Yöntem makalesi

Ileri Genetik Yaklaşımlar

DOI:

10.3791/50636

⸱

23 Ekim 2013

 , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for Microbial Pathogenesis, Duke University Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chlamydia trachomatis, cinsel yolla bulaşan hastalıklar ve göz enfeksiyonlarının etiyolojik ajan, rekombinant DNA ile kötü nedeniyle deneysel dönüşümü olan inatçılık için karakterize kalır. Biz C. genetik analiz gerçekleştirmek için bir yaklaşım geliştirdi moleküler genetik araçları olmamasına rağmen trachomatis. Bizim yöntemi içerir: i) hızla farklı fenotipleri ile genetik olarak tanımlanmış mutantlar kapsamlı kütüphaneleri oluşturmak için kimyasal mutagenez ii) tam genom dizileme (WGS) altta yatan genetik lezyonlar eşleştirmek için ve mutasyona uğramış gen (ler) arasındaki ilişkiyi bulmak için ve.. yaygın bir fenotip;. mutant ve yabani tip bakteri, memeli hücrelerinin ko-enfeksiyon yoluyla rekombinant suş iii) üretimi. Buna göre, genotipler ve fenotip arasındaki nedensel ilişkileri kurmayı başardık. Kimyasal kaynaklı gen varyasyonu ve WGS bir bağlantı karşılıklı genotip-fenotip ilişkilerini site kurmakld genetik analiz etmek, inatçı tıbbi ve çevre önemli mikroorganizmaların büyük listesine geniş uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilişkili olan ABD'de yılda yaklaşık 2.8 milyon genital sistem enfeksiyonları (Hastalık Kontrol Merkezi) sekel gibi pelvik inflamatuar hastalık, ektopik gebelik ve infertilite (1) olarak için zorunlu hücre içi bakteri Chlamydia trachomatis hesapları. Chlamydia spp benzersiz var bulaşıcı ama olmayan kopyalayan temel vücut (EB) ve bulaşıcı olmayan ama replikatif ağsı vücut (RB): iki şekilde oluşan bifazik gelişim döngüsü ile fizyolojisi. Enfeksiyon endoctyotosis (2) takip epitel hücrelerine EBS eki ile başlar. Bir membran-bağlı vakuol bir dahil olarak adlandırılan içinde, EBS sonra ikili fisyon tarafından çoğaltır RB formu, içine ayırt. Orta döngüsü olarak, RBS geçişler sonra tekrar enfeksiyon yeni tur başlatmak için hücre dışı boşluğa atılırlar EBS içine zaman konakçı hücre lysis oluşumunu (3).

C. trachomatis olanBu bakteri genetiği en çalışmalara merkezi olmuştur hedeflenen gen değiştirme, transpozonlar ve iletici faj, gibi standart moleküler genetik araçları ile rutin manipülasyon dirençli, tek tek Chlamydia genlerin doğuştan gelen bağışıklık kaçırma katkıda ölçüde belirsizdir , besin satın alma, gelişim geçişleri ya da ökaryotik ev sahibi içinde (4) patojen hayatta kalması için önemli diğer işlemler. Sonuç olarak, bu patojen klinik önemi rağmen kötü karakterize kalır.

