Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

39.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50671

⸱

1 Kasım 2013

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mast hücre degranülasyonu, alerjik aracıların salınması, alerji, astım ve parazit savunmada önemlidir. Burada degranülasyonunun uyuşturucu ve toksik etkileri değerlendirmek için teknikleri 1 göstermek, yöntem son zamanlarda antibakteriyel madde triklosan 2 güçlü inhibitör etkisi sergilemeye kullandı.

Özet

Mast hücreleri alerjik hastalık ve parazitlere karşı bağışıklık önemli rol oynamaktadır. Bir kez (bir alerjen tarafından gibi) aktif, onlar degranüle, bir süreç bu alerjik aracıların ekzositoz ile sonuçlanır. Ilaç ve toksik maddeler ile mast hücre degranülasyonu modülasyonu insan sağlığı üzerinde olumlu veya olumsuz etkileri olabilir. Mast hücre fonksiyonu fare bazofilik lösemi mast hücrelerinin kullanımı (RBL-2H3), 3-5 insan mukozal mast hücrelerinin yaygın olarak kabul modeli ile ayrıntılı olarak disseke edildi. 6 mast hücrelerinden histamin ile birlikte doğrusal olarak serbest bırakılır, mast hücre granül bileşen ve alerjik aracı β-heksosaminidaz, kolay ve güvenilir için uygun olan bir mikroplaka deneyinde ölçülebilir floresans yoğunluğunu verecek şekilde bir florojenik substrat ile reaksiyon yoluyla ölçülebilir yüksek verimli çalışmaları 1. Başlangıçta Naal ve ark. 1 tarafından yayınlanan, böylece tarama o için bu tahlil degranülasyonu uyarlanmışf ilaç ve toksik maddeler ve burada kullanımı göstermektedir.

Triklosan birçok üründe mevcut olan ve bu etkinin mekanizması bilinmemektedir, ancak, insan 7-11 alerjik deri hastalığı tedavi edici bir yardımcı olduğu bulunmuştur geniş spektrumlu bir antibakteriyel maddedir. Burada, mast hücre degranülasyonu üzerinde triklosan etkisi için bir analiz gösterilmektedir. Biz son zamanlarda triklosan güçlü mast hücre fonksiyonu 2 etkilediğini gösterdi. Bir organik çözücü kullanımını önlemek için bir çaba olarak, triklosan ısı ve karıştırma ile bir sulu tampon halinde doğrudan eritildi ve elde edilen konsantrasyon 12 (ε 280 = 4.200 L / M / cm kullanılarak), UV-VIS spektrofotometresi kullanılarak teyit edilir. Bu protokol, daha genel olarak da bir alerjik potansiyel mast hücre degranülasyonunu üzerindeki etkilerini belirlemek için çeşitli kimyasalları ile kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir ve.

Giriş

Mast hücreleri son derece astım anahtar arabulucu olarak hizmet immün efektör hücreleri, alerji, parazit savunma ve kanser 13-16 granül vardır. Degranüle için aktif kadar güvenli bir şekilde sitoplazmik granül alerjik ve inflamatuvar mediatörlerin depoladığınız Onlar, hemen her vaskülarize doku 15 bulunur. Degranülasyonunun gibi histamin, triptaz ve lökotrienler 15 olarak farmakolojik olarak aktif mediatörlerin salınımı ile sonuçlanır membrana bağlı granül, en ekzositoz olduğunu. Türü başlatılmasında Bu işlem sonucu ben parazitlere karşı savunma montaj yanı sıra, alerjik astım ve kanserojen yanıtları 15 başlatmada kritik aşırı duyarlılık reaksiyonları.

Mast hücreleri ve bazofiller FcεRI reseptörleri, imünoglobulin E (IgE) ve 17 için yüksek afiniteli reseptör çıkarırlar. Bir alerjen ya da antijene maruz kalma çok Ig-bağlı reseptör FcεRI 17 toplama neden olur ve bu stirosin fosforilasyon olaylarını, iç mağazalarından fosfolipaz C kalsiyum akış aktivasyonu ve hücre 18 içine kalsiyum akışı bir çağlayan: degranülasyon işlemi başlatır Ig-bağlı Fc reseptörleri "çapraz bağlama" O-adlandırılır. Bu, kalsiyum girişini degranülasyonu için gerekli olan ve bundan başka, granül ekzositozu 15 neden önce membran ile granül füzyon işaret eder. Deneysel olarak, bir kalsiyum iyonofor yukarı olmak ya da alt akışında bir toksik madde tarafından bir yol hedefin tanımlanması için izin doğrudan aslında tüm sinyal transdüksiyon kalsiyum girişini adımı 20'ye önce adımlar atlar hücre zarı 19 üzerinden servis aracı kalsiyum için kullanılabilir kalsiyum 20 sinyal.

Degranülasyon histamin 6 yanında granüller doğrusal bir serbest hücre yüzer içine, β-heksosaminidaz salınımını izleyerek hızlı ve etkili bir şekilde ölçülebilir, ancak, Iin daha kolay tahlil floresan ürünü için basit bir enzim-substrat reaksiyonu ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak tespit etmek. Gibi protokol bölümünde ayrıntılı olarak bu mikro-tahlil ile, β-florojenik substrat bölünme 4-metilumbelliferil-N-asetil-β-D-glucosaminide rakamlarla başlangıçta Naal ve ark. Sağlam bir yöntem, 1 dayanmaktadır heksozaminidaz. Triklosan burada vurgulanır ile Biz, ilaç ve toksik maddelerin test etkileri tahlil değiştirdiniz. Bu yöntem, güvenilir bir degranülasyonu miktarını belirler, örneğin, akış sitometrik-tabanlı algılama yöntemleri 21, pahalı olmayan bir alternatif olan ve anti-alerjik ilaçlar geniş bir yelpazede yüksek verimli tarama için güzel bir şekilde bir aday potansiyeline sahip, yanı sıra immunotoksik veya alerjik kimyasallar. Bu son nokta 21. Yüzyılda 2007 Ulusal Araştırma Konseyi raporu "Toksisite Test ışığında özellikle önemlidir: Bir Vizyon ve bir Stratmadır "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 bu da fareler gibi geleneksel laboratuar hayvanlarının pahalı kullanımını azaltmak için hücre kültürü kullanan yüksek verimli toksikoloji testleri geliştirilmesi için savunmaktadır). Naal ve arkadaşları. 1 tarafından geliştirilen ve bize 2 tarafından değiştirilen degranülasyonunun protokolü, homolog insan mukozal mast hücreleri veya bazofil 3-5 için iyi kabul modeli RBL-2H3 hücre hattı, kullanır. (Kültürlenmesi RBL-2H3 hücreleri için Yöntemler Hutchinson ve ark ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 22). Bu deney, büyük olasılıkla, bağlı mast hücre tipine adapte edilebilir.

