Method Article

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem C. elegans Hücreler

DOI:

10.3791/50649

⸱

September 21st, 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücreleri elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans genetik ve moleküler teknikler kolay uygulanabilir olduğu güçlü bir model sistem vardır. Yakın zamana kadar olsa da, hücreler ve özel hücre tiplerinin izolasyonu doğrudan erişim gerektiren teknikleri, C de uygulanamadı elegans. Bu sınırlama, dokuların kolayca enzimler ve / veya deterjan ile muamele ile sindirilmeyen bir basınçlı kütikül içinde sınırlı olmasından kaynaklanıyordu. Laird Bloom, Christensen ve 1 C kültürleme için sağlam bir yöntem geliştirdi meslektaşları tarafından erken öncü çalışmalara dayanarak Büyük ölçekli embriyonik hücreleri elegans. Yumurta ağartıcı / NaOH ile işlenerek gebe yetişkin izole edilmiş ve daha sonra da yumurta kabuğu kaldırmak için çitinaz ile tedavi edilir. Embriyonik hücreler daha sonra el ile pipetleme ayrılmış ve serum zenginleştirilmiş ortam içinde alt-tabaka kaplı cam üzerine kaplanmıştır. Izolasyon hücrelerin 24 saat içinde morfolojisi değiştirerek ve hücre spesifik marke ifade ederek ayırt başlarrs. C. elegans, bu yöntem kullanılarak kültür hücreleri, in vitro olarak 2 hafta kadar hayatta kalma ve elektrofizyolojik, immünokimyasal için kullanılmıştır ve bu kriteri ve mikroarray kullanılmaktadır gibi görüntüleme de analiz eder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) hücresel fonksiyonun, farklılaşma ve davranış moleküler temellerini araştıran güçlü bir model organizmadır. Genom, metabolik ve biyosentetik yollar omurgalılar 'benzer olmakla birlikte, genetik ve moleküler tractability 2 çok daha fazladır. Avantajları arasında, onun büyüklüğü ve basit anatomi, onun hızlı yaşam döngüsü (25 ° C'de 3 gün), kısa ömürlü (2 hafta) ve yavrular çok sayıda (> 200) vardır. Nedeniyle hermaphroditic doğası ve kısa yaşam döngüsü, moleküler ve genetik manipülasyonlar C. basittir transgenik hayvanlarda 3,4 ve bu RNA girişim 5 gibi gen knock-down tekniklerin uygulanması da dahil olacak elegans. C. elegans vücut ve yumurta kabuğu şeffaf. Bu nedenle hücreleri kolayca yetişkin ve standart mikroskopi kullanılarak embriyo hem de görülebilir. Son 40 yıl içinde, C. elegans topluluk C için çok değerli bir kaynak yarattı mutantlar, tırnakları ve transgeniklerinin geniş bir koleksiyon, sinir sistemi 8 tam yeniden yapılanma dahil anatomi ve geliştirme 6,7 ayrıntılı bir açıklama, ve de açıklamalı ve bütün topluma mevcuttur tamamen sıralı genom (dahil elegans araştırma www.wormbase.com ).

Sayısız avantajlara rağmen, bazı deneysel yaklaşımlar C. zorlu olmuştur elegans. Bu dokular ya da hücre tiplerinin hücre ve tecrit plazma zarına erişim gerektiren olanları içerir. Gerçekten C. elegans dokular kolayca enzimatik muamele ya da deterjanların tarafından sindirilir değil onun basınçlı hidrostatik iskelet, içinde hapsedilir. 1990'ların sonunda Miriam Goodman ve Janet Richmond C elektrofizyolojik kayıtlar için yöntemler öncülük elegansin situ 9,10 nöronlar ve kas hücreleri. Bu yöntemler bize nöronal ve in vivo kas fonksiyonu önemli bilgiler verirken, onlar zor ve düşük verim vardır. In vivo olarak, hücre fonksiyonlarını incelemek için alternatif yöntemler çoğunlukla, özellikle bu tür GCamP ve cameleon 11-13 genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörler kullanılarak kalsiyum vivo görüntüleme, geliştirilmiştir. Onlar bozulmadan yaşayan hayvanlar üzerinde uygulanır çünkü bu olsa yöntemleri, farmakolojik araçların kullanımına izin vermez.