Chlamydia spp genom. Yeni Nesil sıralama teknolojileri kullanarak sıralı birden fazla tür ve biyotipe ile (5) (~ 1 Mb) nispeten küçük. WGS tarafından Karşılaştırmalı genom analizi virülans faktörlerinin potansiyel fonksiyonu (9, 10) gibi bazı bilgiler sağlamıştır klamidya türleri ve insanlar (6-8) ve bir ölçüde kendi uyum evrimi içine benzersiz bir bakış açısı sağlamıştır. Tklinik izolatlar tarafından görüntülenen o genetik çeşitlilik, genlerde mutasyonlar kolayca karşı seçilmiş olurdu muhtemelen çünkü, sistematik en virülans faktörleri fonksiyonu eşleştirmek için gerekli çözünürlüğü sağlamaz. Virülans ölçü hataları, anket edilebilir mutasyon spektrumu genişletmek olabilir tanımlanan deneyleri ile birlikte doğal seleksiyon, mutajen bağlı gen varyasyonu, gelen karıştırıcı etkisi olmadan. Kimyasal mutajen, özellikle, onlar boş, koşullu, hypomorphic (azaltılmış fonksiyonu) oluşturabilir olarak yararlı ve hypermorphic (fonksiyon kazanç) allel vardır. Sağlam nesil genom dizileme teknolojileri gelişiyle birlikte, bu mutasyonlar kolayca tespit ve eşlenebilir. Bu şekilde, güçlü bağlantılar ileri genetik yaklaşımlar uygulama sağlayan bir gen ya da genetik mutant ve yaygın bir fenotip arasında yapılabilir.

Klinik suşlarının genom dizileri mozaik b ortayaetween serovarlar ve sık rekombinasyon (11) lokusların. Rekombinasyon ampirik kanıtlar her iki suşları genetik katkı (12, 13) için ortaya çıktı çift dayanıklı rekombinant döl, iki farklı antibiyotik dirençli suşlar ve seçim bir arada enfeksiyon ile gösterilmiştir. Böylece, bir ko-enfeksiyonu ortamda vahşi tip ve mutant suşları arasında genetik değişimi kimyasal kaynaklı mutasyon ayrılması gözlenen fenotipe yol açar etkilenen genin belirlemekte sağlar.

Burada kimyasal mutasyon, WGS ve enfekte hücre içinde DNA değiş tokuşu (14) (Şekil 1) için bir sistemine dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kimyasal Mutajenez

Not: Biz replikatif RB formu EB formu daha kimyasal mutagenez için daha uygun olduğunu buldu. Orta döngüsü (hpi 18 ile 20 arasındadır arasında), RBS önce RB-EB geçiş için en büyük numaraları altındadır. Chlamydia trachomatis, zorunlu hücre içi patojen olduğu için, ana sağlık mutajen etkileri bakteriyel kurtarma sınırlayabilir. Vero hücreleri, test edilen diğer hücre hatları EMS daha yüksek düzeyde yan etkilerine daha dayanıklı olduğu bulunmuştur.

Rekombinasyon yoluyla mutasyonlar ayrılması antibiyotik dirençli rekombinant soyu için seçimi gereklidir. Biz rekombinant analiz ve izogenik suşları izole etmek yeteneği mutantlar oluşturmak için ilaca dirençli suşlar (örneğin rifampin, spectinomycin veya trimetoprim) kullanmanızı öneririz. Antibiyotik dirençli suşlar basamaklı bir seçme işlemi (15, 16) tarafından oluşturulmuştur.

DeğilE: Chlamydia trachomatis (gerginlik L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) BSL2 patojendir. Bu patojenler işlemek için kurumsal standart işletim prosedürleri (SOP) bakın.

