Yöntem makalesi

Temassız dielektroforez sayesinde etiket ücretsiz İzolasyon ve Hücreler zenginleştirilmesi

17.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50634

⸱

3 Eylül 2013

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Science, Virginia Tech, 2Department of Engineering Science and Mechanics, Virginia Tech

Bu makalede

Özet

Temassız dielektroforez (cDEP) kendi içsel dielektrik özellikleri aracılığıyla sıralama ve parçacıkların zenginleştirme ulaşır. Fluidic elektrot kanallar steril karakterizasyonu olmayan zarar ve biyolojik parçacıkların sıralamaya cDEP takım elbise kumaşı, DEP geleneksel metalik elektrotlar değiştirin. Biz bir cDEP mikrocihazda hazırlamak ve hücre karakterizasyonu ve sıralama deneyler nasıl gösterilmektedir.

Özet

Dielektroforez, (DEP) bir tek biçimli olmayan elektrik alanı partiküller translasyonel hareket geçmesi polarize hangi bir olgudur ve bir yüzey işaretleyici bağımsız bir şekilde mikro-hareket yönlendirmek için kullanılabilir. Geleneksel olarak, DEP cihazlar örnek kanal model verilmiş düzlemsel metalik elektrotlar içerir. Bu yaklaşım, pahalı olması ve özel bir temiz oda ortamı gerektirir. Son zamanlarda, temassız dielektroforez (cDEP) denilen bir temas içermeyen bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yöntem, doğrudan desenleme akışkan elektrotlar tarafından elektrotları ve numune arasındaki teması ve tek polidimetilsiloksanın (PDMS) alt tabaka bir örnek kanal kaçınarak DEP klasik ilkesini kullanır ve mikropartiküller sıralamak ve zenginleştirmek için tasarlanan hızlı microfluidic stratejisi olarak uygulaması vardır. Bu yönteme özgü elektrik alanı ayrılır son derece iletken sıvı, ihtiva eden akışkan elektrot kanalları ile oluşturulur olmasıdırince bir yalıtkan bariyer tarafından örnek kanal. Metal elektrotlar doğrudan numune ile temas olmadığından, elektroliz, elektrot delaminasyon ve örnek kontaminasyon önlenir. Ayrıca, bu, ucuz ve basit bir imalat işlemi sağlar.

cDEP böylece hassas biyolojik parçacıkların manipüle edilmesi için çok uygundur. Parçacıkların üzerine etki eden dielektroforetik kuvvet cihaz geometri özelleştirilebilir tasarımı tarafından üretilen elektrik alanı uzamsal gradyan, ancak hücrenin iç biyofiziksel özellikleri üzerinde sadece bağlıdır. Bu nedenle, hala cDEP bioparticles karakterizasyonu, zenginleştirme ve sıralama izin verirken değişken, bir popülasyon içinde eksprese edilebilir bir yüzey olarak ifade edilen moleküler biyolojik bağlı olarak önler bir etiket içermeyen bir tekniktir.

Burada, biz cDEP kullanarak imalat ve deney temellerini göstermektedir. Bu yumuşak litografi kullanarak bir cDEP çipin basit hazırlanmasını açıklary teknikleri. Bir parçacık ya da hücre, dielektroforetik kuvvet sıfır olduğu frekansın geçiş frekansını karakterize etmek için deneysel prosedür tartışır. Son olarak, yumurtalık kanseri hücrelerinin bir karışımını ayırma ve mikro küreler (boncuk) flüoresan için bu tekniğin kullanımını göstermektedir.

Giriş

Biyolojik örnek zenginleştirme ve parçacık ayırma sonraki analiz için çoğu zaman gereklidir. 1. Örneğin, vücut sıvılarından nadir hücrelerinin izolasyonu kanser tespiti ve tek tek tıp kapsamında önemli tatbikatlara sahiptir. 2,3 En yaygın olarak kullanılan ayırma teknikleri zenginleştirme floresan aktive hücre vardır (FACS ) 4 ve manyetik aktif hücre (MACS), hücreleri ayırt etmek için ifade yüzey belirteçleri güvenmek 5 sıralama. Diğer stratejiler hidrodinamik 6 ya da atalet 7,8 sıralama, optik cımbız, acoustophoresis 9, 10, ve dielektroforez bulunmaktadır. 11,12 Dielektroforez, düzgün olmayan bir elektrik alanı varlığında, bir polarize parçacığın hareketidir. 13 DEP için kullanılmıştır geniş bir uygulama yelpazesi, 2,14 canlılığı, 15 hücrelerin biyoelektrik özelliklerini karakterize dayalı sıralama hücreleri de dahil olmak üzere, 16 ve sıralamahücre biyofiziksel özellikleri bağlı değişiklikleri üzerine ing. 17,18 geleneksel DEP bir voltaj uygulamak ve bu güçlü bir tekniktir da düzgün olmayan bir elektrik alanı. 13 uyarılması için bir mikroakışkan kanal içinde desenli düzlemsel elektrotlar kullanan, zorluklar gibi ortaya çıkabilir elektrot katmanlarına ayrılma ve elektroliz. İzolatör bazlı dielektroforez (IDEP) 19 tıkanmayı elektrot delaminasyonu ve bir DC elektrik alanı gayri muntazamlıkların neden model verme izolasyon yapıları ile elektrot alanının mekansal bozulması zorluklarını ele almıştır. IDEP seçici olarak canlı ve ölü bakteri hücrelerinin ayrılması için kullanılmış, 19 bakteriyel sporlar, 20 ve işlemek DNA, diğer uygulamalar arasında 21 izole eder. Genellikle gerekli yüksek DC gerilimlerin bir sonucu olarak oluşabilir çünkü Joule ısıtma bir meydan okuma olabilir. Bu zorlukları düzeltmek için, temassız DEP mikrovasıtalar geliştirilmiştir. 22-24