Triklosan (TCS) hastaneler, kişisel bakım ürünleri ve tüketim malları 23,24 fazla 30 yıldır kullanılan bir geniş spektrumlu antimikrobiyal olduğunu. TCS'nin antimikrobiyal özellik için Tesir inhibe enoil-asil ile muhtemelen, yağ asidi biyosentezi inhibisyonutaşıyıcı protein redüktaz 25,26. Bu tür duş jeli, el kremi, diş macunu, diş macunu, ve% 0.3 ya da 10 mM 24 kadar konsantrasyonlarda sabunda gibi tüketici ürünleri için çok geniş bir yelpazede dünya çapında bulunur. TCS yaygın kullanımı insanlarda 27-29 ve nehir ve akarsu 30 saptanabilir düzeyde sonuçlandı. Allmyr ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışma. 27 TCS ve metabolitleri plazma ve emziren anneler süt hem de mevcut olduğunu göstermiştir. Önemli olarak, TCS kolayca deri 31-37 emilir. Queckenberg ve ark. 37 mast hücrelerin bulunduğu cilt, önemli konsantrasyonu ile sonuçlanan, 12 saat içinde insan deri içine bir ~ 70 mM TCS krem ~% 10 emilme bulduk.

TCS insan alerjik deri hastalığı 7-11 yönetmek için klinik olarak gösterilmiştir, ama TCS alerjik deri hastalıkları hafifletir hangi mekanizma 38 bilinmeyen olmuştur. Floresan mikro testi ayrıntılı açıklamalar yapmak Kullanımıd bu video, son zamanlarda 2 mcM kadar düşük konsantrasyonlarda TCS, önemli ölçüde bu klinik verileri 2 için potansiyel bir açıklama getirmek, mast hücre fonksiyonu ve degranülasyonuna azalttığı göstermiştir. Bu klinik veriler için bir açıklama sağlamak için ek olarak, Palmer vd bulgular. 2 TCS Kalsiyum girişi aşağı sinyal molekülleri hedef olduğunu göstermektedir. Birçok immünolojik ve diğer biyolojik süreçlerde sinyal kalsiyum önemi nedeniyle, TCS potansiyel olarak gerekli biyolojik süreçlerin çok çeşitli olumsuz etkileri olabilir. Aslında, Udoji ve ark. 39 ASR önemli bir doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu, insan doğal katil hücre litik aktivitesini baskıladığı gösterdi.

Alerjik deri hastalığı (ya da tam tersine, bir immunotoxicant gibi) bir tedavi aracı olarak potansiyel ötesinde, TCS da Topu 40-49 bir endokrin olabilir. Bu nedenle, çözüm bu kimyasal hazırlamak konusunda net bir prosedür itoksikoloji ilgilendiren s. TCS küçük hidrofobik molekülün olduğu için, organik bir araç genellikle su içinde daha fazla çözünür hale getirmek için kullanılır. TCS test edilmiştir en toksisite çalışmalarında, hazırlama, örneğin etanol, aseton, 2,50,51 veya yağ gibi bir organik çözücü yardımı ile su içinde çözünme yer almıştır. Ancak, çoğu kez bu çözücülerin ve böylece test kimyasal veriler 51 yorumlanması zorlaştıran, kendileri biyolojik olarak aktiftir. Aslında, Rufli et al. 52 ve diğerleri 53, bu akut toksisite deneylerinde test solüsyonları toksisite eserler oluşturmak için kimyasal çözücüler potansiyeli nedeniyle, kimyasal yöntemlere göre fiziksel yöntemler kullanılarak hazırlanır önerilir. Daha önce TCS% 0.24 etanol / su (hacim / hacim) içinde çözüldü ve 30 dakika azaltan RBL mast hücre degranülasyonunu 2 sonike göstermiştir. % 0.24 'den daha yüksek konsantrasyonlarda Etanol mast hücre degra engellemek için gösterilmiştirnulation 54,55-örnekler toksisite çalışmaları organik çözücülerin potansiyel karıştırıcı etkileri.

Sadece bu organizma ya da çalışma için kullanılan hücreler üzerinde çözücülerin etkisi dikkate alınması önemlidir, ama aynı zamanda bu test kimyasal kendisinde bir çözücü etkisini izlemek için önemlidir. Örneğin, Skaare ve ark. 51 yağların erime fonksiyonunun tam kaybına yol ise polietilen glikol TCS (genellikle diş macunu ve gargara bulunan) eritilmesi sağlıklı kadın kadınlarda anti-bakteriyel ve anti-plak etkilerini zayıflattı bulundu. Bu nedenle, farklı çözücüler yeteneği TCS da dahil olmak üzere toksik madde ve modüle etmek için ilaç, etkilerini tahlil tasarımında dikkate alınmalıdır. Yağ veya lezzet Katkı maddelerinin kullanımı çeşitli ürünler 50,51 içinde TCS etkilerini etkileyebilir.

Organik çözücüler kullanma ihtiyacı ortadan kaldırmak için bir çaba olarak, organik bir sol ve kullanımı ortadan kaldırarak TCS 2 çözülmesi için yöntem üzerine geliştirilmişdelik. Bu protokol, ısı (≤ 50 ° C) ile sulu tampon doğrudan TCS granül çözülür ve daha sonra UV-Vis spektrofotometresi bu TCS stok konsantrasyonu doğrulayın. TCS 40 uM (kadar suda çözünür olduğu için bu gelişmeler mümkündür http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) ve 50 ° C (ısıtıldığında, bozulmaya karşı dayanıklı gösterilmiştir http / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. TCS da güçlü 4.200 L / mol / cm 12 molar sönüm katsayısı ile 280 nm 58 de emmek için bilindiği gibi biz de, UV-Vis spektrofotometre yararı var.

Bu protokol, düşük maliyetli ve hızlı bir şekilde tesbit de dahil olmak üzere bir organik çözücü yardımı olmadan, bir tampon içine TCS granüller çözmek için basit ama etkili bir yol sağlarkonsantrasyon ve mast hücre degranülasyonu kimyasal etkileri izlenmesi için güçlü bir floresan mikro testi açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm tampon tarifleri protokol metnin sonunda bir tabloya dahil unutmayın.