  1. Kültür hücrelerinin ve enfeksiyon hazırlanması:
    1. 25 cm 2 (T25) Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş, 3 ml tohum şişesi başına yaklaşık olarak 1 x 10 6 Vero hücreleri (ATCC CCL-81). 37 ° ° C,% 5 CO 2. Hücreler 24 saat içinde bir konfluent tek tabaka oluşturmalıdır.
    2. Orta aspire. Orta 3 ml'lik bir toplam hacim içinde 5 (14 x 10 ~ 6) 'lik bir enfeksiyon çokluğu (mol) (DMEM, 200 ng / ml' cyclohexamide,% 10 FBS) da Chlamydia Vero hücreleri konfluent T25 şişeleri Infect.
  2. 18 saat sonrası enfeksiyon (hpi) de mutasyon başlayın:
    1. Fosfat içinde 20 mg / ml, EMS (etil metansülfonat) hazırlayın tuzlu su (PBS) 0.9 mM kalsiyum ile tamponlanmışEMS gibi kimyasal bir güvenlik kabini klorür ve 0.49 mM magnezyum klorür, uçucu bir sıvıdır.
      Not: EMS güçlü bir mutajen ve kanserojen. EMS atık ve 1 M sodyum hidroksit ile dökülmeler, plastik, kağıt ve cam dezenfekte nötralize.
    2. Ortamı aspire ve PBS / MgCl2 / CaCl2, 3 ml ile bir kez yıkama hücreleri. Oda sıcaklığında davlumbaz bir saat süreyle PBS / MgCl2 / CaCl2, 20 mg / ml 'EMS 3 ml' si ile inkübe hücreleri. Vero hücreleri kısa bir süre için inkübatör dışında EMS ve bu koşullar konsantrasyonu hayatta edebiliyoruz. Mutajenize henüz bir kontrol örneği eklemeyi unutmayın.
    3. EMS içeren orta çıkarın ve mutajen inaktive 1 M NaOH bir kaba koyun. Kalıntı mutajen çıkarmak için 3 ml PBS + MgCI2 / CaCl2, enfekte hücreleri 3 kez yıkayın. 200 ng / ml cyclohexamide ve 25 mg / ml gentamisin ile DMEM/10% FBS 6 ml ve% 5 CO inkübe 2, 48-72 saat boyunca 37 ° C dereceye kadar. Kapanımlar mutagenez sonra 36 saat hakkında bakteri yoksun görünür. Geri kalanı boş kalır ise 72 saatte kapanım yaklaşık% 10 bakteri ile doldurulur.
    4. Hipotonik lizis tarafından EBS Özü: Tamamen orta aspire. 10 dakika boyunca hücreleri çıkarmak için 1.0 mL H2O ve kaya ekleyin. En az 10 kez ve aşağı yukarı pipetleme hücreleri lyse. Bir mikrofuge'ye lizat ve 1x son konsantrasyon getirmek için 0.250 ml 5x sakaroz fosfat glutamat tamponu (SPG) ekleyin toplayın. -80 ° C de saklayınız
      Not: mutagenez seviyesi rifampisin direnç indüksiyonu ile değerlendirilebilir. Rifampisin direnç testi sıklığı, plak 1 x 10 8 ve 7 x 200 ng / ml 'si arasında rifampin varlığında bakteri 10 kat seri dilüsyonları. Rifampisin direnç sıklığı kaplama bakteri sayısına bölünmesiyle rifampisin dirençli plak sayısı olarak tanımlanır. Plak talimatlar için aşağıdaki bölüme bakın.