Burada sunulan teknik o kadar metalik elektrotlar ve örnek kanal arasında doğrudan temas olmaması için adlandırılmış, temassız dielektroforez (cDEP) kullanır., bu stratejiye Benzersiz 22 ile dolu sıvı elektrot kanalları ile metalik elektrotlar yedek Bir son derece iletken bir çözüm. Bu sıvı elektrotlar, kapasitif bir AC gerilim ile örnek kanala ince bir yalıtım engeli boyunca birleştirilir. Elektrotlar ile örnek temasını ortadan kaldırmak gibi elektroliz ve kabarcık oluşumu, numune kontaminasyonu ve elektrot delaminasyonu gibi DEP-tabanlı yöntemler ile ilgili sorunları azaltır. Bu örnekteki hücrelerin canlılığını destekler çünkü, bir sonuç olarak, cDEP biyolojik örnekler için özellikle yararlıdır. Önemlisi, cDEP örnek sterilite koruyabilirsiniz. Bir çip, bir hücre kültürü kaputu hazırlanabilir ve deney metal elektrotlara örnek temas gerektiren veya örnek environme açık olmasını gerektirmeden yapılabilirnt. Basit bir rezervuar steril numune kurtarma kolaylaştırmak için çip çıkışına monte edilebilir. Buna ek olarak, örnek kanal ile aynı biyolojik olarak uyumlu polimer malzemenin (PDMS) sıvı elektrot üretim metal elektrotların özel modelleme, üretim için gerekli olan zaman ile ortaya çıkan yüksek maliyetini düşürür, ve ilk modelleme için özel temiz oda için ihtiyacı sınırlar yeniden silikon gofret damga.

DEP nedeniyle parçacıkların hareketi, tanecik ve ortamın yanı sıra, elektrik alanının uzaysal gradyanlar özelliklerine bağlıdır. Bir parçacık ve frekans-bağımlı faktör, Clausius-Mossotti (CM) faktörü olarak adlandırılan, aralık -0.5 1 bir değer alır ve DEP kuvvet yönünü belirler. CM faktör tam sıfır olduğu frekans geçiş frekansı denir. Bu hiçbir dielektroforetik kuvvet bir parçacığın ve CM faktör değişiklikleri işaretine uygulanan edildiği noktadır. A sinert katı mikrosferlerin ingle geçiş frekansı oluşur negatif pozitif CM faktör değişiklikleri 0.01 S / m, NDEP gelen pDEP 10'a yakın var bir geçiş gösteren bir birinci geçit sıklık sırasına düşük iletkenlik tampon memeli hücreleri için 25. - 100 kHz ve boyut, şekil, hücre iskeleti ve hücrenin membran özellikleri tarafından etkilenmiştir. 26,27 NDEP rejimine pDEP bir vardiyada ikinci bir eşik frekansı 10 MHz mertebesindedir, ve etkilenir çekirdek-sitoplazma oranı, sitoplazma iletkenlik ve endoplazmik retikulum. 27 DEP kuvvet sıvı akışının varlığı olmadan uygulanabilir, ancak burada süspansiyon halindeki partiküllerin sürekli bir sıralama elde etmek için bir akan sıvı kullanmaktadır. Dielelektroforetik kuvvet ve Stokes sürtünme kuvveti kombine etkisi, bir parçacığın öteleme hareketini belirleyecektir.

İki frekans aralıklarında işlem için cihazlar geliştirilmiştir. Yükseköğretim frequency cihazları (100-600 kHz) gibi prostat tümörü başlatan hücrelerin (TIC), kemirgen over yüzey epitel (MOSE) hücreleri, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücre olarak, pDEP ve hücrelerin elde toplu sıralama ile çalıştırılabilir, ya da THP canlı adres seçici örnek kanalında bulunan Mesajları yalıtım ilgi hücreleri yakalayarak -1 hücreler. 28-31 daha düşük frekans (5-100 kHz) cihazlar sürekli işletmek ve bir frekansta çalıştırıldığında bir nüfus plan nüfus deneyimleri sırasında pDEP deneyimleri hangi NDEP, sıralama elde etmek için parçacık yörüngeleri yönlendirebilirsiniz. 32-34 Bu düşük frekanslı cihazlar, kırmızı kan hücrelerinin kanser hücrelerini sıralamak ilerici MOSE hücre hattının dielektrik özelliklerindeki değişimleri belirlemek ve olmayan etkilerini aydınlatmak için kullanılmıştır agresif MOSE hücrelerin saldırgan özelliklerini tersine üzerinde toksik sphingolipid tedaviler. Buna ek olarak, şu an cDEP mikrovasıtalar kadar 1 ml / saat, artan bir çıktı ile çalışmak üzere dizayn edilebilirr. 31,35

Tarif edildiği gibi, esneklik ve üretim sürecinin düşük maliyetli sunulan deney prosedürü, geniş bir uygulama aralığı için uygun olması için izin özel olarak tasarlanmış cihaz geometrileri, sağlar. CDEP uzun vadeli hedefi müteakip kültür ya da işleme için örnek kurtarma ile, bir klinik düzeyde etiket-free cep sıralama ve zenginleştirme gerçekleştirmektir. Burada sunulan teknik DEP erişilebilirliğini artırır, imalattan gelen deney için, basit ve ucuz bir yöntemdir. Biz, karakterizasyonu ve floresan mikro yumurtalık kanser hücrelerinin çoğalmasını, elde etmek için bir çip cDEP hazırlanmasını ve deney protokolü göstermektedir.