1. GÜN:

1. Hücrelerinin Hazırlanması

  1. Kenar etkileri önlemek için düzen üzerinde test örnekleri merkezleme, 96 plaka kurulum düzeni dışarı planlayın. Ayırma her biri üç adet TCS konsantrasyonu test edilen (antijen ya da iyonoforun ± degranülasyonu uyarıcı), hem de standart hatası spontan salım için (Resim degranülasyonu uyarıcı), maksimum salım (% 0.2 Triton X-100 [TX] deterjan lizis), yanı sıra için çoğaltır kuyu arka plan örnekleri (hiçbir hücre içerecek olan) için ayrılmıştır. Her çoğaltmak deneysel gün için, TCS örnek konsantrasyonlarının yeni bir randomize düzen seçin.
  2. 37 ° C su banyosunda sıcak RBL medya (tarifi tabloda yer) ve tripsin.
  3. Iyi iyileşmek genel belirtileri için T-25 balonuna RBL hücreleri (2-4 son kabulünden bu yana gün ve çözülmüş bu yana 3-4 ay veya daha kısa) kontrol edininci: Uygun medya renk ile gösterilir pH ve bulutluluk eksikliği. Balonun kirlenme ücretsiz olduğunu ve hücreler, düzgün birleşik sağlıklı görünen ve daha çok bağlı olduğunu onaylamak için bir ışık mikroskobu altında şişesi yerleştirin. Hücreleri mycoplasma kirlenme yaklaşık her altı haftada 22 kontrol edilmelidir unutmayın.
Tedavi Triplicates
Uyarılmış, 0 mcM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Uyarılmış, 0.001 mcM TCS F6, G6, H6
Uyarılmış, 0.1 mcM TCS A4, B4, C4-
Uyarılmış, 1 mcM TCS A6, B6, C6
Uyarılmış, 5 mcM TCS F5, G5, H5
Uyarılmış, 10 mcM TCS A3, B3, C3-
Uyarılmış, 15 mcM TCS A5, B5, C5
Uyarılmış, 20 mcM TCS G7 F7, H7
Uyarılmış, artı yüksek [TCS] F3, G3, H3
Spontan, yok TCS (alay içerir) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, No TCS D10, D11, E10 D12, E11, E12
Hayır Hücreler, Arka Plan, artı yüksek [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

figure-protocol-1
Büyük resim görmek için buraya tıklayın .

  1. Steril doku kültürü (TC) kaput içine RBL hücre şişesi alın. Hücreler, bot eklibalonun tom. TC başlık altında Çalışma ve standart steril tekniği kullanarak, steril pipet ile şişesi tüm ortamları çıkarın, hücrelerin balonun altına bağlı kalır. Daha sonra, 2 ml tripsin ile teçhiz durulayın, sonra bu yıkama atın.
  2. Balonun alt kapağı tam olarak 2 ml tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca ° C inkübatör hücrelerin şişenin alt ayırmak için izin vermek için 37 içine koyun.
  3. 5 dakika sonra, hücreler gevşetmek için açık bir avuç içi ile şişenin yan çarptı. Hemen, şişeyi kapalı hücreler yıkamak için 18 ml RBL medya ekleyebilir ve tripsin gidermek için. Hemen balonun dışında hücre-medya-tripsin karışımı almak ve yeni, steril 50 ml tüp (bu tüp içinde toplam hacmi şimdi 20 ml) transfer.
  4. Yavaşça ama iyice karıştırıldıktan sonra, bu tüpten hücre süspansiyonu 50 ul kaldırmak ve sayılacak bir örnek bir 1.5 ml steril mikrosantrifüj tüp, transfer. Bu örnek almak, hem de 50 mi0, masa üstü için TC kaput hücre-medya-tripsin karışımı dışarı içeren tüp.
  5. 500 xg 8 dakika santrifüj 50 ml tüp (uygun bir denge ile) Spin, bu güç pelet hücreleri etkili.
  6. Sıkma sırasında, iplik önce izole edilmiştir numunedeki hücrelerin sayısı. Bunu yapmak için, ilk 1.5 ml tüp hücrelerin 50 ul tripan mavi boya 50 ul ekleyin ve yavaşça ama iyice karıştırın aşağı 5x kadar pipet ve. Hemen, cam hematositometre bu karışımı 10 ul transferi ve üretici talimatları izleyerek ızgara alanda hücreleri saymak. Makul istatistiksel sonuçlar için en az 100 hücreleri saymak.
  7. Geri TC kaputu, santrifüj edildi hücrelerinden süpernatant kaldırmak.
  8. Hücre Tüp kap ve hücreler gevşetmek için tüpün alt pelet hafifçe vurun.
  9. Hücre Sayısı göre 0.5 x 10 6 hücre / ml bir yoğunluğa vermek üzere tripsinize edilmiş hücre ortam ekleyin.
  10. Kaplama işlemi sırasında askıya hücreleri tutmak için iyi ama yavaşça karıştırın. Bir Pipetman kullanarak, plaka şablonu sayfasını uygulayarak, bir 96-plaka (düz, siyah alt) içinde / iyi 100 ul hücreleri koydu. Hücreler üç oyuğun her resim grubu sonra sistematik hata ve karışmaması için oyuklara ilave edilir nasıl Rastgele eklenir. Arka plan örnekleri için etiketli kuyulara hücreleri koymak emin olun.
  11. Bir kez tüm hücreleri devredilmiştir, plaka üzerine plaka kapak yerleştirin ve gece boyunca (37 ° C /% 5 CO 2) inkübatör transfer. Standart steril teknik takip temizleyin.