2. Plak Arıtma tarafından Chlamydia trachomatis Mutant Suşlarının klonal izolasyonu

  1. 6 kuyucuğu Vero hücrelerinin konfluent mono tabakaları ayarlayın: Tohum ~ 0,4 de başına 3 ml DMEM/10% FBS x 10 6 hücre. Hücreler ve sonraki 24 saat boyunca homojen bir tabaka oluşturur izin verin.
  2. Buz üzerinde mutajenize Chlamydia stok solüsyonu çözülme. DMEM/10% FBS seyreltme başına 200 ul toplam hacim içinde 6 x 10 kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve buz üzerinde ayarlayın.
    Not: dahil oluşturan birimlerde Bakteriyel titresi (IFU) plak oluşturan birim bir iyi bir tahmin (pfu) 'dir. Plak 10, 100 Amaç ve 1000 pfu.
  3. Oyuk başına 3 ml PBS ile iki kez Vero hücreleri yıkayın.
  4. 6-delikli plakalardaki ve iki kopya halinde bakteriyel seyreltmelerinden 100 ul için her bir oyuğa 3 ml DMEM ekleyin. Swirl bile karışım sağlamak için plaka.
  5. 15 C'de 30 dakika boyunca 2700 x g'de enfekte plakaları Spin ° C'de daha sonra bir nemlendirilmiş 37 ° C'de inkübe edilir,1-2 saat% 5 CO 2 inkübatör.
  6. 0.54% DMEM agaroz (6 kuyu için) hazırlayın:
    1. 18.9 ml soğuk 2x DMEM, 4.2 ml FBS, 0.42 ml 100x NEAA, 0.042 ml 200 ug / ml cyclohexamide, 0.021 ml gentamisin 50mg/ml: Aşağıdaki maddeleri ekleyin. İyice karıştırın.
    2. Kümeleri önlemek için karıştırarak, sıcak steril% 1.2 agaroz / H 2 O 18.9 ml karıştırın. Karışım dokunmak sıcak olmalıdır. Enfekte hücreler ilave edilmeden önce 55 ° C'de bir sıcak su banyosunda tutun.
  7. Yemekleri bakteriyel süspansiyon aspire ve 6 ml 0.54% agaroz / DMEM başına iyi geçerlidir. Agaroz 15 dakika kaput dışında oda sıcaklığında tamamen katılaşmaya izin verin. Kapaklar 15 dakika için biyo-güvenlik kaputu, kaldırılmış olan plakalar kurutun.
    Not: biyolojik çevreleme Kukuletadan Titreşim sertleĢtirme agaroz bozabilir.
  8. 7-10 gün boyunca CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe edin. Plaklar bir mikroskop yardımı ile görünür olmalıdır. (Replaklar tipik bir görüntü için Şekil 3 fer).
  9. Önce izole mutant bir gün önce, tohum, 1 x 10 100 ul içinde kuyu başına 96 oyuklu bir plaka içinde 4 Vero hücreleri. Hücreler 24 saat içinde birleşik olacaktır.
  10. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak işaretleyiniz plaklar alınmayı. Steril bir 1.0 ml bariyer pipet kullanarak plakların fişleri toplayın.
  11. 100 ul DMEM içinde süspanse plaklar,% 10 FBS, 400 ng / ml 'cyclohexamide, 50 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş.
  12. Mutant suşlar genişletmek için, Vero hücrelerinin konfluent mono tabakaları üzerine süspansiyon kaplaması. 30 dakika için 2,700 xg, 15 ° C'de plakaları Spin.
  13. Nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin. 48 hpi gibi erken ve 14 gün kadar geç ortaya çıkabilir hücrelerin>% 50 bulaşmış hasat EBS,. Enfekte olmuş hücreleri Bu miktar, canlı bakteri depolanmasını sağlar. Mutant suşlar büyüme oranları ve enfeksiyon farklıdır. Natura büyüyen suşları yavaş izin veryeterli hücre enfekte kadar Lly komşu hücreleri yeniden enfekte.
  14. Enfekte hücrelerin hipotonik lizis ile EBS Özü:
    1. Tamamen orta aspire.
    2. Steril su 160 ul ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Tam parçalama sağlamak için birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve hücreleri bozabilir, çapraz bulaşmayı önlemek için bariyer ipuçlarını kullanın.
    4. Mikrofüj tüplerine lizatları 160 ul aktarın.
    5. 5x SPG 40 ul karıştırın. -80 ° C de saklayınız
  15. Ilgi fenotip (ler) için Testi ve ekran mutantlar.