Protokol

1.. Genel Bakış: Bir Prototip cDEP mikroakışkan Aygıt Fabricating

  1. Bir silikon gofret içine istenen kanal tasarımı (Şekil 1) (Şekil 2) etch photoresist'i ve Derin Reaktif İyon dağlama (DRIE) kullanılarak önceden bildirilen prosedürleri 22 izleyin. Gofret mikrocihazda salınmasını geliştirmek için Teflon ince bir tabaka bırakın.

figure-protocol-1
Şekil 1. Düşük frekanslı sürekli ayıklama cihazın şematik. Numune kanal çalışır sağa sola ve 100 um testere daralması ile 500 mikron genişliğinde. Akışkan elektrot kanallarının iki çift, sırasıyla, kaynak ve alıcı elektrotları oluşturmak ve bir 20 mikron kalınlığında PDMS bariyer numune kanaldan ayrılır.

figure-protocol-2
Şekil 2. FabrBir cDEP cihazın ication işlemi. (a) 60 saniye için, UV ışığı selektif olarak cDEP cihaz geometrisinin bir maske desen üzerinden maruz fotorezist ile reaksiyona girer. (b) Fotorezist geliştirici kullanılarak kaldırılır. (c) Derin Reaktif İyon Aşındırma (DRIE) 50 um derin özellikleri aşındırma ve 70 ° C'de tetrametilamonyum hidroksit (TMAH)% 25 ıslak aşındırma 5 dk için kullanılan yan duvarlarda pürüzlülüğü azaltmak için kullanılır. (d) bir Teflon kaplama aygıtı salınmasını geliştirmek üzere eklenmektedir gofret. (e) PDMS gazı gittikten sonra yeniden kullanılabilir gofret pul üzerine döküldü ve 100 ° F (f) PDMS gofretin çıkarılır, 45 dakika boyunca sertleştirilir. PDMS ve temiz bir cam slayt 2 dakika boyunca hava plazmaya maruz kalan ve birbirine bağlanır.

  1. Dökülmesine önlemek için alüminyum folyo ile sarın gofret. Yaklaşık 20 dakika boyunca madde, de-gaz sertleştirme elastomer 10:01 oranında polidimetilsiloksan (PDMS) karıştırın, Ve gofret üzerine dökün. Sıcaklık 100 ° C 'de 45 dakika boyunca damganın Teflon kaplamanın zarar görmesini önlemek. Cihazın soğumasını bekleyin.
  2. Soğutma işleminden sonra, alüminyum folyo kaldırmak bir cerrahi bıçak kullanılarak PDMS Döşeme ve boru boyutuna uygun olan bir kör zımba kullanarak kanal giriş / çıkışında erişim delikler. Burada, bir 1.5 mm künt zımba kullanılır.
  3. Sırasıyla su ve sabunla durulama, etanol, DI su ve hava ile kurutma, kullanarak bir cam mikroskop lamı temizleyin. Scotch Magic bandı kullanarak PDMS Aygıtı temizleyin. Kanallar temiz olduğundan emin olmak için mikroskop altında inceleyin. 2 dakika boyunca hava plazma slayt ve PDMS cihaz Açığa. Sıkıca cihazı ve slayt (Şekil 3) arasındaki hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek, cam slayt cihazının kanal tarafına basın.

figure-protocol-3
Şekil 3,. (a) silikon yonga damga üretimi ve örnek sırasıyla yeşil ve kırmızı gıda boyası, dolu sıvı elektrot kanalları (b) PDMS işlenmiş cam cihaz sırasında fotolitografi için kullanılan maske. Boyutları için Şekil 1'e bakınız. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

2. DEP Tamponu içinde bir hücre süspansiyonunun hazırlanması

  1. "DEP tamponu" olarak adlandırılacaktır düşük iletkenlik hazırlayın (100 uS / cm) tamponu (% 8.5 sukroz [ağırlık / hacim]% 0.3 glükoz [ağırlık / hacim]% 0,725 RPMI [ağırlık / hacim]) . 16.
  2. 3 x 10 6 hücre / ml 'de DEP tamponu içerisinde hücrelerin süspansiyonu. Burada, kanserli geç evre yumurtalık fare yüzey epitel (MOSE-L) hücreleri kullanılır.

Not: tripan mavi boya dışlama yöntemi ile hücre canlılığı analizi canlılığı hafif bir düşüş gösterdi5 saat sonra, oda sıcaklığında DEP tampon maddesi içinde süspansiyon haline erken evre MOSE (MOSE-E) hücreleri (95.1-91.6 'den%). Bu canlılığı benzer hafif bir azalma hücreleri uzun süreli tampon DEP saklanmalıdır gerektiğini belirten MOSE-L hücreleri için meydana geldiği tahmin edilmektedir.

