Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

37.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50646

⸱

8 Ekim 2013

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

Bu makalede

Özet

Insan gönüllülerin yüzeysel sıyrık biyopsi yoluyla elde edilen nazal epitel hücreleri, doku kültürü ekler üzerine genişletilmiş ve aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, kirpikli olmayan silli hücre kültürleri, sonuçta hava sıvı arayüzü yetiştirilir. Farklılaşmış nazal epitel hücre kültürleri solunum mukozasını eğitim için uygun deneysel modeller sunar.

Özet

Kullanılarak in vitro modellerde insan primer epitel hücre mikrobik enfeksiyonların veya teneffüs maddeleri bağlamında, solunum epitel önemli işlevleri anlaşılması çok önemlidir. Hastalıklı toplumlardan elde edilen hücrelerin doğrudan karşılaştırmalar bize farklı fenotipleri karakterize ve epitel hücre fonksiyon değişiklikleri arabuluculuk yatan mekanizmaları incelemek için izin verir. İnsan trakeobronşiyal bölgedeki epitel hücreleri kültür iyi belgelenmiş oldu, ama bronş fırçalar biyopsilerin ile bağlantılı insan akciğer dokusu veya invaziv kullanılabilirliği ile sınırlıdır. Burun epitel hücreleri çok daha az invazif yüzeysel sıyrık burun biyopsiler sayesinde elde edilir ve konular hiçbir önemli yan etkileri ile birden çok kez biyopsi alınabilir. Ayrıca, burun, solunum sistemine giriş noktası olduğunu ve bu nedenle bu tür mikrobik ajanlar gibi hava kaynaklı stres her türlü maruz ilk sitelerden biri, Kirleticiler, ya da allerjenler.

Kısaca, insan gönüllülerden elde burun epitelyum hücreleri kaplanmış doku kültür levhaları üzerinde genişletilmiş ve daha sonra, hücre kültürü ekler üzerine aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, daha fazla fizyolojik olarak uygun koşullar oluşturur birkaç hafta, için, hava-sıvı arayüzü (ALI) 'de kültürlenmiştir olmaya devam etmektedir. ALI kültür kalıntıları üreten kirpikli ve mukus hem de hücreler ile insan burun epitelyumuna benzer bir morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini sergileyen bir farklı epiteline gelen tanımlı medya kullanır. Farklılaşmış burun epitel hücreleri ile doku kültür ekleri araştırma soruları (farmakolojik maddeler ile tedavi, lentiviral vektörler, gazlara maruz kalma veya mikrobiyal maddeler ile enfeksiyon ile transdüksiyon) bağlı olarak çeşitli yollarla manipüle edilebileceğini ve değişen sayıda farklı noktalar için analiz edilebilir hücresel ve moleküler yolları, fonksiyonel changes, morfoloji, vb

Farklılaştırılmış insan nazal epitel hücrelerinin in vitro modellerinde büyük ölçüde in vivo burun epiteli taklit olduğunu organotipik deneysel modelleri kullanılarak yeni ve önemli araştırma soruları için müfettişler sağlayacaktır.

Giriş

Tekniğin gol

Solunum yollarındaki epitel hücreleri (EC) doğrudan bu patojenlerin, alerjenlerin veya hava kirleticileri olarak inhale çevresel stres, maruz kalınabilecek ilk siteler arasında yer alıyor. EC yapısal bir bariyer daha vardır: Bu çözünür aracıların 4-6 ve 7-9 Surfac ligandlar / reseptörlerinin ekspresyonunun serbest bırakılması yoluyla, solunum bağışıklık tepkisini başlatmak 1-3 ve düzenleyen bir santral olarak hareket ederler. Ölümsüz hücre çizgileri, in vitro olarak solunum ECS incelemek için model olarak kullanılabilir olsa da, in vivo olarak gözlemlenen ile benzer polarize kirpikli ve mukus üreten hücrelerin, oluşan heterojen hücre popülasyonu içine ayırt başarısız. In vivo olarak gözlenen, solunum epitel önemli özelliklerini özetlemek için, primer hava yolu EC kullanılabilir. Bu nedenle hedefimiz, burun ECS (UEM) kullanan bizim yöntemini optimize etmek olduğunu, insan gönüllülerden elde. NECs in vivo görülen burun epitelinin özellikleri birçok farklı temasa geçiniz taklit eden bir hücre kültürü modeli elde edilmiştir, in vitro olarak genişletilmiş ve kültürlenir.