Kültür C'de ilk girişimi Büyük ölçekli in vitro hücre elegans doktora tezi 14 hazırlanmasında Laird Bloom tarafından yapıldı. Ne yazık ki, zorluklar substrata hücrelerin zayıf yapışması ile karşılaşılan, zayıf hücre farklılaşması ve hayatta kalma güçlü bir hücre kültür yöntemi olarak bu erken protokol kurulmasını engelledi. 1995 yılında Edgar ve arkadaşları bir prosedür yayınladıTek bir C izolasyonu ve kültürü ile hücre bölünmesini ve morfogenetiğine araştırmak. elegans 15 embriyolar. Tedavisi ve enzimatik ayrışma manuel bir kombinasyonu ile yumurta kabuğu sindirilmesi ile elde edilen embriyonik hücreler, ~ 500 hücre 15 kadar üreten, çoğalmaya devam etti. Daha sonra, Leung ve arkadaşları bağırsak morfogenetiğine çalışma blastomerlerin küçük bir sayıda kültüre. Bunlar, bir in vitro izole edilmiş E blastomere apikal adherens birleşme 16 üzerinden birbirleri ile etkileşerek intestinal lümene benzer bir yapı oluşturulur polarize bağırsak hücreleri tarafından üretilebilir olduğunu gösterdi. Buechner ve arkadaşları, kültürleme C için benzer bir yöntem rapor etmiştir. 17, in vitro olarak embriyonik hücreleri elegans.

Bu erken çalışmalara dayanarak, Christensen ve arkadaşları embriyonik C kültürleme için sağlam bir protokol geliştirmiştir. elegans vitro 1 hücreler. Onlarbu izole edilmiş C göstermiştir. elegans hücreler, çeşitli hücre tipleri farklılaşmak ve hücreye özel markörlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, in vivo olarak sahip olduğu özellikleri muhafaza edebilir. In vivo olarak zor olan çeşitli teknikler, izole edilmiş C uygulanabilir embriyonik hücreleri elegans. Bu elektrofizyolojik 1,18 19, görüntü işleme ve immünokimyasal teknikleri 20,21, hem de hücreye özgü cDNA kütüphanelerinin 22,23 inşası için (FACS) floresan aktive hücre spesifik hücre tipleri izolasyonunu içerir. Bu tür RNA girişim (RNAi) olarak Gene demonte teknikleri kültürlenmiş C uygulanabilir elegans hücreler 1 ve glikoprotein keşfi için bir araç olarak Azido-şeker kullanarak yeni bir metabolik etiketleme yöntemi, son zamanlarda in vitro kültürlenmiştir C için geliştirilmiştir elegans hücreleri, 24.

Sonuç olarak, hücre kültürü yöntemi dizi o genişletirC. uygulanabilir f teknikleri Bir canlı organizmanın bağlamında gen fonksiyonunu çözmek için bir çaba elegans modeli. Biz C kültürleme için buraya protokolü açıklamak büyük ölçüde birinci Christiansen ve arkadaşları 1 tarafından tarif edilen protokole göre in vitro olduğu, embriyonik hücreler elegans.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Christensen ve diğerleri ile karşılaştırıldığında, Yıldız (*), yeni ya da değiştirilmiş adımlarını gösterir. 1

1.. Malzeme Kur

  1. Hücre kültürü prosedür gebe yetişkin izole edilmiş yumurtaların büyük miktarda gerektirir. C'yi büyüyecek yumurtaların büyük miktarda izole etmek için bakteriler - elegans 8P agar plakaları üzerinde NA22 (CGC C. elegans Genetik Consortium kullanılabilir) ile ekildi. Bu plakalar kullanılmıştır pepton miktarı normal olarak NGM plakalar için kullanılan 8 kez miktardır. Daha yüksek pepton konsantrasyonu OP50-, kalın tabakalar halinde büyümeye ki aksine, daha verimli NA22 bakterilerin gelişimini devam ettirir.

