Biz kimyasal mutagenez ve tüm genom dizileme dayalı Chlamydia genetik analiz gerçekleştirmek için bir metodoloji tarif. Buna ek olarak, enfekte olmuş hücrelerde DNA'nın değişimi için bir sistem genetik haritalama için kullanılabilir olduğu tarif edilmektedir. Bu yöntem dönüşüm sistemleri ve moleküler genetik araçları eksik mikrobiyal sistemlerine geniş uygulanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Chlamydia trachomatis, cinsel yolla bulaşan hastalıklar ve göz enfeksiyonlarının etiyolojik ajan, rekombinant DNA ile kötü nedeniyle deneysel dönüşümü olan inatçılık için karakterize kalır. Biz C. genetik analiz gerçekleştirmek için bir yaklaşım geliştirdi moleküler genetik araçları olmamasına rağmen trachomatis. Bizim yöntemi içerir: i) hızla farklı fenotipleri ile genetik olarak tanımlanmış mutantlar kapsamlı kütüphaneleri oluşturmak için kimyasal mutagenez ii) tam genom dizileme (WGS) altta yatan genetik lezyonlar eşleştirmek için ve mutasyona uğramış gen (ler) arasındaki ilişkiyi bulmak için ve.. yaygın bir fenotip;. mutant ve yabani tip bakteri, memeli hücrelerinin ko-enfeksiyon yoluyla rekombinant suş iii) üretimi. Buna göre, genotipler ve fenotip arasındaki nedensel ilişkileri kurmayı başardık. Kimyasal kaynaklı gen varyasyonu ve WGS bir bağlantı karşılıklı genotip-fenotip ilişkilerini site kurmakld genetik analiz etmek, inatçı tıbbi ve çevre önemli mikroorganizmaların büyük listesine geniş uygulanabilir.
Giriş
Ilişkili olan ABD'de yılda yaklaşık 2.8 milyon genital sistem enfeksiyonları (Hastalık Kontrol Merkezi) sekel gibi pelvik inflamatuar hastalık, ektopik gebelik ve infertilite (1) olarak için zorunlu hücre içi bakteri Chlamydia trachomatis hesapları. Chlamydia spp benzersiz var bulaşıcı ama olmayan kopyalayan temel vücut (EB) ve bulaşıcı olmayan ama replikatif ağsı vücut (RB): iki şekilde oluşan bifazik gelişim döngüsü ile fizyolojisi. Enfeksiyon endoctyotosis (2) takip epitel hücrelerine EBS eki ile başlar. Bir membran-bağlı vakuol bir dahil olarak adlandırılan içinde, EBS sonra ikili fisyon tarafından çoğaltır RB formu, içine ayırt. Orta döngüs....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kimyasal Mutajenez
Not: Biz replikatif RB formu EB formu daha kimyasal mutagenez için daha uygun olduğunu buldu. Orta döngüsü (hpi 18 ile 20 arasındadır arasında), RBS önce RB-EB geçiş için en büyük numaraları altındadır. Chlamydia trachomatis, zorunlu hücre içi patojen olduğu için, ana sağlık mutajen etkileri bakteriyel kurtarma sınırlayabilir. Vero hücreleri, test edilen diğer hücre hatları EMS daha yüksek düzeyde yan etkilerine daha dayanıklı olduğu bulunmuştur.
Rekombinasyon yoluyla mutasyonlar ayrılması antibiyotik dirençli rekombinant soyu için seçimi gereklidir. Biz rekombinant analiz ve izoge....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mutajene maruz kalma bakteriyel hücre ölümü nedeniyle muhtemelen, bakteri yoksun görünür inklüzyonlar yol açar. Tipik olarak, serovar LGV-L2 tamamen enfeksiyondan 48 saat içinde enfekte hücreleri lize, ancak mutajen ile muamele> 90 saat için bu döngü uzatabilir. Kapanım yaklaşık% 10 kurtarmak bekleniyor. Deneylerde, enfekte edilen Vero hücrelerinde tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında bulaşıcı döl kurtarma% 99 azalmaya neden 20 mg / ml EMS ile muamele edildi. Mutajen tedavisi de küçük plaklar (SPQ)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu genotipleri ve fenotipleri arasında bağlantı kurar gibi bu yöntem genetik analiz için temel gereksinimlerini karşılar. Önemli olarak, bu rekombinant DNA dönüşümü ve sık olmayan modeli mikroplar gen fonksiyonu analizinde bir oran-sınırlayıcı bir adımdır bakteri genleri girmeyle inaktivasyonu için geleneksel moleküler araçlar yardımı olmaksızın elde edilir.
Kritik bir adım plak-saf mutantlar klonalitesi sağlamaktır. Vahşi tip veya "tesisatçı" mutantlar ile çapraz kontaminasyon hız.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ifşa hiçbir şey yok.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM) | Yaşam Teknolojileri | 11995-073 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Etil metansülfonat (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Sikloheksamit | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamisin | Yaşam Teknolojileri | 15750-060 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Yaşam Teknolojileri | 14190-144 | |
| 0.493 mM MgCl2 ve 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x SPG tamponu (1.25 M sükroz, 50 mM sodyum fosfat, 25 mM glutamik asit) | |||
| SPG tamponu (0.25 M sükroz, 10 mM sodyum fosfat, 5 mM glutamik asit) | |||
| Su (steril, doku kültürü derecesi) | |||
| 2x DMEM (tozdan hazırlanmış, 7.4 g/L Sodyum Bikarbonat | Sigma | D7777 | |
| Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) | Yaşam Teknolojileri | 11140-050 | |
| %1.2 GTG Agaroz, otoklavlanmış | Lonzo | 50070 | |
| Genomik DNA saflaştırma kitleri | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Yaşam Teknolojileri | 10503-027 | |
| Etanol (moleküler biyoloji sınıfı) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0.1 M HEPES (4- (2-hidroksietil) -1- piperazineetansülfonik asit) tamponu | |||
| 25 cm2 doku kültürü şişeleri (T25 şişeleri) | |||
| 6 oyuklu doku kültürü plakaları | |||
| 12 oyuklu doku kültürü plakaları | |||
| 96 oyuklu doku kültürü plakaları | |||
| Kimyasal güvenlik başlığı | |||
| Biyolojik güvenlik başlığı | |||
| > Doku plakalarını eğirmek için santrifüj ve adaptörler | |||
| >Diseksiyon mikroskobu | |||
| Florometre (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Uyarlanabilir Odaklanmış Akustik S220 enstrümanı | Covaris |
Kaynaklar
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