2. GÜN:

2. Triklosan hazırlanması

  1. Etiketli bir 500 ml Erlenmeyer şişesi içine dereceli bir silindir, ölçü 250 ml Tyrodes Tampon (tarifi tabloda verilen) kullanarak "TCS-tampon." Bar karıştırın ekleyin. TCS ile kullanım için belirlenen bar, termometre karıştırın, cam kullanın.
  2. Ayrıca bu zamanda, ölçü 250ayrı bir 500 ml Erlenmeyer şişesi içine ml Tyrodes, etiketli "kontrol tampon." Kullanım cam, bar, TCS için belirlenmiş DEĞİLDİR termometre karıştırın. Bar karıştırın ekleyin.
  3. TCS granül 0.0022 g tartılır ve "ASR-tampon" balon (250 ml Tyrodes Tampon içeren) transfer. Verimli Erlenmeyer şişesi için granül transfer etmek için, tüm TCS devredilmiştir emin, tekne tartmak yıkayın ölçülen 250 ml Tyrodes 10 ml kullanın.
  4. Yer "TCS-tampon" bir arada ocak / manyetik heyecan plaka üzerine şişesi ve bir idare edilebilir yüksek hızda karıştırmaya ayarlayın. Bir kez de karışık, bu TCS hisse senedi nominal 30 mcM (gerçek konsantrasyon ısıtma sonra hesaplanacaktır) olacaktır. (Kimyasal bir davlumbaz tüm karıştırma yapın.)
    1. Ayrıca şu anda, ikinci bir arada ocak / manyetik heyecan plaka üzerine "kontrol tampon" şişesi (yok TCS içeren) yerleştirin, ve benzer bir hızda karıştırın ayarlayın.
  5. Daha sonra kullanmak için lamba ısınmak için UV / Vis Lamba açın.
  6. Sürekli karıştırarak 50 ° C "TCS-tampon" çözüm ısıtın. Kurulduğunda 90 dakika için sıcaklık, zaman. 90 dakika boyunca, genellikle 50 ° C sıcaklık ve uygun bir karıştırma hızı izlemeye devam eder.
    1. Aynı zamanda, C sürekli karıştırma ile 50 "kontrol tamponu" çözeltisi (düz Tyrodes tamponu 250 ml olan) ısıtın. 50 ulaştıktan sonra süre, sıcaklık (50 ° C 'de tutarak) ve karıştırma izlenir ikisi boyunca ° C, 90 dakika boyunca zamana bağlıdır.
  7. 90 dakika sonunda, sıcak tabak ve masa üstü transfer kapalı Erlenmeyer şişeleri de alabilir.
  8. Boş makine ısıtmalı "ASR-tampon" çözüm 1 ml taramadan önce ısıtılmış "kontrol tampon" çözüm 1 ml üzerinde, bir UV / Vis spektrofotometre üzerinde dalgaboyu tarama işlevini kullanma. Bir, spektrumun şeklini kontrol280 nm d kayıt Absorbans değeri. Konsantrasyonunu belirlemek için, Beer-Lambert denklemi kullanarak (A 280 = ε 280 ℓ c) ε kullanılarak 4200 280 L / mol / cm 12 ve 1 cm ℓ.
  9. TCS konsantrasyonunun saptanmasından sonra, ekleme 0.249 g sığır (BSA), "TCS-tampon" çözeltinin geri kalan 249 ml ve iyice karıştırın serum albümini.
    1. Aynı zamanda, "kontrol tampon" çözüm geri kalan 249 ml 0,249 g BSA ekleyin ve iyice karıştırın.