  1. Bu tür enzimatik olarak aktive edilmiş Calcein AM gibi bir floresan zar geçirgen boya kullanarak hücreleri Boya.
  2. Boyalı hücre süspansiyonu iletkenliği ölçülmektedir. Iletkenlik yaklaşık 100 us / cm olmalıdır. Iletkenlik ölçme çok yüksek ise, 6 hücre / ml x 10 3 de DEP tampon içinde tekrar süspansiyon aşağı örnek spin ve iletkenlik ölçümü tekrarlayın.

3. CDEP mikroakışkan Chip yükleniyor

  1. 30 dakika boyunca vakum altında mikroakışkan çip yerleştirin.
  2. Bu arada, mikroakışkan çip yer alacak mikroskop sahneye şırınga pompasından mesafe yayılan esnek tüp bir parça kesti. Burada, boru içinde bir 6 inç uzunlukgereklidir. Şırınga, iğne ucu Fit boru.
  3. Borunun kesit alanı ile hedef toplanan numune hacmine bölünmesiyle çıkış boru için gerekli uzunluğu tahmin. Boru uzunluğunu gerektirir kesin.
  4. Şırıngaya hücre süspansiyonu çizin. Kabarcıklar boru veya şırınga yer olup olmadığını kontrol edin.
  5. Vakum dan çipi kaldırılması üzerine, kanallarda hapsolmuş hava kabarcıklarını önlemek için hızlı bir çıkış boru ve prime örnek Kanalı ekleyebilir. Bariyer yalıtım ince (20 um) kırılması önlemek için astar zaman, bariyer yırtmadan 5 ml / saat yakın sabit bir yüksek iş dayanabilir gözlenmektedir da yavaşça, şırınga dokunun.
  6. Başbakan elektrot kanalları, hızlı bir şekilde her akışkan elektrot kanalın bir çıkış boş pipet uçları yerleştirmek. Rhodamine B küçük bir miktar ihtiva eden 200 ul PBS pipet ve yavaşça elektrot kanalının karşı ucuna sıvı tanıtmak dokunun. Hafif basınç koruyunrhodamine B ile PBS gözle boş pipet ucu kadar ilerleyene kadar. Her bir elektrot kanal için tekrarlayın. Rhodamine B, sadece flüoresan akışkan elektrot kanalları göstermek için kullanılır.
  7. Emişli sonra, pipet ucu rezervuarlarda rhodamine B. kaçının kabarcık oluşumu ile PBS ile her pipet haznesine, yukarı ve hafifçe aşağı pipetleme tarafından görünür bir kabarcık kaldırın. Çıkış tüpünü ayırın ve uygun atın, sonra hedef hacmi toplamak için yeni bir çıkış tüp deposunu takın.

4. CDEP Chip kullanarak Hücreler karakterize Crossover Frekansı

  1. Dijital kamera (Şekil 4) ile donatılmış bir inverted mikroskop sahnede çip yerleştirin.

figure-protocol-4
Şekil 4. (a) cDEP deneyler için genel deney düzeneği. CDEP çip ters mikroskop platformun üzerinde yer alır. Bir kamera kayıt için görüntüleri bilgisayara gönderir. Şırınga pompası, sabit bir giriş akış tutar. Fonksiyon jeneratörü, yüksek gerilim yükseltici tarafından girdi ve tel elektrotlar ile cDEP çipe bağlı olan bir sinyal üretir. Osiloskop çip gönderilen sinyalini izler. (B) cDEP çip ve akışkan ve elektronik bağlantılarının Detay görünümü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

  1. Şırınga pompası şırınga monte ve akışkan elektrot kanal rezervuar içine tel elektrotlar eklemek.
  2. Şırınga pompası ve şırınga arasında iyi bir temas sağlamak için, 1 ml / saatte boyunca sıvı pompalanması. Görme engelsiz hücrelerin akışını ve kabarcıkların veya sızıntı olmamasını sağlamak için kanal uzunluğunu kontrol edin. Kırmızı0.005 ml / saat akış oranı UCE.
    Not: 1 ml / saat 31,35 kadar yüksek Throughput diğer geometrilere cihazlarda elde edilmiştir.
  3. Güvenliğiniz için, fonksiyon jeneratörü, yüksek gerilim amplifikatör ve osiloskop üzerinde güç ve istenilen gerilim ve frekansa ayarlayarak elektronik test edin. İşte bu parametreler 200 V ve 20 kHz bulunmaktadır. Kabul edilebilir performans, güç kapalı doğrulanması üzerine. Yüksek gerilim elektrotları amplifikatöre bağlayın.
    Not: Bu deneyler için kullanılan yüksek voltajlı elektronik çalışırken uygun elektrik güvenlik prosedürlerine dikkat.
  4. Sürekli akışı sağlanması üzerine, istenilen frekansta istenilen gerilim uygulayın. Bu deneyde, gerilim 5-60 kHz arasındaki frekanslarda 200 V RMS olduğunu.
  5. Görüntü işleme teknikleri kanal hücre dağılımı ölçmek için ve geçiş frekansı karakterize etmek için (adım 5) ile hücre tepkisinin kaydedin video dosyaları. Bunu yapmak için,sabit bir gerilim muhafaza ve sistematik olarak frekans değişir. Deney, hem de rasgele deneysel çalışmalar arasında başlangıcında ve sonunda, herhangi bir elektrik alanı uygulamadan hücrelerinin dağılımını kontrol hücre dağılımı kaydedin. Hücreleri (burada, 5 dakika) izlenen konuma girişten akması için gereken zaman miktarını tahmin. Yeni frekansı ayarladıktan sonra, sonra (burada, hücre dağılımının 2 dk Video) kayıt yapmaya başlar, bu kadar süre bekleyin.