8P plakaları tarifi:

3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 30 dakika süre ile, steril damıtılmış su ve otoklav içinde 1 L 25 g agar çözülür. 55 ° C'de orta serin ve daha sonra 1 ml 1 MgCl2 kolesterol steril olarak filtreden geçirilmiş, 1 ml EtOH (5 mg / ml), ekleme, MgSO 4 ile 1 ml KP tamponu (500 ml stok: 5 g 2 K HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6.00) 25 ml. 10 cm Petri kutularına (25 ml / plaka) sıvı agar ortam dökün.

  1. Ertesi gün NA22 E: 1 ml her bir zenginleştirilmiş pepton agar levhasının tüm yüzeyi yayılmış 2XYT ortamı (16 g tripton, 10 g maya ekstresi, steril su, pH 7.0, 1 L NaCl 5 g) 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca kültürlendi coli Bu bakteriler gravid yetişkinlerin büyük miktarlarda büyümeyi destekleyen kalın bir tabaka oluşturacak bol bir besin kaynağı oluşturmaktadır. Bakterilerin büyümesine izin vermek üzere gece boyunca oda sıcaklığında tohumlanmış plakaları bırakın. Bu süreç, 4-5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek hızlandırılabilir.
  2. Numaralı seribaşı 8P plakalarına hasret hayvanları aktarın. 5-6 M9 tampon veya ml su kullanılarak bir hasret NGM plaka hayvanları yıkayın ve her 8P plaka bu süspansiyonun 1-2 ml ekleyin.
  3. Hayvanların büyüme ve çarpma unt izinil plakaları gebe yetişkinler tarafından izdiham doldurulur.
  4. C. hazırlanması için gerekli olan yumurta izole lizis çözeltisi 5-6 ml kullanarak gebe yetişkinlerden embriyonik hücreler, elegans.

Lysis çözelti tarifi

Taze Bleach 5 mi, 10 N NaOH ve 1.25 ml steril H2O 18.5 mi Bu karışım, her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.

  1. Yumurta tampon kullanarak gebe yetişkinlerden izole yumurta yıkayın:

Yumurta tampon tarifi

118 mM NaCl, 48 mM KCI, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7.3, 340 mOsm ozmolarite.

  1. Çitinaz ile muamele edilerek yumurta çevreleyen yumurtaların çıkarın. Kitinaz asidik pH 25 ile en yüksek aktiviteye sahip bir enzimdir. 2 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda yumurta tamponu pH 6.5 içinde kitin (Sigma, katalog no. C6137) içinde çözülür. Şitinaz stok saklamaksteril 15 ml konik tüplerde 1 ml alikotlar içinde -20 ° C'de çözelti. Bu süspansiyonun tam bölenleri bir kaç ay için -20 ° C de muhafaza edilebilir.
  2. C'yi büyüyecek fıstık lektinle kaplı otoklavlanmıştır lamelleri (12 mm çap) üzerinde elegans kültür hücreleri. Steril su (0.5 mg / ml) içinde fıstık lektin çözülür. Fıstık lektin çözelti filtre otoklave olmamalıdır. Ayrıca, UV ışığı ile muamele edilmesi gerekmez. 6 aya kadar -20 ° C'de saklayın 2 ml lik bir kısmı.
  3. Tam hücre kültür ortamı (500 mi) Gibco, 50 ml cenin sığır serumu (ısı ile deaktive edilmiş), 7.7 g sükroz (45 mOsm), 100 U / ml penisilin ve 100 ug, 5 ml / 500 ml L-15 kültür ortam içeren ml Streptomisin (% 2). Tam ortam daha sonra bir 0.20 mikron gözenek filtresi kullanılarak filtre edilir.

Yumurta tampon ve kültür ortamı, sırasıyla 340 ve 345 mOsm osmolaritesini sahip olduğunu unutmayın. Gerçekten de, memeli hücrelerinin aksine, C. elegans hücrelerin nispeten yüksek ozmotik basıncı vardırbu hücrelerin plazma membran ile doğrudan temas edecek çözümler hazırlanırken saymak içine alınması gerekir. Bu reaktiflerin tarifleri bir osmometre 1 kullanılarak ölçülmüştür istenen ozmolarite ulaşmak için ayarlanmıştır. Bu tarifleri tam olarak takip edilmektedir ve bakım Bu reaktif maddelerin hazırlanmasında kullanıldığında bir osmometre kullanmak gerekli değildir. Diğer çözümler, yemek tarifleri burada rapor edilmez veya C'yi kullanmak yayınların herhangi hazırlanmış olması, gerekiyorsa Ancak, tek bir osmoter kullanmalısınız kültür hücreleri elegans.