2. GÜN:

3. RBL-2H3 hücreleri kullanarak antijen uyarımlı Degranülasyon Deneyi

  1. Başlamadan önce, kullanılan tüm tamponların pH kontrol ve bulutlu açık ve değil emin olun: Bu Tyrodes tampon, sodyum asetat tamponu ve glisin karbonat tamponu (tarifleri tabloda yer) içerir.
  2. 37 ° C su banyosunda sıcak RBL medya ve tripsin.
  3. BT (1 mg / ml yapmak0; uğratılmış Tyrodes tamponu BSA): 0.05 g BSA + 50 mi uğratılmış Tyrodes tamponu (x2). 37 ° C su banyosu içine koyun.
  4. Yap% 0.2 Triton X-100: BT 3.136 ml + 64 ul% 10 Triton X-100 (Triton X-100,% 0.2 son konsantrasyon). Tersine çevirerek iyice karıştırın, ancak girdap yok. 37 ° C su banyosu içine koyun.
  5. . TCS ve ısıtmalı Tyrodes tampon (adım "2," yukarıda) Not hazırlık başlar: "ASR-tampon" ve "kontrol tampon" çözümleri 50 ° C ve için karıştırın ulaşana kadar bir sonraki adıma (IgE maruz kalma) başlamayın 90 dakika ısı / karıştırma zaman ilk 70 dk.
  6. Her iki çözüm de 70 dakika boyunca 50 ° C'de karıştırıldı, bir kez (her çukura 100 ul /) duyarlı olması örnek kuyu RBL ortam içinde 0.1 ug / ml fare anti-DNP IgE (Sigma) oluşturur. 4 de saklandığında IgE stok 30 günden eski olmamalıdır ° C; hisse senedi ne kadar eski kayıt. Karıştırmak için Flick, ama girdap değil IgE yapmak.
  7. Bir TC Kaputun altında,50 ml'lik bir tüp içinde 6 ml RBL medyaya 0.6 ul IgE stok (stok 1 mg / ml 'dir) ekleyin. Ikinci bir 50 ml tüp içinde, sadece basit RBL ortam (nonsensitized örnekler için amaçlanan) 6 ml eklenir.
  8. Lavaboya 96-plaka (Gün 1 hazır olduğunu) tüm medya dökümü ve TC başlık altında plaka getirmek.
  9. Rastgele 100 ul medya / (48 kuyu toplam) teşvik edilmelidir kuyulara IgE karışımı ekleyin. Bu karışım "TX," ve "arka plan" örnekleri, "spontan" için tasarlanmamıştır.
  10. Rasgele sadece spontan "TX," "," ve "arka plan" kuyulara 100 ul düz RBL medya ekleyin.
  11. Plaka üzerinde plaka kapağı yerleştirin ve sonra 1 saat 2/37 ° C inkübatör% 5 CO içine plaka taşıyın.
  12. 3,24-1 saat İnkübasyon sırasında, adımları 3.13 izleyin.
  13. Masa üstü, antijen dilüsyonları hazırlamak. 1.6 mg / ml stok DNP-BSA + 850 ul & # 0.53 ul ekleyin160; BT 1 ug / ml 'lik bir antijen konsantrasyonu alır. Vortex ve karıştırmak için bu stok ters.
  14. Bir kez "TCS-tampon" ve "kontrol tampon" ısıtılmış ve sonra 50 90 dakika karıştırılır ° C, (adım 2.6 gidin - 2.8.1) TCS protokolü için hazırlık geri kalanı ile devam. Her iki çözüm de BSA içinde eritildi, sonra, aşağıda devam ediyor.
  15. ± Ag, ± TCS ile, pozlama tamponlar hazırlanmaya başlayacak. İlk olarak, "TCS-tampon" çözeltisi (önceden 90 dakika boyunca ısıtıldı ve oda sıcaklığında karıştırıldı edilmiş olan), yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml transfer 249 ml örnek. Bu 50 ml bir örnek 20 ul çıkarın ve 0.0004 mg / ml DNP-BSA nihai bir antijen konsantrasyonu için daha önce hazırlanan 1 ug / ml antijen 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters.
    1. Etiket bu "Tüp 1, Yüksek TCS / + Ag + / BT." Bu seyreltmeler ve en yüksek maruz kalma TCS konsantrasyon için kullanılır.
  16. "Kontrol tamponu" çözeltinin 249 ml'lik bir numune, yeni bir 50 ml tüp 50 ml aktarın. Bu yeni bir 50-ml bir örnek 20 ul çıkarın ve 0.0004 mg / ml DNP-BSA nihai bir antijen konsantrasyonu için daha önce hazırlanan 1 ug / ml antijen 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters.
    1. Etiket bu "Metro 2, No TCS / + Ag + / BT". TCS seyreltme ve 0 mcM TCS konsantrasyon maruz kalma için kullanılır.
  17. Şimdi "TCS-tampon" çözüm 50 ml almak ve başka bir 50 ml tüp içine yerleştirilmiş. Bu yeni 50-ml kısım 20 ul çıkarın ve düz BT 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters. Resim antijen eklenir.
    1. Bu "Metro 3, Yüksek TCS / No Ag / + BT." Bu arka plan için kullanılır. Etiket
  18. Başka bir 50 ml tüp "kontrol tamponu" 50 ml aktarın. Bu ne 20 ul çıkarın w 50-ml kısım ve düz BT 20 ul ile değiştirin. Vortex ve ters. (Yok Ag eklenir.)
    1. Bu "Metro 4, No TCS / Hayır Ag / + BT." Bu arka plan ve spontan örnekleri için kullanılır. Etiket
BSA TCS Antijen
Tüp 1 figure-protocol-2 Yüksek [] figure-protocol-3
Tüp 2 figure-protocol-4 NO figure-protocol-5
Tüp 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" "15px /> Yüksek [] NO
Tüp 4 figure-protocol-6 NO NO
  1. Hesaplayın ve "TCS-tampon" stok konsantrasyonu belirlendikten sonra seyreltme için hacimleri kaydedin. Her bir seyreltme konsantrasyonu için toplam hacmi 1 ml olmalıdır ve steril mikrosantrifüj tüpü içinde hazırlanmalıdır. Kalibre P2 ve P1000 Pipetman kullanın.
Konsantrasyon Yüksek Triklosan + Tyrodes + BSA 0,0004 mg / ml Ag
(Yukarıda Tüp 1) 		BT 0,0004 mg / ml Ag Isıtmalı
(Yukarıda Tüp 2)
20 mcM
15 mcM
10 mcM
5 mcM
1 mcM
0.1 mcM
0.001 mcM
0 mcM (plaka üst) ----------------------- 500 ul artı bir 500 ul
0 mcM (plaka alt) ----------------------- 500 ul artı bir 500 ul
  1. 1-saat IgE kuluçka sonra, kuluçka plaka almak ve lavabo içine tüm medya atmak. (Not: Test kimyasallar tüketici ürünü TCS daha zehirli olduğu bilinen ise, tehlikeli atık bertaraf gerekli olabilir.)
  2. Bir Combitip kullanarak, rastgele BSA uğratılmış Tyrodes tamponu (200 ile 96 oyuklu plaka yıkama hücreleriiyi / ul). Ekli hücre rahatsız etmemek için, daha çok doğrudan bitişik hücreler üzerine daha kuyu dökülen yıkama tamponu ile bırakın. Işlem bir kez daha tekrarlayın.
  3. Uygulama, girdap için tedavi hazırlamak ve sağ plaka ek önce seyreltme ters çevirmek için.
  4. Levhanın üst bölümü ile başlayarak: Rasgele karşılık gelen oyuklara 200 ul antijen solüsyonların her (ASR doğru konsantrasyonda) triplicates ekleyin. Plaka altına devam edin. Plaka üzerindeki tüm "alay" için "kontrol tampon" çözüm artı Ag (yukarıda "Metro 2") ekleyin.
  5. Karşılık gelen kuyulara uygun çözümler 200 ul ekleyin:
    1. % 0.2 Triton X-100, "TX" ile-belirlenmiş bir kuyu 200 ul ekleyin.
    2. Daha sonra, "Arkaplan (BkgD)-Yüksek TCS" plaka üzerinde etiketli 3 kuyulara Tüp 3 200 ul ekleyin.
    3. Son olarak, 200 ulTüp 4 ila 6 kuyu "Spontan." etiketli
  6. 37 ° C /% 5 CO2 içinde 1 saat boyunca inkübe plakası.
  7. 1 saat inkübasyon sırasında: buz iki kova (inkübatör "eski" plaka için bir ve yeni plaka için) alın. Çözülme 4-methylumbelliferyl-N-asetil-beta-D-glucosaminide oda sıcaklığında (4-MU) için bu hassas hafif olduğu için folyo tutarak 40 dakika, için.
    1. Bir kez 4-MU stok çözülmüş olduğu, 4-MU çalışma çözüm oluşturan: 150 ul stok + soğuk asetat tampon 14.85 ml (tabloda verilen reçete); girdap ve ters. Folyo ile sarılmış bir 50 ml santrifüj tüpüne, ve kullanılana kadar buz üzerinde tutun.
    2. Combitip kullanarak, rastgele bir YENİ Grenier siyah 96-plaka (buz kovası # 2) her bir kuyunun en alt içine 100 ul soğuk 4-MU çalışma çözeltisi ekleyin. Rastgele Triton X-100 kuyu içinde, rastgele plakasının alt içinde, plakanın üst içinde rasgele çalışma çözeltisi ekleyerek, ilk başlangıçve son olarak rastgele arka kuyu içinde.
    3. Sonraki adım için P200 ipuçları yeni bir kutu almak.
  8. 1 saatlik inkübasyon sonunda, için iyi dolaşma, aşağı (yavaşça, kabarcıkları tanıtan değil) 4-5x buz kovası içerisinde 1., pipet süpernatant kadar ve üzerine inkübatör hücre plaka koymak karıştırma iyi ama karıştırma sırasında hücreleri dokunmadan değil . Sistematik, substrat (örneklerin aynı sipariş, orijinal olarak planlanmış) ile yeni plaka her iyi ve yerden 25 ul örnek almak. Zaman yeni kuyuda kabarcıkları tanıtan olmadan, iyice örnek karıştırmak için aşağı yukarı pipet ve.
  9. 37 ° C /% 5 CO2 30 dakika süreyle inkübe edin.
  10. 30 dakika inkübasyondan sonra, rastgele 325 ul toplam kuyu doldurmak için de başına soğuk glisin-karbonat tampon 200 ul (Combitip kullanarak) ekleyin. (Triton X-100 yayılma önlemek için, Triton X-100 örnek için bu ek son olun). (Temiz P10 pipet ile körü okuma plaka önce kabarcıkları olup olmadığını kontrol edinte ucu) herhangi bir kabarcıklar pop.
  11. Floresan plaka okuyucu (Bölüm 4 gidin) olarak plaka çalıştırın.