5. Karakterizasyon Crossover Frekans Görüntü İşleme

  1. Bir bilgisayar komut dosyası kullanarak, bağıl konum y-(z-yönünde kanalın derinliği dikey olduğu yerde, Y-yönünde kanal genişliği, ve x-yönünde kanal uzunluğu) tespit etmek üzere, her bir video çerçeve kare analiz her flüoresan hücre veya parçacığın bir alt kanal yüksek DEP kuvvet bölgeden x koordinatı belirtilmiş. Göreli dis bir grafik oluşturmaktribution.
  2. Kontrol dağılımının merkez her voltaj ve frekansta dağılımın merkez karşılaştırın. , Belirli bir voltaj ve farklı frekanslar için, merkez denetimin y-pozisyonunda eşleşen geçiş frekansını belirler.

6. Hücre sıralanması veya Zenginleştirme Gerçekleştirme Experiment değişen

  1. 3 x 10 6 partikül / ml 'lik bir toplam konsantrasyonda DEP tamponu içerisinde arzu edilen karışımı sterilize edilir. Burada, bu karışım DEP tampon maddesi içinde 4 um floresan boncuklar ile MOSE-L hücredir. Bir cDEP cihaz hazırlamak için daha önce tarif edildiği adımları.
  2. Bir karışımdan hücreleri sıralamak veya zenginleştirmek için, hedef hücrelerin çapraz frekansları ve daha önce anlatıldığı gibi, arka plan parçacıkları belirler. Parçacıkların popülasyonlar zıt d DEP kuvvetler yaşarlar, böylece hedef hücrelerin ve arka plan parçacıkların iki çapraz frekansları arasında bir frekansta deneme çalıştırınirections. MOSE-L hücreleri ve 4 mikron boncuk sıralamak için, 11,90 ± 0.63 kHz yukarıda mikrocihazda çalışır. Son zamanlarda Salmanzadeh et al. 33 tarafından rapor MOSE-L hücreleri ilk geçiş frekansı
  3. Bir sıralı numunenin içeriğini toplamak için, çıkış ağzına eldiven parmağını yerleştirerek ve hafifçe boru asılarak, hedef hacmi toplama üzerine çıkış tüpünü çıkarın. Daha fazla analiz için bir rezervuar içine toplanmış hedef hacmi dökün Not:. Diğer örnek kurtarma yöntemleri çip kalıcı rezervuar bağlama ve basit pipetleme örnek kaldırarak içerebilir.

Sonuçlar

DEP elektrik alan mevcut olduğu zaman cihaz operasyonel doğrulamak için örnek kanalda nitelik dikkat edilmelidir. DEP varlığı açısından test etmek için bir yöntem, çok güçlü ve pDEP NDEP tahmin edilmektedir geçiş frekansı pDEP ve en memeli kanser hücreleri için NDEP gözlemlemek için <10 kHz gözlemek için (yaklaşık> 40 kHz ikinci frekans değerleri için ayarlamaktır ) 100 us / cm iletkenlik ile tampon. Bu atıl mikrosferler geçiş frekansının üzerine kendi geçiş frekansının altında pDEP sergiler ve NDEP unutulmamalıdır. Burada yer alan özelliği testere dişli geometrisi için, daha düşük bir test pDEP frekansta ise, NDEP, inci zincirleme ve kanalın özelliği testere dişli kenarında hücreler veya parçacıkların odaklama oluşumu ile gösterilen yüksek test frekansta hücreler için görülmelidir hücreler, kanalın düz kenar yakın bölgeye sınırlı olarak açık olmalıdır. Bu düşük frekanslar, hücreler lys olabilirnedeniyle elektroporasyon e, yani örnek daha az hücre içeren görünebilir, ve bir enzimatik aktive fluoresan boya kullanılarak eğer görünür olanlardır büyütülmüş veya bulanık görünebilir. PDEP ve NDEP meydana hangi frekansları doğrulanması protokolde tarif edildiği gibi geçiş frekansının tespit edilmesini mümkün kılmaktadır. Burada kullanılan bu MOSE-L gibi memeli kanser hücreleri için, 60 kHz (Şekil 5b), 5 kHz (Şekil 5a) ve güçlü pDEP NDEP de görülmektedir. MOSE-L hücreleri, 17.7 ± 3.3 um (n = 268 hücre) bir çapa sahiptir ve taneler, 4 | im nominal çapa sahiptir. Ilerleme önceki aşamalarında MOSE hücrelere kıyasla MOSE-L hücrelerinin dielektrik özelliklerinin tam bir analizi Salmanzadeh ve ark. 33 tarafından son çalışmalarında bulunabilir