3. Seçilen Chlamydia Mutants Genom Dizileme

  1. Ev sahibi DNA kirlenmesine büyük ölçüde ücretsiz degrade-saflaştırılmış EBS, genomik DNA ayıklayın. EBS, Chlamydia ve saflaştırılması büyük ölçekli kültür protokolleri ref bulunabilir. (17). Ext ticari genomik DNA arıtma kitleri (örneğin Qiagen kat. 69.504) kullanınüretici yönergeleri izleyerek 2 x 10 9 bakteri DNA ract.
  2. Doğru DNA miktarını ölçmek için bir flüorometre (Qubit, Invitrogen kedi. Q32866) kullanın. Arıtılmış DNA 1-5 ug Illumina sekanslama platformu için gereklidir.
    Not: Birkaç platformlar Illumina/Solexa- ve katı bazlı sistemler de dahil olmak üzere bakteriyel genom sekansı, için kullanılabilir. Biz kısa yüksek yoğunluklu üretir gibi HiSeq (Illumina) kullanmayı seçti, ama kaliteli sıralama okur. Bu IonTorrent (Life Technologies) ve MySeq (Illumina) gibi daha küçük ölçekli genom sequencer, çok uygun ve yeterli genom montaj için 25X en az kapsama aşan bir zamanda, 4 Chlamydia genom kadar bu quencing çoğullama için fazlasıyla yeterli. Illumina platformu için DNA sekanslama kütüphanelerinin hazırlanması aşağıda tarif edilmiştir.
  3. Içinde S220 bir Adaptif Odaklı Akustik kullanarak uygun boyuta parçası DNA (Illumina dizi için 300-400 baz çifti)üreticinin önerilen ayarlarına göre (Covaris) hususta. Not: Örnek aerosol nedeniyle örnek daha fazla kaybına nebülizasyon sonuçları DNA parçalanması.
  4. Üreticinin yönergeleri izleyerek, ticari inşaat kitleri (Illumina FC-102-1001) kullanılarak genomik sıralama kütüphaneleri hazırlayın. Kütüphaneler çok örnekleri toplanmış ve aynı anda sıralı olabilir böyle barkodlu primer (Illumina FC-121-1003) kullanılarak endeksli olabilir.
  5. Örnekleri sıralama çalıştırın. Bu adım, genellikle ticari hizmetleri veya özel teknik personel tarafından işletilen çekirdek tesisleri tarafından gerçekleştirilir. Kendi prosedürleri ve önerileri uygulayın.
  6. Illumina okuma (fastq formatında) da SNP / mutasyon tanımlanması için kullanılabilecek, bu (Biomatters) Geneious olarak, kullanıcı dostu grafik kullanıcı arayüzü yazılımı kullanarak bir referans genom için monte edilebilir. Haritayı mutasyonlar için, en az varyant frekans ve minimum kapsama alanı için 50X için% 90 parametrelerini ayarlamak. Açık sourcBu tür MTÖ'nin (18) ve İKD'nin (19), e genom birleştiriciler, aynı zamanda kullanılabilir.
  7. Sanger sekanslama yoluyla mutasyonlar tekrarlayın: Sanger sekanslama ile arıtılmış veya (1:20) kullanılarak PCR ürünler, seyreltilerek tanımlanan mutasyonlar ve dizi komşu 300-500 bp'lik bölgelerin PCR amplifikasyonu için şablon olarak genomik DNA testi.

4. Chlamydia rekombinantlar üretimi

Not: Chlamydia enfeksiyonu sırasında DNA alışverişi yapabilir, bu rekombinant soylarının üretimi (12, 13, 20) izin verir. Sonra iki eşsiz antibiyotik dirençli suşlar, rekombinant "soy" ile hücre ko-enfeksiyonu (12, 13), çift antibiyotik direnç için seçilebilir. Biz mutasyonlar ayırmak ve ortak izogenik suşları oluşturmak için bu olay yararlandı. Bu nedenle, mutant suşlar (CTL0567 (rpoB) örneğin rifampisin direnci (rif R) H471Y) antibiyotik dirençli arka planda oluşturulan onlar vahşi bir suşu bearin için geçti olabilir böylega farklı antibiyotik dirençli alel (örneğin spectinomycin direnci (spc R), r01/r02 içinde G1197A (16SRNA 1 ve 2 kopya)). Chlamydia DNA alışverişi ve rekombinasyon ile ilgili ayrıntılı bilgi için, referanslar (12, 13) bakınız.