2. GÜN:

4. Floresan Plaka Okuyucu Talimatları ve Veri Analizi

  1. Gen5 programı ve açık deneme bölümü açın.
  2. Plaka okuyucu ve eklemek plaka (sol üst köşede A1) açın.
  3. Protokol figure-protocol-7 Prosedür figure-protocol-8 Özel okuma ayarlamak için okuyun. Her kuyudan ham floresan veri toplamak amacıyla örnekleri hakkında bir şey, çoğaltır, vb eklemeyin.
  4. En iyi% 50: Altında ", Normal Hızlı" "," ", floresan" "Kazanç 40," "Uyarma 360/40," "Emisyon 460/40," Optik konumu Endpoint seçin "oku". Optik Top ofset: 7mm. Hayır sallamak, gecikmesiz, kinetik, iyi herhangi bir monitör, sıcaklık: inkübatör kapalı.
  5. Düz siyah alt, (Grenier 96-, Düz Tabanlı) plaka 96-seçin.
  6. Plaka düzeni ile anlaşma: Protokol figure-protocol-9 plaka düzeni. Tekrarlar, seyreltme, vb gösteren olmadan örnekleri kurun
  7. Plaka figure-protocol-10 okuyun.
  8. Dosyaya Kaydet: Excel'e veri dosyası ihraç edecek "Excel" düğmesini tıklatın. Plaka düzeni için ve matris için yapın. Bilgisayarda ve bir USB sürücü üzerinde dosya kaydedin.
  9. Excel'de, Triton X-100 kuyu dahil olmak üzere her örnekten ortalama arka plan okuma, çıkarma.
  10. Ortalama Triton X-100 değeri ile her değer (zaten arka plan çıkarılır vardı olan) bölünmesiyle göre% degranülasyonunun hesaplayın, ve sonra bir yüzde yapmak için 100 ile çarpın.
  11. Ortalama tüm triplicates ve standart sapma hesaplamak. Olarak excel grafik veri değerleri ± standart sapma. Istatistiksel test için, GraphPad tarafından Prism yazılımı şimdi hareket.

2. GÜN:

5. RBL-2H3 Hücreler kullanarak İyonofor Uyarılmış Degranülasyon Testi

  1. "Hücrelerin hazırlanması" için protokol (Bölüm 1, Gün 1) ve "triklosan hazırlanması" (Bölüm 2, 2. Gün) izleyin, yukarıda talimat verdi. Iyonofor uyarılması için plaka düzeni örnek aşağıda gösterilmiştir.
Tedavi Triplicates
Uyarılmış, 0 mcM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Uyarılmış, 0.001 mcM TCS F6, G6, H6
Uyarılmış, 0.01 mcM TCS F3, G3, H3
Uyarılmış, 0.1 mcM TCS A4, B4, C4-
Uyarılmış, 1 mcM TCS A6, B6, C6
Uyarılmış, 5 mcM [TCS F5, G5, H5
Uyarılmış, 10 mcM TCS A3, B3, C3-
Uyarılmış, 15 mcM TCS A5, B5, C5
Uyarılmış, 20 mcM TCS G7 F7, H7
DMSO, hiçbir TCS ile, Spontan (alay içerir) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100 DMSO ile, herhangi bir TCS D10, D11, E10 D12, E11, E12
Hiçbir hücre arka plân, DMSO ile, ayrıca yüksek [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

figure-protocol-11
Büyük resim görmek için buraya tıklayın .

