesinden bölümü üzerine yeniden kurulur. Intraluminal streç, soyulma ya da kan akışına kesinti olmadan (B) neointimal proliferasyon femoral veya femoral arter bifurkasyonunun hemen distalinde popliteal arter ya bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. (C) daha şiddetli olmayan denuding yaralanma / çoğalması tepkisi femoral arter dal noktası üzerinde femoral ve popliteal arterler hem bağlanarak tarafından uyarılan edilebilir. Bu teknik aynı zamanda femoral arterin distal kısmına kan akışını engeller.

Şekil 2:. 12 hafta arkus ve ana dallarında lezyon birikimi karakteristik desen geliştirmek için fare arkus içinde aterom karakteristik çökelme eğilimli Ateroskleroz (Apolipopotein E yoksun fareler), yüksek kolesterol batı diyet ile beslenen. Gösterildiği gibi, lezyonlar aort arkı, brakiyosefalik arterde, bir mikroskop altında brüt muayene ile, görünür (oklar), ve sol karotis arter ve sol subklavyen arter deliklerinin içinde.

Şekil 3:. Sol femoral arter ligasyonu aşağıdaki Lezyon oluşumu (netlik artırmak için ters - karanlık bölgeler daha güçlü emisyon karşılık) (A) Sigara tomografik floresans emisyon görüntüleri intimal kalınlaşma tanımlanmasına izin (kırmızı arrowhereklamlar). (B) Farklı vasküler bölgeler ve lümen tomografik rekonstrüksiyonlarında ayırt edilebilir. (C) histolojik analizi (Amerika Birleşik Devletleri trichrome) OPT kullanılarak elde görüntüleri ile açık benzerlik vurguluyor. (AC) Ölçek çubukları 200 mm'dir. Kirkby ark. (AC) ¹¹ Ölçek çubukları uyarlanmıştır 200 mikron bulunmaktadır.

Şekil 4:. Aortik arkın (koyu bölgeler, böylece berraklığını geliştirmek, daha güçlü bir emisyon göstermektedir, böylece ters) ateroskleroz eğilimli farelerin aortik arkında ateromanın Görüntüleme (A) ateromlar (kırmızı ok başları), hali hazırda olmayan tomografi belirgindir siteleri (Şekil 2) ışık mikroskobu altında incelenmesi ile ateroma-yatak olarak öngördü. (B) dağılım Bu model tomografik cr teyit edilmiştiross-kesitler. (C) histolojik (Amerika Birleşik Devletleri trichrome) boyama lezyon analizi, geleneksel yaklaşımlara OPT tamamlayıcı doğasını birkaç farklı antikorları vurgulayan kullanarak yakın tomografik kesitler ile benzerlik ve immunohistokimyasal gösterir. (A-B) 'de Ölçek çubukları 1 mm; (C) 'deki ölçek çizgisi 250 mm. RSA, sağ subklavian arter; RCA, sağ karotid arter; LCA, sol karotid arter; LSA, subklavian arter sol; BCA, brakiyosefalik arter; AAo, asendan; Dao, inen aorta. Kirkby ark uyarlanmıştır. ¹¹

Şekil 5: lezyon ve lümen profillerinin analizi arteriyel yaralanma farklı yöntemler cevaben neointimal çoğalma ölçüde değişen belirtir Optik projeksiyon tomografi lezyonu izin verir ve lümen kesit ÖLÇME çapraz.ts femoral arter boyunca mesafeye karşı çizilecek. Bu açık bir şekilde, toplam bağlanma (C), ligasyon yerinde tam t üretir ancak lezyon arter boyunca kadar uzanmaz, oysa bir zarar görmemiş arter (A), kısmi ligasyonu (B) ile karşılaştırıldığında, küçük, nispeten ayrı lezyonlar, göstermektedir . Lumen kablo hasarı (D) hemen hemen tamamen numunenin uzak kısmını emen ve arter taranmış bölümünün bütün uzunluğu boyunca uzanan bir lezyon verir. Kirkby ark uyarlanmıştır. ¹¹