Gerekçe

In vivo durumda taklit eden insan primer EC'ler ile in vitro modellerinin kullanımı - Bu çalışmada tarif edildiği gibi -, hastalık EC'ler belirli farklılıklar, solunum yolu epitel ile bağlantılı fizyolojik parametreleri ya da EC'ler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimi incelemek için benzersiz olanaklar sunar , dendritik hücre 10 gibi, doğal katil hücreler, 11 ya da makrofajlar. Çeşitli yöntemler mevcut Bronkoskopi esnasında fırça biyopsi yoluyla elde edilen invazif veya aksi takdirde iptal akciğer dokusundan 12-17 den edilebilir bronş ECS, kullanmaktadır. Buna ek olarak, tam olarak farklılaşmış insan solunum yolu epitel hücre kültürleri elde etmek için ticari kaynaklar MatTek, Ashland, MA, Clonetics'ten dan (EpiAirway modeli vararaştırmacılar farklı vericilerden seçebilirsiniz Lonza'dan, Basel, İsviçre, Epithelix Sars gelen MucilAir, Cenevre İsviçre), dan. Bununla birlikte, sınırlı bir ticari olarak temin edilebilir epitel hücreleri veya parametrelerin öngörülmüş sınırlı havuzunun, ticari olarak primer insan solunum yolu ECS elde etmekle bağlantılı maliyet ve atılır akciğer dokusu ya da yeni elde edilen insan bronşiyal, biyopsi yapılan doku için sınırlı erişim, birçok araştırmacı yasaklamak tamamen farklılaşmış insan hava yolu EC'lere çalışmalar yapmasına. Bu nedenle, 1), non-invaziv elde edilen insan NECs kullanmak 2) farklılaştırılmış insan epitel kültürleri veren bir protokol sağlar, ve 3) varolan doku kültürü altyapısı ile en laboratuvar ortamlarında tekrarlanabilir olacak bir teknik geliştirmek için yola çıktı.

Mevcut Teknikleri / Modeller üzerinde Avantajları

Taze NECs elde edilmesi, bronşiyal veya küçük solunum yolu EC ile karşılaştırıldığında, çok daha az invaziv bir bireydirs hiçbir önemli yan etkileri ile birden çok kez biyopsi alınabilir ve yüzeysel sıyrık burun biyopsi aksi araştırma ile ilgili bronkoskopilerin hak olmaz hastalıklı toplumlarda yapılabilir. NECs elde noninvaziv yüzeysel sıyrık biyopsileri araştırmacı başarılı olmak için araştırma amacına uygun vb yaş, cinsiyet, hastalık durumu da dahil olmak üzere, donör spesifikasyonuna a priori olarak ayarlamanızı sağlar. Araştırma çalışmaları tasarlarken Böylece, araştırmacılar, ticari satıcıları, ya da tasarım invaziv bronkoskopi çalışmalardan pahalı farklılaşmış hücre kültürü modelleri satın almak, klinik olarak mevcut dokuların / epitel örnek ile sınırlı değildir. Buna ek olarak, NECs elde etmek için kolaylıkla gözlenen bulgular istatistiksel doğrulama artırır, farklı vericilerden temin edilmiş hücrelerde deneyler yeteneğini arttırır. Son olarak, burun hava kaynaklı stres herhangi bir maruz ilk sitelerinden biridir. Bu nedenle, in organotipik üretilmesiBurun epitel taklit eden in vitro kültür sistemleri kolayca bu hücre kültür sistemi kullanılarak elde edilebilir viral parçacıklar, kirleticiler, alerjen veya gazlardan oluşan teneffüs çalışmaları için yararlıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1.. Plastik Ware hazırlayın: Coat Plakalı

  1. , 12 oyuklu plakanın her oyuğuna 500 ul PureCol (1:100, steril su ile seyreltilmiş) ilave edin.
  2. 30 dakika için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe edilir, PureCol çıkarın ve hücreleri plakaya ilave önce HBSS sağ ile yıkayın (aşağıdaki adım 3.1).