PDEP ve NDEP bu uçlarda dikkate alınmadığı takdirde, çeşitli sorunlar meydana geliyor olabilir. Numune iletkenlik nedeniyle kirletici veya hücre eritici için çok yüksek olabilir. YETERSİZnt elektrik alanı nedeniyle örnek kanalını çevreleyen kanalların kısmına akım iletimini önlemek için, sıvı elektrot kanalları, sıkışıp kabarcıklara oluşturulabilir. Durağan olmayan akış yeterli bir süre boyunca, vakum altında saklama cihazına olmadığını ya da hızlı bir şekilde nedeniyle sınırlı ölçüde bağlanmış PDMS delaminasyona vakum, sızıntı çıkarmadan sonra aygıtı doldurulmaması kaynaklanan kabarcıklar, şırınga ya da giriş boru sıkışmış bir kabarcık kaynaklanabilir Pompa çalışma aralığının uç noktalarında kanal dolgu veya akış oranları zaman cam slayt, aşırı kuvvet bariyer membran gözyaşları içinde sarf.

Hücrelerin geçiş frekansını belirlemek için ek olarak, bu teknik, MOSE-L hücreleri ve boncuk karışımı ile burada gösterilen bir karışım, sıralamak için kullanılabilir. Bu örnek MOSE-L hücreleri pozitif dielektroforez (pDEP) deneyimi frekanslarda 4 um boncuk tarafından sergilenen negatif dielektroforez (NDEP) yararlanır. Biz o200 V RMS ve 10 kHz (Şekil 6a) de cihazı perated ve NDEP deneyimli olarak hücreler ve boncuklar hem de karışık görülmektedir. Boncuklar iki bileşeni (Şekil 6b) içine karışımın ayrılması için, kanalın alt kısmına sınırlı ise 50 kHz anda, kanalın üst MOSE-L hücre hareketi görülmektedir.

figure-results-1
Şekil 5,. MOSE L-hücrelerinin konumu uygulanan elektrik alanının frekansı değiştirilerek değiştirilebilir. Resmi numune kanal nihai özelliği testere dişli alınır ve akışkan elektrotlar yandaki köşelerinde yer alır. Bunlar, PBS kanalları görselleştirmek için fluoresces rodamin B içeren doldurulur. (A) MOSE-L hücreleri, 200 V rms NDEP deneyim ve 5 kHz. (b) MOSE-L hücreleri 200 V RMS ve 60 kHz inci zincirleme ve pDEP karşılaşabilirsiniz. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-2
Şekil 6,. MOSE-L hücreler (yeşil) ve 4 um boncuk (kırmızı) içindeki bir karışımı, 200 V (a). Bir alçak frekans cDEP cihazının örnek kanal nihai testere dişli özelliği aracılığıyla akar ve 10 kHz hücreler ve boncuklar karıştırılır. Oklar 200 V At (b). Hafifçe olasılığı nedeniyle düşük frekanslı koşullarına ölen hücrelerin görünen işaret ve 50 kHz hücreleri pDEP deneyim ve kanalın özelliği kenarına taşımak, boncuk NDEP tecrübe ederken ve bölge lâyık sınırlı kalır düz kenar.p_upload/50634/50634fig6highres.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Tartışma

DEP parçacıkların dielektrik özelliklerinin belirlenmesi ve izolasyon veya zenginleştirme uygulamaları sıralama doğru parçacık hareketini yönlendirmek için güçlü bir tekniktir. Nedeniyle bir numune ile doğrudan temas elektrod zararlı etkisi, başkalarının temasını önlemek için, daha önce sunulan yönteme benzer yaklaşımlar geliştirmişlerdir. Örneğin, Beşir vd. Ince bir cam lamel ile baskılı devre kartı elektrotlar ayrılmış microfluidic PDMS cihaz kullanarak temassız DEP cihazları geliştirildi ve bu teknik aynı zamanda video formatında kullanılabilir yapılır. 23,36

Burada, tek bir PDMS substrat kullanılarak bir çip cDEP ve akışkan elektrotların imalat ve hücre ve floresan boncuk karışımından yumurtalık kanser hücrelerinin ayrılması için deney protokolü göstermiştir. Sunulan tekniği başarıyla liv sıralama içeren daha karmaşık ve fizyolojik ilgili uygulamalar, çeşitli için kullanılır olmuşture ve ölü hücreler, 28 tümör prostat kanseri hücreleri hücreler söz seyreltilmiş, kırmızı kan hücreleri, 31,32 ve 37 meme kanseri ve yumurtalık kanseri aşamalar arasında farklılaşan 30 kanser hücreleri. 29 cDEP da parçacıkların karıştırılması için kullanılmıştır. 38 Bu uygulamalar yer alan basit bir teknik kullanılarak, çeşitli amaçlar kanal geometrisinin tasarımını değiştirerek basitçe gerçekleştirilebilir olduğunu göstermektedir.