  1. 24 kuyulu bir levha üzerinde büyütülen Vero hücreleri konfluent tek tabaka üzerine her suşundan centrifuging6 x 10 5 bakteriler tarafından vahşi tip ve mutant klonal Co-enfekte. Buna paralel olarak, tek başına her bir suş ile tek katmanlarını enfekte.
  2. 44 de hpi, enfekte hücrelerin hipotonik lizis ile hasat EBS:
    1. Tamamen orta aspire.
    2. Steril su, 0.4 ml eklenir ve 10 dakika boyunca bekletilir.
    3. Güçlü en az 10 kez aşağı yukarı pipetleme hücreleri lyse. Transfer mikrofuge'de tüp lizatları.
    4. 1x SPG arasında son bir konsantrasyon için 5x SPG 0.1 ml olarak karıştırın.
    5. Ham lizatları hemen kullanılabilir veya -80 saklanabilir ° C
  3. Ham EB Plaketi 50 ul bir Hazırlık sınıflarıd 5 agaroz / DMEM x 01:10 seri seyreltme rekombinantlar seçmek için uygun antibiyotik ile desteklenmiş. (Rekombinantlar seçimi için tipik bir antibiyotik konsantrasyonları için tabloya bakınız.)
  4. Plak arındırmak ve yukarıda rekombinant suşlar zenginleştirmek. İstenen fenotip varlığı ya da yokluğu için puan rekombinantlar. Mutasyonların varlığı veya yokluğu için genotipleme amacıyla DNAzol tedavisinde (bir sonraki bölüm) ile rekombinant DNA suşu çıkarın.
  5. Haçlar daha mutasyonlar ayırmak ve izogenik suşları oluşturmak için diğer antibiyotik direnç işaretleri taşıyan suşları ile tekrar edilebilir. Farklı bir antibiyotik işaretleyici taşıyan başka vahşi bir suşu için seçilen rekombinantlar Co-enfekte.

Tablo 1: rekombinantlar seçilmesi için antibiyotik konsantrasyonları:

Final Konsantrasyon Hazırlık talimatları
200 ng / ml 'rifampisin 25 mg / dimetil sülfoksit (DMSO) içinde depolama ml stok yapmak. H 2 O ile depolama stok seyreltilmesi ile 200 mg / ml çalışma çözüm Makyaj Karanlıkta -20 ° C'de saklayın.
200 mg / ml trimetoprim DMSO içinde 100 mg / ml 'lik stok olun. -20 ° C'de saklayın
200 ug / ml spektinomisin 100 ul hacimde su içinde bir 100 mg / ml 'lik stok olun. -20 ° C'de saklayın Tekrarlanan donma çözülme kaçının.

5. Genotipleme için rekombinant soylarından genomik DNA ekstraksiyonu

Not: Kolon tabanlı arıtma kitleri de kullanılabilir. DNAzol tedavi ile DNA izolasyonu bir avantajı maliyetidir.