2. Alınması ve İnsan temasa geçiniz ön-muamelesi Biyopsi

  1. Burun kazıma biyopsi
    1. Spekulum ile bir işletim otoskop üzerinde 9 mm yeniden polipropilen nazal spekulum (Model 22009) üzerinden direkt görüş altında burun turbinat astar yüzeysel ECS (Model 21700) edinin. Bu cihaz, burun kıvrımlarının ve hareket esneklik uygun görselleştirme sağlar.
    2. Kafa biraz geriye doğru eğik veya muayene masasına sırtüstü pozisyonda yatarken düz bir destekli bir sandalyede dik oturmuş konu ile biyopsi.
    3. Burun deliğine otoskop spekulum ve alt turbi takınNate aydınlatma ile görüntülendi.
    4. Konkanın arka genişletilmiş distal ucu ile spekulum ile steril bir termoplastik küret yerleştirin.
    5. Konka alt yüzeyinde hafif basınç kullanarak, küret mukoza yüzey 5x arasında çizilen ve geri çekilir. Kılcal hareket ile tutulan mukoza hücrelerinin başarılı bir alma küretin fincan belirgin olacaktır.
  2. RPMI 1640, 8 ml buz üzerinde taşınmasını içeren bir 15 ml konik bir tüp içinde numunesi yerleştirin.
  3. , Prob almak P-1000 pipet ile gergedan probu dokuyu çıkarmak, sonda atmak için forseps kullanın
  4. Santrifüj, aspire süpernatant (dikkat: pelet aspire dikkat) (4 ° C, 400 xg, 5 dk) pelet için.
  5. 100x DNase 1 10 ul 1 ml begm pelet tekrar.
  6. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. Santrifüj (4 ° C, 400 xg, 5 dk), süpernatant aspire etmeyin!

3. SPlastik üzerine eed Hücreler (Gün 0)

  1. Plakadan PureCol çıkarın ve HBSS ile yıkayın (adım 1.2 'de bakınız).
  2. (Medya bir menisküs kuyunun merkezinde görünene kadar, 80-100 ul) kaplanmış plakanın (biyopsi boyutuna bağlı olarak) 1-4 kuyulara begm + + ortamının en az bir hacim.
  3. Dikkatli bir şekilde çok fazla ortam aspire olmadan tüpten biyopsi doku pelet kaldırmak için bir P-1000 pipet kullanın.
  4. , Kuyuların ortasına pelet aktarın hücrelerin bir küme olarak birlikte biyopsi tutmak ve tek bir hücre süspansiyonu yapmak kadar bozmazlar. Seribaşı olabilir 4 kuyulara kadar iyi bir biyopsi verimleri. Doku kültürü kuluçka makinesine (37 ° C,% 5 CO2,>% 90 nispi nem) içine plaka koyun.
  5. (Menisküs bozmadan) yeterli ortam var olduğundan emin olmak için iki saat sonra kontrol edin.
  6. Gün1, 24 saat post-tohumlama: tüm oyuklara her yıkanarak yapışmayan hücreler (eğimli plaka toplanması ve bir P-1000, c hücreleri ile ortam toplamaBir 1.5 ml santrifüj tüpüne ollect tüm kaynaklar).
  7. Santrifüj (4 ° C, 400 xg, 5 dk).
  8. Hücre süspansiyonu santrifüje tabi da: 0. günde ekildi hücrelere begm + + ve + begm ortam karışımı, 250 ul, yaklaşık 250 ul ekleyin.
  9. Tekrar yapışkan olmayan hücreler için 3,1-3,5 adımları tekrarlayın.
  10. Gün 2-5: Günlük hücre değişim ortamı;, her bir kuyunun 500 ul medya eklemek begm + + medya aşamalı (günde 2 miktarını azaltmak ekimden sonra: 125 ul begm + + artı 375 ul begm +, tohumlama sonra gün3 ve şu günlerde: 73 ul begm + + artı 427 ul begm +).