2. Yumurta İzolasyon

  1. Bu (24 oyuklu plakalar içerisinde) kültürlenmiş hücrelerin 12 kuyu için yeterli yumurta toplamak için en az dört 8P plakaları ile başlamak için tavsiye edilir.
  2. Prosedüre başlamadan önce fıstık lektin stok solüsyonu bir tüpü eritin. Bir 24-çukurlu plaka içindeki kuyuların altındaki otoklav lamelleri yerleştirin ve lamelleri fıstık lektin 200 ul ekle. 1 saat ya da u inkübentil hücreler kaplama hazırdır. Tamamen fıstık lektin çıkarın ve steril otoklavlanmış 1 ml su ile bir kez kuyu yıkayın. Lamelleri fıstık lektininin tam çıkarılması hücre topaklanma kaçınmak için gereklidir.
  3. Steril otoklava su kullanarak agar plakaları kapalı gebe yetişkin yıkayın. İki steril konik 50 ml tüp içine süspansiyon toplayın. Tüplerin (*) altındaki solucanlar çökelmesine izin verecek şekilde 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın. Bir transfer plastik bir pipet ile su çıkarmak ve taze steril otoklavlanmıştır su ile değiştirin. 200 xg 10 dakika boyunca (~ 1.200 rpm) (*) masa üstü santrifüj ile solucanlar Pelet. En az 3, bu son adımı tekrarlayın.
  4. Bir steril 15 ml konik bir tüp içine transfer solucanlar ve 200 x g'de 10 dakika boyunca (~ 1,200 rpm) (*) onları pelet. Hem tüpün altındaki bakteri toplama önlemek için daha yüksek bir hız santrifüj kullanmayın. Bazen santrifüj işlemi sonrasında tamamen solucanlar topak değildir. After Her bir yıkama ve temizleme önce yüzer madde, buz üzerinde 5 dakika boyunca tüpleri. Soğutulmuş su solucanlar tüpün dibine çökme olmamıştır.
  5. Su çıkarmak ve parçalama çözüm 5-6 ml ekleyin (Malzeme kurmak bakınız). 5-10 dakika boyunca yavaşça süspansiyon kaya ve daha sonra her 2-3 dk stereomicroscope altında solucan lisizine izleme başlar. Süspansiyonun bir damla daha kolay kontrolü için bir lamel üzerine yerleştirilebilir. Kuluçka süresi ağartıcının tazelik bağlı olarak değişir; ağartıcının küçük şişe satın almak ve her ay yeni bir şişe açın.
  6. ~% 70-80 oranında solucan (İnkübasyonun başından itibaren 10 dakika) lize ne olursa olsun (Malzeme ayarlamak için bkz) yumurta tamponu, pH 7.3 içinde 9 ml eklenerek parçalama reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 200 x g'de (1200 rpm ~) de süspansiyonu santrifüj. Yumurta (*) yeniden kirlenmesini önlemek için bankta bir Bunsen beki var Bu noktadan itibaren.
  7. Dikkatlice steril plastik transfer pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve pelet 3-4 yıkayınçözüm açıktır x yumurta tamponu ile kadar. Her bir yıkama sırasında yumurta tamponunda pelet iyice karıştırın emin olun.
  8. Yumurta% 30 sukroz çözeltisi kullanılarak Hayvan karkaslarının ayrılır. Steril yumurta tampon, 2 ml pelet yeniden süspanse edin ve 2 ml% 60 sukroz çözeltisi (steril yumurta tamponunda stoku) ekleyin. İyice karıştırın ve 200 x g (~ 1200 rpm) (*) 20 dakika boyunca santrifüj.
  9. Dikkatlice santrifüj tüpleri çıkarın. Yumurtalar çözeltisinin üstünde yüzen. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, yeni bir steril 15 ml konik tüp içine tüm yumurta transferi.
  10. 10 dakika boyunca 200 x g (~ 1200 rpm) ve santrifüj tüpüne steril yumurta tampon 10 ml ilave edilir. Yıkandıkları 3 x tekrarlayın. Yumurtalar Tamamen her yıkama sırasında yumurta tampon içinde tekrar süspanse edilir emin olun.