  1. 12 oyuklu plakalar üzerinde büyütülen Vero hücrelerinin tek katmanlarını üzerine, 1.2 x 10 5 klamidyalar Infect.
  2. 36-48 hpi de, orta aspire ve DNAzol (Invitrogen 10.503-027) içinde 0.375 ml ekleyin. Yavaşça hücreleri ve pipet lysa ajitasyon1.5 ml mikrofüj tüpüne TES.
  3. % 100 etanol içinde 0,188 ml ilave edilerek çökelti DNA. Tersine çevirerek karıştırın.
  4. Bir pipet ile biriktirme DNA ayıklamak ve temiz bir tüp yerleştirin. Alternatif olarak, pelet, oda sıcaklığında 2 dakika ya da 4 ° C arasında ve süzün süpernatant boyunca en yüksek hızda santrifüj ile DNA.
  5. Yıkama DNA% 75 etanol içinde 1.0 ml 'si ile iki kez hızlandırabilir.
  6. 15 saniye için etanol kaldırılmasından sonra açık havada kurumaya DNA.
  7. 0.2 ml 8 mM NaOH'tır daha sonra 0.1 M HEPES, 20.2 ul ile pH 8.0 'a nötralize ile DNA çözünürleştirilir. Su ya da TE 0.5 ml 'lik bir son hacme kadar getir. Alternatif olarak, TE tampon tekrar süspansiyon DNA (DNA pelet tamamen çözünür olmayacaktır.).
  8. Tanımlanan mutasyonlar yan 300-500 bp bölgelerin PCR amplifikasyonu için şablon olarak DNAzol-edilen DNA kullanın. Dizi arıtılmış veya Sanger sekanslama ile (1:20) kullanılarak PCR ürünleri seyreltilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutajene maruz kalma bakteriyel hücre ölümü nedeniyle muhtemelen, bakteri yoksun görünür inklüzyonlar yol açar. Tipik olarak, serovar LGV-L2 tamamen enfeksiyondan 48 saat içinde enfekte hücreleri lize, ancak mutajen ile muamele> 90 saat için bu döngü uzatabilir. Kapanım yaklaşık% 10 kurtarmak bekleniyor. Deneylerde, enfekte edilen Vero hücrelerinde tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında bulaşıcı döl kurtarma% 99 azalmaya neden 20 mg / ml EMS ile muamele edildi. Mutajen tedavisi de küçük plaklar (SPQ)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu genotipleri ve fenotipleri arasında bağlantı kurar gibi bu yöntem genetik analiz için temel gereksinimlerini karşılar. Önemli olarak, bu rekombinant DNA dönüşümü ve sık olmayan modeli mikroplar gen fonksiyonu analizinde bir oran-sınırlayıcı bir adımdır bakteri genleri girmeyle inaktivasyonu için geleneksel moleküler araçlar yardımı olmaksızın elde edilir.

Kritik bir adım plak-saf mutantlar klonalitesi sağlamaktır. Vahşi tip veya "tesisatçı" mutantlar ile çapraz kontaminasyon hız...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ifşa hiçbir şey yok.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)Yaşam Teknolojileri11995-073
Fetal Sığır Serumu (FBS)Cellgro35-010-CV
Etil metansülfonat (EMS) SigmaM0880
SikloheksamitSigmaC4859-1ML
Gentamisin Yaşam Teknolojileri15750-060
Fosfat tamponlu salin (PBS)Yaşam Teknolojileri14190-144
0.493 mM MgCl2 ve 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)Life Technologies14040-133
1 M NaOH
5x SPG tamponu (1.25 M sükroz, 50 mM sodyum fosfat, 25 mM glutamik asit)
SPG tamponu (0.25 M sükroz, 10 mM sodyum fosfat, 5 mM glutamik asit)
Su (steril, doku kültürü derecesi)
2x DMEM (tozdan hazırlanmış, 7.4 g/L Sodyum BikarbonatSigmaD7777
Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) Yaşam Teknolojileri11140-050
%1.2 GTG Agaroz, otoklavlanmışLonzo50070
Genomik DNA saflaştırma kitleriQiagen69504
DNAzolYaşam Teknolojileri10503-027
Etanol (moleküler biyoloji sınıfı)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES (4- (2-hidroksietil) -1- piperazineetansülfonik asit) tamponu
25 cm2 doku kültürü şişeleri (T25 şişeleri)
6 oyuklu doku kültürü plakaları
12 oyuklu doku kültürü plakaları
96 oyuklu doku kültürü plakaları
Kimyasal güvenlik başlığı
Biyolojik güvenlik başlığı
> Doku plakalarını eğirmek için santrifüj ve adaptörler
>Diseksiyon mikroskobu
Florometre (Qubit)InvitrogenQ32866
Uyarlanabilir Odaklanmış Akustik S220 enstrümanıCovaris
ile tamponlanmış)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
  2. Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
  3. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
  4. Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
  5. Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
  6. Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
  7. Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
  8. Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011(2011).
  9. Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097(2012).
  10. Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
  11. Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
  12. DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
  13. Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
  14. Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  15. Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
  16. Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
  17. Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11(2005).
  18. Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
  19. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  20. Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
  21. Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
  22. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kimyasal MutajenezT m Genom DizilemeGenotip Fenotip li kisiRekombinant Su larPlak AnaliziEMS MutajeneziVero H creleriHipotonik Lizisleri Genetik Tarama

İlgili makaleler