4. Hücreler şişeler içinde genişletilmesi

  1. Günlük hücreleri izlemek, onlar aşağıdaki gibi% 80-90 confluency (uzun sürer eğer genellikle 5-7 gün biyopsi sonrası, başarıyla büyümek olmaz) kaldırma hücreleri ulaştığında:;% 0.25 tripsin 500 ul ekleyin dikkatle aspire medya hücreler müstakil kadar iyi başına (genellikle 2-3 dakika sürer) 37 ° C'de saklayın.
  2. Ihtiyacı hazırlanmasıbir 15 ml tüp içinde Soya fasulyesi tripsin inhibitörü (SBTI) (1 ml Tripsin başına 750 ul) ed hacmi.
  3. Tekrar tekrar yukarı pipetleme ve tripsin çözüm aşağı hücreleri çıkarmak; SBTI ile 15 ml konik tüp transferi müstakil hücreler.
  4. Hücrelerle boruya HBSS eklemek, toplam 1 ml HBSS ile her kuyu durulayın.
  5. , (4 ° C, 400 xg, 5 dk) pelet 1 ml begm + medya ortamı, tekrar süspansiyon aspire ve tüp vortekslemedeki santrifüj.
  6. Pelet boyutuna bağlı olarak bir T25 ya da T75 şişede hücreleri genişletmek (bu p1; yaklaşık iki birbirine kuyu bir T75 şişesi gitmek, bir birleşen iyi bir T25 için yeterli, genellikle 2 birleşen kuyuları tek T75 verim).
    1. (A T75 boyunca 5 ml her biri, bir T25 için her biri 3 mi) şişelere begm + ekleyin.
    2. Şişelere hücre süspansiyonu ekleyin. Bir doku kültür inkübatörü içine şişeler aktarın.
  7. 24 saat post-şişe-tohumlama: şişeye (a T25 3 mi, bir T75 10 mi) ilave begm + ortam ekleyin.
  8. şişelerinde hücreleri korumak: media (köşeden aspiratını) çıkarın ve begm + medya (5 ml/T25, 20 ml/T75) ekleyin. Ortam, her 2-3 günde bir değiştirilmesi gerekir. Onlar yaklaşık% 80 birleşmeye kadar şişede hücreleri korumak (; normalde bu 7-10 gün arasında sürer; konfluensisinin hatta tüm şişesi boyunca olmayabilir onlar 10 gün sonra birleştirilebilmeli değilse onlar başarıyla büyümek olmayacak).