Şekil S1. Ligasyon yaralanmasını izleyen bir fare femoral arterden alınan kesit görüntüleri Hareketli rekonstrüksiyonu. Animasyonlu resim Bu tip hem kalitatif ve kantitatif analiz için yararlıdır. Animasyon arterin distal bölümlerine proksimal bir tıkayıcı neointimaya kademeli gelişimini hareket ettikçe, disklumen ve ortamdan ernible, hali hazırda belirgindir. Yan dallar kolaylıkla tespit edilebilir ve belirgin lümen tıkanıklığı ve boyutu lezyon arttıkça arterin dışa biçimlenme vardır. Ligasyon site ulaşıldığında geminin tam tıkanma meydana gelir. Kirkby ark uyarlanmıştır. ¹¹

.. (- Ilk göründüğünde sol) ve azalan (sağ) aort Şekil S2, bir ateroskleroz eğilimli fare aort arkın kesit görüntüleri Hareketli yeniden canlandırma yükselen kesitleri ile başlar. Küçük lezyonlar arkus yönünde tarama hamle olarak çıkan aorta görünür. Görüntüler daha sonra brakiyosefalik (solda), sol karotis (orta) ve sol subklavian (sağ) arterlerin ağır lezyonlu ostiumları göstermek için kemer dolaşmak. Tarama Bu dalların boyunca distal hamle olarak lezyonlar yavaş yavaş subc ilk azaltmak ve yoklavian arter, daha sonra karotid ve son olarak brakiyosefalik arter. İlginçtir ki, bu geminin gibi akış bölücü üzerine brakiyosefalik arter hamlede lezyon sağ karotis ve sağ subklavian arterlerin ayrılır. Kirkby ark uyarlanmıştır. ¹¹

Şekil S3. Animasyon, bir ateroskleroz eğilimli fare aort arkın hacim görüntü render. Optik projeksiyon tomografi bir apolipoprotein E eksik fare aortik arkında lezyon dağılımını gösteren bu durumda, 3 boyutlu görüntülerin nesil verir. (A) Aterom (sol karotis ve subklavian arterlerin çıkımının ve arkus daha az eğrilik, brakiyosefalik arter boyunca) beklenen siteler mevcuttur. Orijinal görüntünün üzerine bindirilmiş zaman kesitler taşıyan (B) Segmentasyon ve (kırmızı ile gösterilen) lezyon oluşturma plakların dağılımını vurguluyor.Kirkby ark uyarlanmıştır. ¹¹

Tartışma

3-boyutlu analiz değiştirilmesi veya hala arteriyel lezyon oluşumu soruşturmaların çoğunluğu temelini 2 boyutlu histolojik teknikler ekleyerek için büyük bir potansiyele sahiptir. İşte OPT (muhtemelen bu tekniği kullanarak başarılı bir şekilde analiz edilebilir en küçük gemiler temsil fare femoral arterler ile), küçük fare arterlerde gösterilir. Ayrıca, bununla birlikte, damar (ve lezyonlar), küçük ve orta büyüklükteki gemiler, insan da dahil olmak üzere diğer türlerden gelen ile kullanım için uygundur; Grubumuzun başarıyla tavşan aort lezyonları analiz tekniği kullandı (Bezuidenhout ark;. yayımlanmamış). OPT geleneksel histoloji ile karşılaştırıldığında daha hızlı analiz ve artan yapısal bilgiler vaat ve histolojik ve immünohistokimyasal hem tekniklerini kullanarak numunenin sonraki analizlere engellemediğini avantajına sahiptir.

OPT kullanılarak üretilen görüntüler lezyon oluşumu siteleri gösteren anatomik detay verdive bu alanda lezyon boyutu. Bu araştırmalarda kullanılan arterler nedenle (muhtemelen rotasyon hiza, eksik takas, yansıma / kırılma agaroz köşelerinde ve odaklama sorunlardan kaynaklanan) eserler belirli bir dereceye kadar bozulur tekniği ve görüntü kalitesi için çözünürlük sınırı muhtemelen yakın . Buna rağmen, gerekli bilgileri (örneğin, damar duvarının tabakalar) ayırt edilebilir kalır ve bu nedenle, teknik, tek tek tabakaların ölçümü için son derece yararlıdır. Gerçekten de, resim örneğinde seçilen alanlarda kabın plaka taşıyan bölümlerde lezyon ve luminal miktarlarının yanı sıra, lezyonun kesit alanları ve lümen sağlamak için hızlı ve yeniden üretilebilir bir miktarı olabilir. Büyük (aort) ve orta ölçekli (femur, karotid, subklavyen) sıçangil arterler - bu, genellikle farelerde aterosklerotik lezyon oluşumu ve neotintimal analizi için kullanılan - başarılı idiBu yöntemi kullanarak analiz edildi. Nitekim biz şimdi aterosklerotik lezyon ve neointimal boyutuna farmakolojik girişimler ve genetik manipülasyon etkisini göstermek için OPT kullandık. Vasküler endotel endotelin B reseptörü seçici silme ¹⁵ vermedi oysa Örneğin, endotelin reseptör blokajı neointimal lezyon oluşumu değişmiş. Ateroskleroz eğilimli farelerde, genetik enzimlerin silinmesi 11β-HSD1 ¹⁶ veya galektin 3 ¹⁷ aterosklerotik lezyonların boyutunu azaltmak için gösterildi.

