Doğuştan gelen bağışıklık tepkisi patojen enfeksiyonuna karşı koruma sağlar organizmalar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin önemli bir bileşeni, fagosit solunum patlaması, istila eden mikroorganizmaları öldürmek reaktif oksijen türleri oluşturur. Biz, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi kimyasal uyarılmaktadır zaman üretilen reaktif oksijen türleri rakamlarla bir solunum patlaması tahlili tarif eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Fagosit solunum patlaması patojen enfeksiyonuna karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir parçası olan ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini içerir. ROS zehirlidir ve fagosite mikroorganizmaları öldürmek için işlev görürler. Fagosit türevi ROS in vivo miktar güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi için bir organizmanın yeteneği ile ilgili bilgi sağlar. Burada fagosit solunum patlaması kimyasal indüksiyon üzerine tüm Zebra balığı embriyolarının ROS ölçmek ve karşılaştırmak için bir protokol açıklar. Bu yöntem, ROS tarafından oksidasyonu ve onu takiben floresan haline olmayan bir floresan bileşik kullanır. Bireysel embriyolar, zebra balığı, bir mikroplaka oyuklarına pipetle ve solunum patlaması bir kimyasal uyarıcı ile ya da olmadan, bu flüorojenik alt-tabaka içinde inkübe edilir. Her çukurdaki floresans bir mikro levha okuyucusu kullanarak arzu edilen zaman noktalarında ölçülür. Floresans okumaları floresan arka plan ortadan kaldırmak için ayarlandı ve daha sonra işbirliği vardıreşleştirilmemiş t-testi kullanılarak mpared. Bu yöntem, farklı gelişim aşamalarında ve bu protein demonte, aşırı ekspresyonuna veya farmakolojik maddeler ile tedavi olarak deneysel manipülasyonlar tepki olarak zebrafish embriyoların solunum patlama potansiyelinin karşılaştırma sağlar. Bu yöntem aynı zamanda yetişkin zebrafish böbrekler ve diğer bazı balık türleri ikinci bütün Dissected böbrek veya hücre preparasyonlarda solunum patlaması yanıtını izlemek için kullanılabilir. Biz bu protokolün göreceli basitlik ve uyum mevcut protokolleri tamamlayacak ve daha doğuştan gelen bağışıklık tepkisini anlamaya çalışırlar araştırmacıların ilgi olacağına inanıyoruz.
Giriş
Doğal ve adaptif bağışıklık: Bağışıklık sistemi iki koldan oluşur. Doğuştan bağışıklık evrimsel adaptif bağışıklık daha eskidir. Omurgalılar hem doğal ve adaptif şubeleri sahip iken Omurgasız anda, sadece doğuştan bağışıklığı olması düşünülmektedir. Adaptif bağışıklık belirli patojenlere karşı özel ve uzun süreli bağışıklık sağlamasına rağmen, doğuştan gelen bağışıklık istilacı bakteri, virüs ve mantarlar için hemen bir yanıttır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir önemli yönü yabancı istilacıları yutmak ve yok etmek fagositlerce (örneğin makrofajlar, nötrofiller) iltihabı ve işe sonuçlanan sitokin ve kemokin salınımını içerir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Zebra balığı Bakım ve Onarım
- Hayvancılık: Kitle yumurtlamaya yetişkin zebrabalıkları olarak önce 13 tarif. 14, daha önce tarif edildiği gibi kökenli embriyolar toplayın.
- Mikroenjeksiyon (istenirse) gibi gen ürünlerini aşırı ifade edilmesi için gen ürünleri ya da mRNA demonte morfolino oligonükleotitler ile Microinject 1-4 hücre aşamasında embriyoların zebra balığı, daha önce tarif edilen 15.
- Mock yeterli bir havuz korumak kontrolleri enjekte (en az 48 oturma, sahte deneysel manipüle balık 96 kuyu mikroplağı doldurmak için gerekli olan, kumanda balık ve 48 yaşam enjekte).
- Embriyolar....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, biz 48 de Zebra balığı embriyolarının solunum patlaması yanıtı (yabani tip, AB arka) karşılaştıran veri ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) sağlar. Bizim kontrol grubu ve deney grubu olarak 72 hpf embriyolar gibi davranıyordu 48 hpf embriyolar. Kullanılan örneklem büyüklüğü 24 un kaynaklı embriyolar ve gelişim aşamasında başına 24 PMA-kaynaklı embriyolar oldu. (Bağıl Floresan Birimleri (RFU) in) Ham floresan okumaları 4 saat PMA eklenmesinden sonra mikroplak okunmasıyla elde edilmiştir. Ham floresan değerleri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fagositlerin birincil işlevi patojenleri tespit yutmak ve yok etmektir. Uygun bir solunum patlamaları üretmek için fagositoz yeteneği bu işlev için kritik öneme sahiptir. Böylece, solunum patlaması tepkisinin ölçümü kişi ve / veya deneysel manipülasyonlar tepki olarak grupları arasında genel olarak doğuştan gelen bağışıklık sağlık ve fonksiyon karşılaştırma yapmak için bir yöntemdir. Burada biz neden ölçmek ve tek tek zebra balığı embriyoların gruplar arasındaki solunum patlaması yanıt karşılaştırmak için bir protokol a.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Yazarlar Kim laboratuvar, yararlı tartışmalar ve veri paylaşımı için Zebrafish bakım ve onarım, Dr Robert Wheeler Mark Nilan geçmiş ve şimdiki üyelerine de teşekkür ve NIH hibe 3RO1GM087308-02S1 ve 1P20RR024475-01A2 ve Maine Tarım ve Orman olur finansman için Station (Yayın Numarası 3303) Deney.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anında Okyanus Deniz | Tuzu Anında Okyanus | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Trikain S MS222 | Batı Kimyasal | 100 gram | |
| DMEM / F-12, Fenol Kırmızı Yaşam | Teknolojileri | Yok11039-021 | |
| Derin Petri Kapları | VWR | 89107-632 | |
| Plastik Transfer Pipetleri | Fisher | 13-711-7M | |
| # 5 Dumont Forseps Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 72700-D | |
| 1.7 ml Mikro Santrifüj Tüpleri | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Konik Santrifüj Tüpleri | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serolojik Pipetler | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu | BioTek | İletişim BioTek | |
| Siyah 96 Kuyulu Mikroplaka | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Steril Rezervuarlar | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipetleyici | Gilson | F123601 | |
| Çok Kanallı Pipetleyici | VWR | 89079-948 | |
| Pipet Uçları | VWR | 89079-478 |
Kaynaklar
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