5. Doku Kültürü Ekler üzerinde Hücreleri tohum

  1. Şişeden Ortamı çıkarın ve tripsin (T25 için 3 mi, T75 şişesi için 4 ml) ekleyin.
  2. Hücreler müstakil kadar 37 ° C'de inkübe edin (yaklaşık 2-3 dakika).
  3. SBTI (1 mi Tripsin başına 750 ul> T25, T75 için 3 ml 2.25 ml) bir 15 ml tüp içinde hazırlayın.
  4. Aşağı şişeyi bantlama ve yukarı pipetleme hücreleri çıkarmak ve SBTI ile konik tüp transferi.
  5. 15 ml tüp HBSS eklemek, HBSS (T25, T75 boyunca 2 ml için 1 mi) ile şişe durulayın.
  6. Santrifüj(4 ° C, 400 x g, 5 dk) topak haline dikkatlice süpernatant kaldırmak.
  7. Tabak hazırlayın: seribaşı olacak kaç tabak karar, örnek kod ve numarası, geçiş sayısı (yani p2) ve tarih ile plakaları etiket. Bazal odasına 700 ul begm + ortam ekleyin.
  8. Tüp vorteks 1 mi begm ALI ortamı içinde hücre pelletini.
  9. Bir hemositometreyle ile hücrelerin sayısı (bir T25 genellikle yaklaşık 4 milyon hücrelerini üretir, T75 adacık bağlı kadar 20 milyon hücre olabilir; tek 12 plaka için hücrelerin 1-2000000 kullanın) ile hücre süspansiyonu sulandırmak (plaka başına 2.5 ml ortam içinde 1.2 x 10 6 hücre) tohumlandı gereken plakaların miktarı için gerekli olan toplam hacme begm ALI ortamı (Not:. hücrelerin kısmı dondurulacak istiyorsunuz, tüp etiket ve hücreleri uzaklaştırmak burada: genellikle) ortam dondurma içinde 2 ml, 2 x 10 6 hücre dondurma
  10. Her kaplanmamış Corning 12well apikal hücre tarafına 200 ul hücre süspansiyonu ekleyintakın (> bu konuda 80,000-150,000 hücre / eklemek olacaktır; 0.4 mikron gözenek polyester (polietilen tereftalat (PET)) membran uç ile 12 mm transwells); doku kültürü inkübatör içine aktarın.
  11. 24 saat sonra apikal ortamı (200 ul büyüme ortamı) değiştirin.
  12. Hücre kültürleri bakımı: (begm ALI medya; 700 ul Bazolateral ve 200 ul apikal) medya değiştirin her gün. Uçlar hücreleri (tek tabaka hiçbir delik görebilir) tamamen konfluent kadar su altında muhafaza edilmesi gerekir. Bu hücreler büyük ihtimalle uygun olmayacak daha uzun sürerse, hücre sayısına bağlı olarak, bu, genellikle, 2-6 gün arasında sürer.

6. Bir kez Hücreler (transwells üzerindeki hücreler tamamen karışmış olduğu zaman) Tamamen karışmış olan Hava Sıvı Arayüzü kurmak

  1. Hücreler, 48 saat boyunca 500 nm retinoik asit ile takviye edilmiş begm ALI ortamı ile iki apikal ve bazolateral ortamı yerine tamamen konfluent kez.
  2. Retinoik asit eklendikten sonra 48 saat begm ALI ortamı desteklenmiş: PneumaCult-ALI Bakım Orta (aşağıdaki üreticinin talimatları) hazırlayın: (bazal bölümlerinde genellikle 8.5 ml tek plaka için) gerekli ortamın hacmini hesaplayın; 1 ml başına eklemek Komple Bankası Orta PneumaCult :

    10 ul PneumaCult 100x Bakım Supplement
    2 ul (2 mg / ml stok çözeltisi) Heparin
    (96 ul / ml stok çözeltisi) 5 ul hidrokortizon.

  3. Tüm ortamları çıkarın ve bazolateral tarafta yalnızca (apikal tarafında hiçbir orta) 700 ul PneumaCult-ALİ bakım medya ekleyebilirsiniz.
  4. AAH 4 hafta için hücre kültürlerinin bakımı:
    1. Medya (Çarşamba ve Cuma zamanlama bizim için iyi çalışır, Pazartesi) her gün değiştirin.
    2. ALI'de bir hafta sonra, bir hafta (Çarşamba) bir kez apikal yüzey durulanır: dikkatle aspire, inkübatör 10 dakika tutmak, apikal tarafında 200 ul HBSS eklemekHBSS (HBSS kapalı emme pipet ucunda 200 ul ipuçlarını kullanabilirsiniz, Biyolojik güvenlik kabini vakum tuzak bağlı cam pipet bir 9 kullanın).