Lezyon hacmi miktarının OPT bariz bir faydadır. Genellikle histolojik yöntemlerle elde edilen daha bir arter ⁴ toplam lezyon yükünün daha detaylı şekilde göstermektedir. Tüm lezyonu analiz eden bir geminin ayrık bölümleri analiz için seçilen zaman kaçınılmaz oluşacak seçim yanlılığı ve hatayı azaltır. Boyuna lezyon profillerinin üretimi OPT bir başka gücüYaralanma ^13,16 farklı (Şekil 5) tarafından uyarılan lezyonlar açısından vurgulanmıştır. Örneğin, tam ligasyonu ve tel yerleştirme hem femero-popliteal çatallanma yakın neredeyse tam tıkanıklık kaynaklı. Tel yaralanması, arter ligasyonu ile uyarılmış lezyonlar hızlı küçülmüş ve yok ise, taranan bölümünün bütün uzunluğu boyunca uzanan, ancak, üretilen lezyonlar. Bu model, anjiyoplasti, kılavuz telin yerleştirilmesi kaynaklanan yaralanma büyük ölçüde uyumludur. Histolojik kesitler kullanılarak benzer sonuçlar üreten pahalı, zaman alıcı ve emek yoğun.

OPT avantajları (biz rutin günde 20 gemileri taranmış var) ürettiği görüntülerin kalitesini ve göreceli hız ve basitlik bulunmaktadır. Görüntü kalitesi 3 boyutlu görüntüler oluşturmak için diğer yöntemlere üstün veya en azından kıyaslanabilir görünür ex vivo, y (örneğin MR ve BT mikro gibi)et OPT (çalışmalarımız / resim genelde 1-2sec oldu entegrasyon süresi) ve daha az pahalı kısa tarama süreleri gerektirmektedir. Örnek hazırlama birkaç gün boyunca uzanır, ancak çok az iş gücü, gemi gruplar halinde hazırlanabilir gerektirir ve verileri tek bir oturumda elde edilebilir. Sonuç olarak, çıktı yüksektir ve tarayıcı genişletilmiş kullanımını gerektirmez. Önemlisi, OPT tahribatsız doğası immünohistokimyasal inceleme için ilgi siteleri belirlemek için kullanılabileceği anlamına gelmektedir; Bu şekilde kesme miktarını azaltmak ve gerekli boyama. Bu yüksek çözünürlüklü ultrason gelişme arterlerde lezyonlar bu boyutta hacimsel ölçümü için alternatif bir yöntem sağlamak olasıdır, ancak yazarlar bu uygulamayı gösteren herhangi yayınların farkında değiller.

Belki şaşırtıcı, OPT görüntü kalitesi (tabii ki, yalnızca küçük örnekler üzerinde yapılabilir) mikroskobik tekniklerine geridedir. Önerilen iyileştirmeler reconstructio içinVerilerin n görüntü kalitesi ^19,20 gelecekteki gelişme izin vererek bu sınırlama hitap edebilir. Başka bir metodolojik endişe doku işleme örneğinin özelliklerini değiştirir olmasıdır. Örneğin temizleme ajanı lipofilik doğası, benzil alkol / benzil benzoat (BABB), tabii ki, dehidrasyon ve lipid temizleme adımları da bir özelliği vardır, her ne kadar önceden dehidrasyon (daralmasına neden olabilir iken, aterosklerotik lezyonlar lipid çıkarmak olasıdır parafin gömme için numune hazırlama). BABB (örneğin, gliserol ^21), morfoloji sadece küçük değişiklikler olur hidrofilik temizleme maddeleri ile karşılaştırıldığında, bu araştırmada kullanılmıştır.