3. Embriyonik hücreler Ayrılma

Laminer akış kapağı steril şartlar altında Prosedürün sonraki adımlar Davranış. Hayvanlar datüm bakteri değilse en ortadan kaldırmak gerekir bakteri plakalarının, yıkama ve ağartma maddesi içeren lizis çözeltisi ile muamele elbise. Bu durumda, prosedür, bu noktada, bir laminar bir başlık kullanılarak yumurta süspansiyonu yeni bir kirlenmesini önler.

  1. 2 mg / ml kitinaz (yumurta tamponu pH 6.5 (*) stok), 1 ml topak haline yumurta yeniden süspanse edin ve yeni bir steril 15 ml konik tüp aktarın. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca tüp sallayın. Kesin inkübasyon süresi, enzimin ve oda sıcaklığının tazelik göre değişen ve bu nedenle her hazırlanması için belirlenmelidir. Bu inkübasyon 10 dakika sonra, ters çevrilmiş bir hücre kültürü mikroskop altında yumurta izlemeye başlamak için tavsiye edilir. Not: bizim deneyim, düşük pH şitinaz enzimatik aktivitesini arttırır. Bu nedenle, biz kitinaz (pH NaOH ile 6.5 'e ayarlanır yukarıda belirtilen tarifi) eritmek için pH 6.5' de yumurta tampon kullanın.
  2. ~ Yumurtalarında% 80'i tarafından sindirilir zamankitinaz tedavisi (Şekil 1 AB), 900 x g'de 3 dakika boyunca (~ 2,500 rpm) (*) santrifüjleme ile yumurta pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, dikkatlice süpernatant kaldırmak ve L-15 orta 3 ml (*) ekleyin.
  3. 6 cm çaplı plaka içine yumurta aktarın ve yavaşça bir 18 G iğne ile donatılmış bir 10 ml'lik steril bir şırınga kullanılarak hücreleri ayırmak. Yeni bir plastik Petri kabı içine bir süspansiyon damla yerleştirerek ve mikroskop altında görüntüleyerek ayrışma derecesini izlemek. Zarar hücreleri önlemek için bu işlem sırasında enjektör içine hava aspire etmeyin. Hücrelerin% 80 ayrışmış olan ~ kadar ayrışma devam edin.
  4. Steril 5 um Millipore filtresi kullanılarak süspansiyon filtre. Hücre süspansiyonları, hücre kümeleri, sindirilmemiş yumurta ve larvalarına yumurtadan çıkarmak için filtre edilmelidir. Tüm hücreleri kurtarmak için filtre boyunca taze L-15 ortamı ilave 4-5 ml filtre. Dekar önlemek için filtrasyon aşaması sırasında aşırı güç kullanmayınfiltresi ve / veya hücreleri maging.

4. Hücre Kültürleme

  1. 3 dakika boyunca (*) için 900 x g (~ 2,500 rpm) santrifüjleme ile ayrışmış hücreleri Pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak dikkatlice süpernatant kaldırmak. Tüm L-15, orta ve plakanın 1 ml / oyuk olarak pelet hücreleri yeniden süspanse edin. Ilave ortamın miktarı, kullanılan 8P plakaların sayısı, plakalar üzerinde solucanların birleştiği ve hücreler üzerinde yapılacak deneyler türüne bağlıdır. Hücre yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak belirlenebilir. ~ 230.000 hücre / cm 2 optimal yoğunluk kaplama yama-kelepçe kayıtları için.
  2. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için ıslak kağıt havlu içeren plastik bir kap içinde Tupperware 24 kuyu plakası tutun. 20 ° C ve çevre havası ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde kabı saklayın.
  3. Hücreler genellikle 24 saat içinde deneyler için hazır olduğunda morfolojik ayrım ve ekspresGFP belirteçlerin iyon tamamlandı. Hücreler kadar 2 hafta boyunca kültür içinde tutulur, fakat bunlar genellikle kaplama sonrası 7-9 gün kadar en sağlıklı. Ortam, sağlıklı hücreleri korumak için günde bir değiştirilmesi gerekir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. kültür hücreleri spesifik belirteçler farklılaştırmak ve ekspres hücre elegans