. DEP parçacıklar küresel parçacıklar için 13 manipülasyonu için böylece mikro yararlı olan, translasyon dielektroforetik kuvvet büyüklüğü ve elektrik parçacık ve süspansiyon ortamının özellikleri, hem de elektrik alanının gradyanı kare bağlıdır:

figure-discussion-1
ε m süspansiyon ortamının geçirgenliği olduğu, r yarıçapıParçacığın ve Rc [k (ω)] Clausius-Mossotti (CM) faktörü gerçek bir parçasıdır. CM etken süspansiyon ortamı ile karşılaştırıldığında parçacık göreli polarize bir ölçüsüdür ve dielektroforetik kuvvet yönünü belirler. Bu olarak tanımlanmaktadır

figure-discussion-2
nerede figure-discussion-3 ve figure-discussion-4 sırasıyla parçacık ve orta, karmaşık geçirgenlik değerinin bulunmaktadır. Karmaşık geçirgenlik, figure-discussion-5 , Iletkenlik (σ) ve frekans (ω) bağlıdır. Küresel parçacıklar CM faktörü teorik olarak -0.5 ve 1 arasında bağlıdır. CM faktör negatif ise orta parçacık daha polarize olabilir, yani parçacıklar bölgelerinden uzaklaşacak, çünkü, parçacıklar NDEP deneyimyüksek elektrik alan eğimleri. CM faktörü pozitif ise, parçacıklar orta daha fazla polarize olabilir ve bunlar, yüksek elektrik alan gradyanları bölgelerine doğru hareket ettiği pDEP deneyim.

Bu hücrelerin gibi yapıda homojen olmayan biyolojik parçacıklar için, Clausius-Mossotti faktör parçacık geçirgenlik için etkili değerinden belirlenebilir:

figure-discussion-6
nerede figure-discussion-7 ve figure-discussion-8 örneğin, sırasıyla sitoplazma gibi hücresinin iç, ve plazma membranı, etkin kompleks geçirgenlik ve karmaşık geçirgenliği olan,. r hücrenin yarıçapı, d, plazma zarının kalınlığı 26

Özellikle de, bir süspansiyon içinde parçacıklarla oluştuğundaSıvı, akışkan verilmesi için parçacık nisbetle hareket parçacık üzerinde bir sürükleme kuvveti oluşturur. Parçacık üzerindeki genel kuvvetini belirleyen bu sürtünme kuvveti dikkate alınmalıdır. Burada ilgi durumlar için, viskoz kuvvetlerin hakim ve parçacıklar, küresel, küçük ve nispeten düşük hız ile hareket kabul edilir, bu yüzden Stokes 'sürükle yasa sürtünme kuvveti için iyi bir yaklaşım sağlamaktadır:

figure-discussion-9
η akışkanın viskozitesidir burada, u p parçacığın hızıdır, ve f u da hareketli olabilir sıvısının hızıdır. Dielektroforetik kuvvet, sıvı ve partikül özellikleri bilinmektedir ve bilinen bir akış hızı göz önüne alındığında, sürtünme kuvveti ve dielektroforetik kuvvet arasındaki denge parçacık hızını tahmin etmek için çözülebilir. Hücreler deneyim eşiğin altında olması gerekmektedir kesme oranı olan, c, enell yokedici oluşabilir.

Parçacıkların elektriksel özelliklerinin karakterizasyonu tahmin ve DEP altında nasıl tepki vereceğini kontrol etmek gereklidir. Bu çalışmada, özellikle hücrelerin ilk geçiş frekansını belirlemek için protokol göstermek için MOSE-L hücreleri ile düşük frekanslı cDEP kullanılan ve daha sonra muhalif DEP cevaplara dayanarak polistiren boncuklar ve MOSE-L hücrelerinin sürekli sıralama gösterdi.

CDEP cihazın geometrik cihazlar yüksek frekans veya düşük frekanslı bir biçimde çalıştırılabilmesi için tasarlanmış izin vererek, elektrik alanının uzamsal değişim derecelerine değiştirebilir ve yüksek seçicilik ve belirli bir hücre tipi için ayırma verimliliği için değiştirme olur. Ayrıca, yüksek kapasiteli cihazlar daha geniş bir kanal imal edilmesi ile geliştirilebilir, paralel, 30 olarak ya da dikey olarak elektrot kanalları nispeten derin altında ve üstünde istiflenmiş olan çok katmanlı imalat 35, 30 kanallarörnek kanalı. Ince zarlar tabakalar arasındaki bir bariyer oluşturur. Polimetilmetakrilat (PMMA) ve polikarbonat fabrikasyon cihazlar ile ön test (PC) ince filmler MOSE-L hücrelerinin DEP tepki göstermiştir. Şimdiki çabalar, çok katmanlı yüksek verimli cihazlar rafine ve nihai bir plug-and-play platform karşı periferik sistemini geliştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Sunulan temel deneysel tekniği genişletmek için, cihazın uygulamalar ve özellikler gibi karakterizasyonu karşı sıralama veya cihaza örnek rezervuarları ve yarı-otomatik sistem ekleme gibi özel talepleri sığdırmak için uygun olabilir.

Açıklamalar

Dr Rafael Davalos temassız dielektroforez için bekleyen bir patente sahip.