Özellikle kilit hücrelerin 3 boyutlu düzenleme, izleme ve arteriyel yeniden rol oynayan faktörleri sinyalizasyon konusunda OPT daha da gelişmesi ve arıtma için çeşitli olasılıklar vardır. örneğin a, atardamar dokusu güçlü otofloresansı,Anatomik görüntülerin nesil n avantaj, ağartma ²² mevcut yöntemlerle söndürülür değildir ve RNA ve protein dağıtım modellerini değerlendirmek için floresan probların kullanımını kısıtlayabilir. İletim görüntüleme ile görüntülendi kolorimetrik probların kullanımı (örneğin β-galaktosidaz) bu sınırlamanın üstesinden gelebilir.

Sonuç olarak, OPT fare intimanın lezyonların 3 boyutlu görüntüleme için büyük bir potansiyele sahiptir. Genel olarak emek yoğun ve etkili bir şekilde, toplam lezyon hacmini temsil etmez 2 boyutlu yöntemler üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. OPT nispeten hızlı, rahat ve tahribatsız. Görüntü analizi yeni gelişmeler daha da tekniğin gücünü ve yarar artırmak için söz veriyorum.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ameliyat Mikroskobu	Zeiss, Almanya		OPMI Pico i
Anestezik Makinesi	Vet Tech, İngiltere
Fluovac	Harvard Aparatı İngiltere	340387
Fluosorber	Harvard Aparatı İngiltere	340415
Boncuk Sterilizatörü	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	1800-45
Isıtmalı Mat	İnce Sceince Tools, UK	21061-10
Balance	Mettler Toledo	MS1602S	PB1502 veya eşdeğeri
Sütürler	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, ABD	C-PMS-251	0.014"
Sütür İpek	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	18020-60	6/0 Mersilk
Cerrahi Aletler	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	14058-09	Toughcut İris makası
Cohan-Vannas Bahar Makası	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	15000-01
Dumont #5/45 Forseps	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	11251-35
Moria Iris Forseps	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	11370-31
Halsted-Sivrisinek Hemostat	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	13008-12
Bulldog klipsleri	Güzel Bilim Aletleri, İngiltere	18050-35
Biyotonik 3001 Tomografi ve nbsp;	Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount	Bioptonics, UK
Computer	Dell Inc, UK
Peristaltic pump	Gilson	F117606	Minipuls 3
DataViewer yazılımı	Skyscan, Belçika	v.1.4.4
NRecon yazılımı	Skyscan, Belçika	v.1.6.8
CTan yazılımı	Skyscan, Belçika	v.1.12
Isoflurane	Merial Hayvan Sağlığı Ltd, İngiltere	AP/İlaçlar/220/96	%100 Soluma buharı, sıvı
Tıbbi Oksijen	BOC Medikal, Birleşik Krallık	UN1072
Veterjezik	Alstoe Hayvan Sağlığı Ltd, İngiltere		0.3 mg / ml
% 1 Lignokain	Hamlen İlaç, İngiltere	LD1010	10 ml ampul
EMLA Krem	Astra Zeneca, İngiltere
Sodyum Pentobarbital	Ceva Hayvan Sağlığı Ltd, İngiltere
Batı Diyet	Araştırma Diyetleri, ABD	D12079B	%0.2 kolesterol
Fosfat Tamponlu Salin	Sigma UK	P4417
Heparin (Mukoza)	Leo Laboratuvarları, İngiltere	PL0043/003GR	250.000
Birim Nötr Tamponlu Formalin	Sigma, İngiltere	HT501128	%10
Etanol	VWR BDH Prolabo, İngiltere	20821.33	Mutlak AnalaR
Agarose	Invitrogen, Birleşik Krallık	16020050	Düşük erime noktalı
Filtre Kağıdı	GE Healthcare, Birleşik Krallık	113v	Whatman
Siyanoakrilat yapıştırıcı	Henkel, Birleşik Krallık	4304	Loctite
Benzyl alcohol	Sigma, UK	B6630
Benzyl benzoate	Sigma, İngiltere	402834
Metanol	VWR BDH Prolabo, İngiltere	20856.296	%100