Not: Değişim plakalar arasında ipuçları yanı sıra Bazolateral karşı apikal yüzeyinden geçerken ipuçları değişen. AAH yaklaşık 2 hafta sonra, hücreler ayırt etmek için başlangıç ​​ve kirpikler görünür. Hücre kültürleri ALI yaklaşık 4 hafta sonra tam farklılaşma ulaşır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NECs burada açıklanan protokol in vivo durumu (Şekil 1) temsil eden ve silli olmayan silli hücrelerin oluşan EC'ler bir heterojen tabaka halinde yeniden ayırt aşağıdaki kültürlenmiştir. Farklılaşmış temasa geçiniz bazıları (AB / PAS, Şekil 1B kullanarak mavi boyama hücreleri) üreten mukus vardır. Burada sunulan protokol optimize edilmiş olsa da, farklılaşma genel hücre popülasyonlarında (: mukus üreten hücreleri: silli hücrelerin değişik oranları, yani non-silli hü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Solunum EC eksojen uyaranlara 20 insan vücudu korumak değil, aynı zamanda çözünür arabulucular veya doğrudan reseptör-ligand hücre-hücre etkileşimleri sekresyon yoluyla başlatmak ve solunum bağışıklık savunma yanıtları 1-3 düzenleyen bir santral gibi hareket etmek fiziksel bir bariyer sadece sağlamak. Ayrıca, immün yanıt olarak EC'ler rolünü incelemek için hasta popülasyonlarında EC'ler arasındaki potansiyel farklılıkları incelemek için ya da EC'ler eksojen stres etkilerini incelemek iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar yardımcı girişler için Lisa Dailey teşekkür etmek istiyorum.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES013611 ve HL095163) hibe tarafından desteklenen, Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü (FAMRI) ve Çevre Koruma Ajansı (CR83346301) ve herhangi bir çıkar çatışması ilan etti. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu makalede açıklanan araştırma Çevresel Tıp, Astım ve Kuzey Carolina-Chapel Hill Üniversitesi'nde Akciğer Biyoloji Merkezi ile işbirliği anlaşması CR83346301 aracılığıyla ABD Çevre Koruma Ajansı tarafından finanse edilmiş olmasına rağmen, tabi olmamıştır Ajans en gerekli akran ve politika incelemesi ve bu nedenle mutlaka ajansın görüşlerini yansıtmamaktadır ve hiçbir resmi onay sonucuna varılamaz. Mansiyon of ticari isimler ve ticari ürünler kullanım için onay ya da tavsiye niteliğinde değildir. Loretta Müller kişisel bir hibe ile İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nazal spekulumWelch AllynModel 220099 mm, yeniden kullanılabilir polipropilen
Ameliyat otoskopuWelch AllynModel 21700
Gergedan prob hücresi küvetiArlington ScientificSY-96-092küvetin başını biraz daha bükün
12 oyuklu kültür plakalarıCorning3512
Transwell membran hücre kültürü ekleriCorning3460
Doku kültürü şişesi Corning430639 ve 430641T25 ve T75 bacalı şişe
RPMI 1640 ortamı (L-Glutamin ile)Gibco11875
Bronşiyal / Trakeal Epitel Hücre Büyüme OrtamıHücre uygulamaları511-500
BEGM Bronşiyal Epitel Hücre Büyüme OrtamıLonzaCC-3170Bu, takviyeleri olan bir şişe orta ve flakondan oluşan bir kit olarak gelir.
Sodyum Bikarbonat %7,5'lik çözeltiGibco25080olduğu gibi kullanın.
NuSerumBD Biosciences355104olduğu gibi kullanın.
BAMBANKER dondurma ortamıBAMBANKER302-14681Olduğu gibi kullanın.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(CryoPrep alkolsüz hücre dondurma kabı)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Bsteril su ile 1:100 oranında seyreltin (kabaca 0.03 mg / ml olmalıdır) 500 &mu kullanın; Ca
2 ve Mg2 + < / sup>Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25100x'lik bir çözelti olan 1.5 mg / ml'de çözün, 10 &mu ekleyin; l her ml ortama
Tripsin,% 0.25, 1x, fenol kırmızısıGibco25200-056ile Kullanım
Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü (SBTI)SigmaT65221 mg / ml konsantrasyonda HBSS'de çözünmüş kullanım
Retinoik asitSigmaR7632100 &mu yapın; M stok çözeltisi (aşağıya bakınız), 10 & mu'ya seyreltin; Mutlak alkol ile M, 5 & mu alın; l ve 1 ml BEGM ortamına ekleyin (çalışma çözümümüz).