Christensen ve tripan mavi lekelemesi kullanılarak arkadaşları göstermiştir ki, embriyonik C>% 99 elegans hücreler izolasyon prosedürü hayatta. 9 gün sonra kaplama ve 22, sırasıyla% 85 ve% 65, hala 1. hayatta. İzole embriyonik C. elegans hücreleri ayırt etmek için bir alt-tabaka için uygun olmalıdır. Form kümeleri uymadığı ve onlar hayatta olup olmadığı aç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans gelişim, davranış ve yaşlanma ile ilgili genetik yollar deşifre için güçlü bir model organizmadır. Onun rahatlığı öncelikle genetik manipüle edilebilme kolaylığından ve kısa yaşam döngüsü kaynaklanıyor. Onun kolaylık rağmen, C. elegans sınırlamaları vardır. C elegans hücreler son derece küçük ve bu mikro-dizi analizi ile gen ekspresyon profili olarak, doğrudan bu tür elektrofizyolojik ve farmakolojik teknikleri gibi hücrelere erişim, veya özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektirir ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranülVWR Uluslararası A.Ş.90000-784
Bacto Tripton VWRUluslararası A.Ş.90000-284
Bacto Maya ÖzüVWR International Inc.90000-724
Leibovitz'in L-15 Orta (1x) Sıvıİnvitrojeni11415-064
Fetal Sığır Serumuİnvitrojeni16140-063
Penisilin-streptomisinSigmaP4333-100ML
Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN'dan
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetik Merkezi
Fıstık LektinSigmaL0881-10MG
SükrozSigma57903-1KG
D-(+)GlikozSigma67528-1KG
Etilen glikol-bis (2-amin– thylether), N, N, N', N'- tetraasidik asit (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Kolesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl < sub > 2 < / sub >SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO<>sub4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Etanol
Otoklavlanmış damıtılmış H2O
Çamaşır Suyu
EQUIPMENT
101-1000 μ l Mavi Dereceli Pipet UçlarıUSA Scentific1111-2821
10 ml Sterilize Pipet Ayrı Ayrı SarılmışUSA Scentific1071-0810
Ergonomik Değişken Hacim (100-1000 & mu; l) Uç çıkarıcılı pipetleyiciVWR International Inc.89079-974
Taşınabilir Pipet Yardımı, DrummondVWR International Inc.53498-103
Transfer Plastik Pipet SterilVWR International Inc.14670-114
15 ml Konik Tüp ABD Scentific1475-1611
50 ml Konik TüpUSA Scentific1500-1811
Steril 18 gauge İğnelerBecton, Dickinson and Co.
Steril 10 ml ŞırıngalarBecton, Dickinson and Co.
Plastik Şırınga Filtreleri Corning 0,20 & mu; m gözenek boyutu Corning431224
Akrodik 25 mm Şırınga filtresi w / 5 & mu; m versapor MembranVWR Uluslararası A.Ş.28144-095
60x15 mm Petri Kabı SterilVWR International Inc.82050-548
100x15 mm Petri Kabı SterilVWR International Inc.82050-912
12 mm Çaplı Cam LamellerVWR International Inc.48300-560
Şeffaf Hücre Kültürü Plakaları 24 Kuyulu Düz Tabanlı kapaklı Thomas scientific6902A09
Dumont #5- İnce Forseps Güzel Bilim Araçları11254-20
Santrifüj 5702Eppendorf022629883
x10 objektifli
Laminer Akış Başlığı
Ortam havası nemlendirilmiş İnkübatör
Kitinaz305196305482 Ters Mikroskop

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135(2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42(2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020(2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans Embryonic CellsEgg IsolationChitinase TreatmentManual DissociationCell CultureImmunofluorescenceMicroscopyElectrophysiologyCalcium ImagingPatch Clamp

Related Articles