Teşekkürler

Desteklenen bu çalışma, Ulusal Bilim Hibe No EFRI 0938047 altında Vakfı ve Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilimler Virginia Tech Enstitüsü (İÇTAŞ) tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar MOSE-L hücrelerinin kendi tür hediye Dr Eva Schmelz ve Dr Paul Roberts için takdirlerimi ifade etmek isterim. Yazarlar onun bu belgeyi düzenleme ve deney hazırlama ile ona yardım için hücre kültürü, caitlan Swaffar ile yardım ve tüm Bioelectromechanical Sistemleri laboratuvar üyeleri için Angela Anderson kabul.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Polidimetilsiloksan (PDMS)Dow Corning, Midland, MI, ABDSylgard 184
Cam slaytlar Mikroskop Deposu760792x3 inç zemin kenarları
Mikro delikli PTFE BoruCole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, ABDEW-06417-31İnce duvarlı 20 ölçer, 0.032 "ID x 0.056" OD, 100 ft / rulo
Luer-slip plastik şırıngalarUlusal Bilimsel şirketS7510-1
İğne ucuHoward Elektronik aletlerJG20-1.020 Ölçer 1.0 ", ID = 0.025" OD = 0.036 "
D (+) - SukrozFisher Scientific, Adil Çim, NJS3-500
D (+) - glikoz, reaktif ACS, susuzAcros Organics NV, Adil Çim, NJAC410955000
RPMI-1640 OrtaKalite Biyolojik A.Ş.112-025-101
Calcein, Molecular ProbesInvitrogen Corp. (yaşam teknolojileri), Carlsbad, CA, ABDC3100MPuyarma dalga boyu 488 / emisyon dalga boyu 516
Rhodamine B, OBilim LaboratuvarıSLR1465-100Guyarma dalga boyu 540 / emisyon dalga boyu 625
Fosfat tamponlu salin (10X)Gbiosciences, St. Louis, MORC-147
Leica, ters çevrilmiş ışık mikroskobu Leica Microsystems, Bannockburn, IL, ABDLeica DMI 6000B
Leica DFC420, renkli kameraLeica Microsystems, Bannockburn, IL, ABDLeica DFC420
Fonksiyon üreteci GW Instek, Taipei, TayvanGFG-3015
Geniş bant güç amplifikatörü Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, ABDAL-50HF-A
HFHV Çıkış TrafoAL-T50-V25/300-F100K-600K
Yüksek gerilim amplifikatörüTrekModel 2205
USB Modüler Osiloskop, 100 MHzAgilentTechnologiesU2701A
Genişletilmiş Plazma TemizleyiciHarrick PlazmaPDC-001/002 (115 / 230V)hava plazma
Scotch Magic bant3Mmevcut herhangi bir genişlik yeterlidir
1,5 mm zımba Harris Uni-CoreZ708836-25EA.25
Tripsin-EDTAInvitrogen25200-056
FluoSpheres Sülfat MikrokürelerInvitrogenF88584.0 & mu; m, kırmızı floresan (uyarma dalga boyu 580 / emisyon dalga boyu 605)
AZ 9260 fotorezist AZ Elektronik Malzemeler
AZ 400 K geliştiriciAZ Elektronik Malzemeler
Tetrametilamonyum hidroksit (TMAH) % Virginia Tech tarafından sağlanan temiz oda
DRIE makinesi kullanılarak uygulananTeflon kaplama
Silikon gofretÜniversitesi Gofret452100 mm çap, 500 & mu; m kalınlık, bir tarafı cilalı (SSP)
Derin Reaktif İyon Aşındırma (DRIE)AlcatrelAMS SDE 100
% 25 temiz oda

Kaynaklar

  1. Butler, M. Cell culture and upstream processing. , Taylor & Francis. (2007).
  2. Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. Rare Cell Capture in Microfluidic Devices. Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).
  3. Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112(2013).
  4. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).
  5. Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. Multitarget magnetic activated cell sorter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).
  6. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).
  7. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).
  8. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).
  9. Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. Automated single-cell sorting system based on optical trapping. J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).
  10. Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond. Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).
  11. Pethig, R. Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, (2010).
  12. Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood. Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).
  13. Pohl, H. A. Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields. , Cambridge University Press. (1978).
  14. Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature. Journal of Membrane Science. , Under-review (2012).
  15. Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis. J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).
  16. Flanagan, L. A., et al. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 26, 656-665 (2008).
  17. Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry. Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).
  18. Hoettges, K. F., et al. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).
  19. Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water. Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).
  20. Davalos, R. V., et al. Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators. Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).
  21. Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields. Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).
  22. Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation. Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).
  23. Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).
  24. Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures. Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).
  25. Hughes, M. P. AC electrokinetics: applications for nanotechnology. Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).
  26. Pethig, R. Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 4, 022811(2010).
  27. Pethig, R. Ch. 4. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M. auro, Ozkan, M. ihrimah, Heller, M. ichael J. . 4, Springer. US. 103-126 (2007).
  28. Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-445 (2010).
  29. Salmanzadeh, A., et al. Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  30. Salmanzadeh, A., et al. Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature. Lab Chip. 12, 182-189 (2012).
  31. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. EMBC 2012., Annual International IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Aug 28-Sep 1, San Diego, , (2012).
  32. Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples. Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).
  33. Salmanzadeh, A., et al. Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells. Biomicrofluidics. , (2013).
  34. Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2012 Annual International Conference of the IEEE, , 590-593 (2012).
  35. Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations. Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).
  36. Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar. J. Vis. Exp. (48), e2545(2011).
  37. Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).
  38. Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis. Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Dielektroforetik KuvvetKesi im FrekansMikroak kan CihazEtiketsiz Ay klamaH cre Zenginle tirmeElektriksel zelliklerYumu ak LitografiAk kan ElektrotlarPartik l Ay rma
Temassız dielektroforez sayesinde etiket ücretsiz İzolasyon ve Hücreler zenginleştirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.