All-trans Retinol, 325 nm'de etanolde 52.480'lik bir sönme katsayısına sahiptir. 25 mg'ı 50 ml mutlak etanol içinde çözün. Seri seyreltmelerin yapılması gerekir, 50 ml stoğu 450 ml mutlak etanol içinde seyreltin, bunun 50 ml'sini alın, 450 ml mutlak etanol içinde seyreltin, bunun 50 ml'sini alın, 450 ml mutlak etanol'de seyreltin ve tekrar bunun 50 ml'sini alın, 450 ml mutlak Etanol içinde seyreltin, bunun 100 ml'sini alın ve 900 ml mutlak etanol içinde seyreltin ve spektrofotometrede 325 nm'de okuyun, Bu sayı daha sonra onun' ile çarpılır. seyreltme faktörü, daha sonra 52.480 yok olma katsayısına bölünürse, bu mM cinsinden bir sayı verecektir. 100 mM'lik bir stok yapın (-20 ° C'de saklayın; C) ve bu stoktan 10 mM'lik bir alikot yapılır, ihtiyaç duyulan günlük retinoik asit, 995 ml ALI ortamında bu 10 mM alikotun 5 ml'si olacaktır. Örnek: 325nm okuma 1.15'tir. 1.15 x 10.000 (seyreltme faktörü) / 52.480 = 0.219 = 219 mM, bundan mutlak etanolde 100 mM'lik bir stok yapın.
DMEM yüksek glikoz (1x), sıvı, L-glutamin ve sodyum piruvat ileGibco11995
Sığır Hipofiz ÖzüGibco13028-014BEGM ALI ortamı için kullanılır.
NystatinSigmaN4014-50 mg3.3 mg / ml'lik bir çözelti oluşturun.
Sığır Serumu AlbüminFisher ScientificBP1600-100MiliQ suda 10 mg / ml çözelti çözeltisi oluşturun.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001Bu, bir şişe orta ve takviyeli şişelerden oluşan bir kit olarak gelir. Ayrıntılar için aşağıya bakın.
Hidrokortizon Kök Hücre79042.4 mg hidrokortizonu 1 ml ddH2O'da çözün (200x Hidrokortizon stok çözeltisini yapmak için kullanılır)
PBS'de Heparin Sodyum Tuzu (2 mg / ml)StemCell7980'dekullanın.
Filtre şişeleri (500 ml)Corning4310970.22 & mu; m gözenek boyutu
Filtre tüpleri (50 ml)Millipore SCGP00525Steriflip, 0.22 & mu; m gözenek boyutu
Pipet uçları - ART Bariyer UçlarıMoleküler Biyoürünler2139RI, 2069RI, 2179RI
Konik tüpler, steril, 15 ml ve 50 ml
ddH2O, mutlak etanol, buz
CO2 inkübatör
soğutmalı santrifüj
Biyolojik Güvenlik Kabini
Pipetleri (P2, P200, P1000), 9 Cam Pipetli
Eldiven
Sıkı Manşetli
<>
  • 500 ml BEGM Lonza besiyeri, bir alikot tek quot takviyesi içeren
  • hücreleri şişede tutmak
Kullanılan ortam ve çözümler: TarifKullanılanlar
Genel açıklama: ortamı her zaman oda sıcaklığına ısıtın
BEGM media
  • 500 ml BEGM Hücre Uygulaması Bir alikot retinoik asit içeren besiyeri
(yarısını karıştırın ve süzün)
< ul>
  • biyopsinin sindirimi
    • BEGM+ media
    • 50 ml BEGM media
    • hücrelerin bakımı plakalardaki plastik üzerine (pasaj0)
    • 10 μ l retinoik asit (çalışma çözeltisi)
    • şişedeki hücrelerin tohumlanması (pasaj1; kısmen)
    BEGM++ media
    • 50 ml Lonza' s BEGM ortamı takviyeli
    • plastik üzerine 12 oyuklu plakada taze hücrelerin tohumlanması
    • 1 ml Sodyum BiCarb
    • plastik üzerindeki plakalardaki hücrelerin korunması (passage0; sadece kısmen)
    • 2.5 ml NuSerum
    • şişedeki hücrelerin tohumlanması (pasaj1; kısmen)
    BEGM ALI media
    • 250 ml DMEM-H
    • Hücreleri gitmeden önce transwell üzerinde tutmak ALI
    • 250 ml BEGM takviye edici gıdalar dahil
    • 2 ml Sığır Hipofiz Ekstresi (12.5 mg/ml solüsyon)
    • 1 ml Nistatin (3.3 mg / ml çözelti)
    • 75 & mu; l BSA (10 mg / ml çözelti) < / li>< / ul> < / td > < / tr>
    < güçlü> 200X Hidrokortizon Stok Çözeltisi (96 μ L / ml çözeltisi) < / güçlü >< / td > < >< ul >< li> 200 & mu; l çözünmüş hidrokortizon
    • Şişedeki son gün için PneumaCult-ALI Komple Temel Besiyerine ek olarak ve hücreler ekler üzerindeyken
    • 4250 μ l çözünmüş sodyum klorür
    • 540 & mu; l ddH2O
    • 10 μ l mutlak etanol< / li>< / ul> < / td > < / tr>
    PneumaCult-ALI Komple Temel Ortam
    • 450 ml PneumaCult-ALI Bazal Ortam
    • Her üç PneumaCult-ALI ortamı için temel ortam
    • 50 ml PneumaCult 10x Takviye Edici Gıda
    • PneumaCult ortamı ışığa duyarlıdır, bu nedenle onu her zaman karanlıkta tutun
    PneumaCult-ALI Bakım Ortamı1 ml PneumaCult-ALI Komple Temel Besiyeri başına add:ALI culture on inserts
    • 10 μ l PneumaCult 100x Bakım Ek
    • 2 & mu; l Heparin (2 mg / ml stok çözeltisinden) < / li>< / ul>< / td > < / tr>
    < ul >
  • 5 & mu; l Hidrokortizon (96 & mu; L / ml stok çözeltisi) < / li>< / ul>< / td> < / tr> < / tbody> < / tablo>
    • <> < td > 0.22 & mu ile filtre çözeltisi; m filtresi, alikot çözeltisi ve -20 ° C'de saklayın; C, ek donma/çözülme döngülerinden kaçının < TD>(Bu, 2-8 ° C'de 2 hafta boyunca stabildir; C veya -20 ° C'de 6 aya kadar; C)
    içeren 12 oyuklu bir plakanın HBSS'sinin l/kuyusu Laboratuvar Önlüğü

    Kaynaklar

    1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
    2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
    3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
    4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
    5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
    6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
    7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
    8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
    9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
    10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. , (2010).
    11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. , (2013).
    12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
    13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89(2009).
    14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).
    15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
    16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462(1987).
    17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
    18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
    19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
    20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
    21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108(2012).
    22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
    23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
    24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. , (2012).
    25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
    26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
    27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
    28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
    29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102(2011).
    30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Daha fazla makale keşfet

    ALI KültürüHücre Kültürü İnsertleriDoku Kültürü PlakalarıNazal Kazıma BiyopsisiBEGM Plus MedyumuTranswell EkimlemeMukosiliyer DiferansiyasyonWestern Blotting
    Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi
    Bize Ulaşın
    Kütüphaneye Öner

    Gizlilik

    Kullanım Koşulları

    Politikalar

    Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.