  1. Başlamadan önce, kullanılan tüm tamponların pH kontrol, ve Parçalı değildir emin olun. Tyrodes, sodyum asetat tamponu ve glisin karbonat tamponu (tarifler tabloda verilmektedir).
  2. 50 ml tyrodes tampon için 0.05 g BSA ekleyerek ve iyice karıştırın için vorteks BT biri 50 ml konik tüp hazırlayın. 37 ° C su banyosunda inkübe edin.
  3. % 10 Triton X-100-4,704 mi BT 96 ul ekleyerek% 0.0032, DMSO (nihai kalsiyum iyonofor araç konsantrasyonu) ile% 0.2 Triton X-100 olun. İyice karıştırın. Daha sonra, bu çözüm 0,155 ul almak ve atın. Şimdi% 100 DMSO 0,155 ul geri ekleyin.
  4. Iyonofor şişenin içine taze,% 100 DMSO içinde 400 ul ekleyerek ve karıştırmak için, vorteks tozundan A23187 iyonofor bir 5 mM stok (2.5 mg / ml) hazırlayın. Sonra çözelti içinde,1.5-ml konik tüp, kayıt içeriği ve bugünün tarihini ve son kullanma (hazırlık itibaren 3 ay -20 ° C'de depolandığında) transfer.
    1. Alternatif olarak, buz üzerinde bugün dondurulmuş stok kullanıyorsanız, çözülme ve 5 mM A23187 iyonofor iyi karışık ve net olduğunu kontrol edin. Vortex, fiske ve kullanmadan önce bu hisse ters. # Bu A23187 hazırlanması ve Lot Kayıt tarihi.
  5. Bir kez "TCS-tampon" ve "kontrol tampon" ısıtılır ve 90 dakika karıştırılır edilmiş, TCS protokolü (adım 2.6-2.8.1 gidin) için hazırlık geri kalanı devam. BSA hem çözümler iyice karıştırılır sonra, kalan protokol adımlarla devam edin.
  6. "ASR-tampon" çözüm 249 ml örnek, yeni bir 50 ml konik tüp 50 ml aktarın. 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve 5 mM iyonofor stokunun 1.8 ul ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters. Nihai iyonofor konsantrasyonu 1, 80 nM. A23187 bu konsantrasyon stok gücüne bağlı olarak değişir ve unutmayın bir A23187 iyonofor doz tepkisi RBL-2H3 bir sitotoksik olmayan olarak tanımlanmıştır yaklaşık% 20 maksimum salım, bir degranülasyonu düzeyde ortaya çıkarır A23187 'lik bir konsantrasyon tespit etmek önerilir sitotoksisite deneyi ile hücreler (2).
    1. Etiket bu "Metro 1, Yüksek TCS / + İyonofor / + BT." Seyreltme ve yüksek TCS konsantrasyon maruz kalma için kullanılır.
  7. "Kontrol tamponu" çözeltinin 249 ml'lik bir numune, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml aktarın. 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve 5 mM iyonofor stokta 1.8 ul geri ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters. Nihai iyonofor konsantrasyonu 180 nM'dir.
    1. Etiket bu "Metro 2, No TCS / + İyonofor / + BT." Bu seyreltme ve 0 mcM TCS konsantrasyonları için kullanılır.
  8. R 249 ml örnek 20; TCS-tampon "çözelti, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml aktarın. Yeni 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve% 100 DMSO 1.8 ul ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters, hiçbir iyonofor eklenir.
    1. Etiket bu "Metro 3, Yüksek TCS / No İyonofor / + BT / + DMSO", arka plan için kullanılır.
  9. "Kontrol tamponu" çözeltinin 249 ml'lik bir numune, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp 50 ml aktarın. Yeni 50 ml kısım 1.8 ul çıkarın ve% 100 DMSO 1.8 ul ekleyin. Vortex 8 saniye 3x ve 3x ters. Resim İyonofor eklenir.
    1. Etiket bu "Metro 4, TCS / No İyonofor / + BT / + DMSO Hayır"; kendiliğinden serbest örnekleri için kullanılır.
BSA TCS İyonofor Eklendi% 100 DMSO
Tüp 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Yüksek [] figure-protocol-12 NO
Tüp 2 figure-protocol-13 NO figure-protocol-14 NO
Tüp 3 figure-protocol-15 Yüksek [] NO figure-protocol-16
Tüp 4 figure-protocol-17 NO NO eck işareti "fo: içerik-width =" "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" "15px /> .1
  1. Hesaplayın ve "TCS-tampon" stok konsantrasyonu belirlendikten sonra seyreltme için hacimleri kaydedin. Kalibre P2 ve P1000 Pipetman kullanın. Her bir seyreltme konsantrasyonu için toplam hacmi 1 ml olmalıdır ve steril mikrosantrifüj tüpü içinde hazırlanmalıdır:
Konsantrasyon Yüksek Triklosan + Tyrodes + BSA +180 nM A23187 (yukarıdan Tüp 1) BT +180 nM A23187 (yukarıdan Tüp 2) Isıtmalı
20 mcM
15 mcM
10 mcM
5 mcM
1 mcM
0.1 mcM
0.001 mcM
0 mcM (plaka üst) ---------------------------------- 500 ul artı bir 500 ul
0 mcM (plaka alt) ---------------------------------- 500 ul artı bir 500 ul
  1. Kuluçka dün kaplama hücreleri, ve lavabo içine medya boş alın. Bir Combitip kullanarak, rastgele BT (200 ul / çukur) ile 96 oyuklu plaka yıkama hücreleri. Yıkama ikinci kez tekrarlayın.
  2. Uygulama, girdap için tedavi hazırlamak ve sağ plaka ek önce seyreltme ters çevirmek için. Plakanın üst kısmında başlayarak: Rasgele correspo 200 ul triplicates TCS doğru konsantrasyonu her ekleyiniyi nding. Plaka altına devam edin. Plaka üzerindeki tüm "alay" için "kontrol tampon" çözüm artı A23187 (yukarıda "Metro 2") ekleyin.
  3. Karşılık gelen kuyulara uygun çözümler 200 ul ekleyin:
    1. % 0.2 Triton X-100, "TX" ile-belirlenmiş bir kuyu 200 ul ekleyin.
    2. Daha sonra, "Arkaplan (BkgD)-Yüksek TCS" plaka üzerinde etiketli 3 kuyulara Tüp 3 200 ul ekleyin.
    3. Son olarak, etiketli Tüp 4 ila altı kuyu 200 ul ekleyin "Spontan."
  4. 37 ° C /% 5 CO2 içinde 1 saat boyunca inkübe plakası.
  5. 1 saat inkübasyon sırasında: buz iki kova (inkübatör "eski" plaka için bir ve yeni plaka için) alın. Çözülme 4-methylumbelliferyl-N-asetil-beta-D-glucosaminide oda sıcaklığında (4-MU) için bu hassas hafif olduğu için folyo tutarak 40 dakika, için.
    1. Bir kez 4-MU stok çözülmüş olduğu, 4-MU çalışma soluti oluşturantarih: 150 ul stok + soğuk asetat tampon 14.85 ml (tabloda verilen reçete); girdap ve ters. Folyo ile sarılmış bir 50 ml santrifüj tüpüne, ve kullanılana kadar buz üzerinde tutun.
    2. Combitip kullanarak, rastgele bir YENİ Grenier siyah 96-plaka (buz kovası # 2) her bir kuyunun en alt içine 100 ul soğuk 4-MU çalışma çözeltisi ekleyin: üst içinde rastgele çalışma çözüm ekleyerek ilk başlangıç rastgele rastgele Triton X-100 kuyu içindeki plakanın alt, içinde ve son olarak rasgele arka kuyu içinde levha, s.
    3. Sonraki adım için P200 ipuçları yeni bir kutu almak.
  6. 1 saatlik inkübasyon sonunda, karıştırma iyi ama hücreleri dokunmadan karıştırma süre için de dolaşma, aşağı (yavaşça, kabarcıkları tanıtan değil) 4-5x buz kovası içerisinde 1., pipet süpernatant kadar ve üzerinde inkübatör hücre plaka koymak . Sistematik, sa alt tabaka (aynı sipariş ile yeni plaka her iyi ve yerden 25 ul örnek almakmples, orijinal olarak) planlanmış. Zaman yeni kuyuda kabarcıkları tanıtan olmadan, iyice örnek karıştırmak için aşağı yukarı pipet ve.
  7. 37 ° C /% 5 CO2 30 dakika süreyle inkübe edin.
  8. 30 dakika inkübasyondan sonra, rastgele 325 ul toplam (Triton X-100, yayılma önlemek için, son Triton X-100, örnekler bu ek yapmak) kuyu doldurmak için göz başına 200 ul soğuk glisin-karbonat tamponu (Combitip kullanarak) ekleyin. Okuma plaka önce kabarcıklar (herhangi bir kabarcıklar pop temiz P10 pipet ile körü) olup olmadığını kontrol edin.
  9. (Bölüm 4 tüm adımları izleyin) floresan plaka okuyucu plaka çalıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

50 kadar ısıtıldığında ° C de 90 dakika boyunca, ASR UV Vis absorbans spektrumu Şekil 1 'de gösterilen, 280 nm'de bir zirve ile yaklaşık 260 ve 300 nm arasında güçlü, hafif bir eğri, üretir. 280 nm Molar soğurma katsayısı yayınlanan 4,200 L / mol / cm 12 olduğu için UV-VIS spektrofotometresi, bu nedenle, konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilecek önemli bir araçtır. Biz TCS 50 ° C ısıtma (veriler gösterilmemiştir) ardından, tüm degranülasyonunun deney zaman dilimi içinde çözüm dışarı düşmemesi buld...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

2004 yılında, Naal ve ark. 1 degranülasyonu yüksek verimlilik testleri için bir mast hücre biyosensör geliştirildi. Bu bizim TCS çalışmaları için uyarlanmış ve bu video ayrıntılı var ki sağlam bir testtir. Önceki Naal ve ark. 1 denemesi, mast hücre degranülasyonu rutin olarak β-heksosaminidaz 59-61 ile değerlendirilir, ancak bu yöntemler, bir erken örnekleme bir anda okunur edildiği Fluorometreler faydalanılmıştır. Önemli olarak, Naal ve ark. onların bir mikro okuyucu kullanarak da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

LMW ve RHK Biyomedikal Bilim ve Mühendislik (GSBSE) bir sources en Enstitüsü tarafından desteklenir; RHK de Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu tarafından desteklenmiştir. Ek finansman Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIH P20-GM103423), Maine Tarım ve Orman Experiment Station (Grant sayısı ME08004-10, Jag), Tide Merkezi (NSF Grant # 1.008.498) Rising Maine ADVANCE Üniversitesi tarafından sağlandı ve phrma temel (Jag) den Farmakoloji / Toksikoloji bir Araştırma Başlatan Grant. Biz Dr teşekkür ederim. Antijen ve hücreler David Holowka ve Barbara Baird. Biz Hina Hashmi, Alejandro Velez ve ekipman ve emirleri ile yardım için Andrew Abovian minnettarız. Bu Maine Tarım ve Orman Deneme İstasyonu yayın sayısı 3311 olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar

RBL-2H3 Cells

ATCC

CRL-2256

Kullandığımız hücreler bir hediyeydi, ancak ATCC'den de temin edilebilirler<

>

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Düşük nemli bir ortamda saklanmalıdır

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Fetal Boval Serum

Atlanta Biologicals

S11150

Gentamisin Sülfat

Lonza Biological Sciences

17-518

Albumin, Bovine Serum

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; %10 çözüm)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Fırıncı

4153-01

CAS# 75277-39-3

Magnezyum Klorür

VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glukoz

Biyomedikaller

152527

CAS# 50-99-7

Potasyum Klorür Kristali

J.T Fırıncı

3046-01

CAS# 7447-40-7

Kalsiyum klorür dihidrat

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glisin

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-asetil-β-D-glukozaminid (4-MU)

EMD Biyolojik Bilimler

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

Folyoya sarın – ışığa duyarlıdır

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

Reaktifin konsantrasyonu 1 mg/ml'dir. Alikot 25 &mikro; l  reaktifi ayrı mikrosantrifüj tüplerine ve Parafilm'e yerleştirin. Alikotları -20 ° C'de saklayın; Kullanılmayan C ve 2-8 derecede kullanılan alikotu saklayın; 1 aydan daha uzun olmamak üzere C.

DNP-BSA

Cornell Üniversitesi'nden Dr. David Holowka ve Dr. Barbara Baird'den hediye

Öneri: yaşam teknolojileri DNP-BSA kataloğu# A23018

Kalsiyum İyonofor A23187

Sigma

C75-22-1mg

Ionophore, 400 µ eklenerek bir tozdan yapıldı; l  iyonofor şişesine taze% 100 DMSO ve -20 ° C'de tutulur; C

Not: iyonoforu 3 aylık son kullanma tarihinden başarıyla sonra kullandık

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Asetik Asit

VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

Susuz Sodyum Karbonat

Sigma

222321

CAS # 497-19-8

Sodyum Klorür

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Hidroklorik Asit

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Referans Tamponu, pH 7

VWR

BDH5046

Referans Tamponu, pH 10

VWR

BDH5072

Referans Tamponu, pH 4

VWR

BDH5018

pH elektrodu depolama çözümü

VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 Spektrofotometre

Beckmann

Artık satılmadı

Synergy 2 plaka okuyucu

Gen5 Mikroplaka Veri Toplama ve Analiz Yazılımını Kullanır

BioTek

Modül S

Hematocytometer

Hausser Scientific

3110

7 x  7 CER HOT/STIR, 120 V

Kombinasyon sıcak plaka/manyetik karıştırma plakası

VWR

97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

Doku kültürü su banyosu

VWR

Model# 89032-206

Doku Kültürü biyolojik güvenlik kabini

SafeGARD (TC davlumbaz)

Fırıncı Şirketi

Model# SG403A-HE

Doku kültürü inkübatörü

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWR

Aralık: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

pH metre

Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Combitip dağıtıcı

Eppendorf

4981 000.019

Recipes:

Asetat Tamponu, pH 4.4

0.12 M asetik asit yapın ve 10 N NaOH ile pH 4.4'e titre edin. Bu, 1 L MilliQ suya 5,3 ml buzlu asetik asittir: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml, çünkü buzulun yoğunluğu 1,37 g/ml'dir

Otoklavlanmış cam şişeye steril filtre

Substrate (4-MU)

Sigma M-2133, 250 mg, C < altı > 18 < / alt >H < alt > 21 < / alt > NO < alt > 8 < / alt >, FW 379.4 CAS (37067-30-4) -20 derece saklayın; C Stok: DMSO'da 0.12 M (1 ml DMSO'da 46 mg), 37 °C'ye kadar sıcak; C, girdap, sonikat 10 dk. ılık su ile su banyosu sonikatöründe, tekrar girdap

Her deney için, asetat tamponunda 1.2 mM'lik nihai konsantrasyon için asetat tamponunda (100x seyreltme) taze substrat çözeltisi yapın< / p>

Glisin Karbonat Tamponu, pH 10< / p>

26.7 g glisin 47.1 g susuz sodyum karbonat 1 L için deiyonize su ekleyin, ve pH'ı 10

Steril filtreyi otoklavlanmış cam şişeye

Tyrodes (2 L), pH 7.4

135 mM NaCl: 15.78 g (veya 270 ml 1 M) 5 mM KCl: 10 ml 1 M stok 1.8 mM CaCl2: 7,20 ml 0,5 M stok 1 mM MgCl2: 4,00 ml 0,5 M stok 5,6 mM glikoz: 2,02 g (11,2 ml 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml 1 M stok ~ 9.7-7.4

align="center">Otoklavlanmış cam şişeye steril filtre

RBL Cell Media

Fetal sığır serumunu çözün (FBS, -20 ° C'de saklanır; C) 37 &°C'de yaklaşık 4 saat; C su banyosu Standart steril tekniği takip edin L-glutamin ile (Earle' ile) 1 L minimum esansiyel ortam (MEM) çıkarın 800 ml MEM elde etmek için biraz MEM dökün, 200 mL ılık FBS ekleyin Steril pipet ile 1 L ortama 1 ml gentamisin sülfat antibiyotik ekleyin Sadece otoklavlanmış ve yalnızca hücre kültürü kullanımı için işaretlenmiş ortam şişelerini kullanın.

Steril filtre (0,2 mm) otoklavlanmış cam şişeye

Kullanılan plastik malzeme:

200 µ l  96 raflı tek kullanımlık steril pipet uçları

VWR

53509-009

polipropilen

1.000 &mikro; l  HighRecovery

VWR

89003-420

polietilen

10 µ l  mikro uç düşük bağlayıcı steril

VWR

14217-704

polipropilen

Yüksek G kuvveti için tek kullanımlık/konik mikrosantrifüj tüpleri

VWR

20170-038

polipropilen

Tek kullanımlık/dereceli/konik/steril 50 ml  vidalı kapaklı santrifüj tüpleri

VWR

21008-178

polipropilen

Tek kullanımlık/dereceli/konik/steril 15 ml  vidalı kapaklı santrifüj tüpleri

VWR

21008-103

>

polipropilen

CELLSTAR Doku Kültürü İşlem Görmüş T-25 Filtre Kapaklı Şişe

Greiner Bio One

690175

polistiren

CELLSTAR Doku Kültürü İşlem Görmüş T-75 Şişesi, Filtre Kapaklı

Greiner Bio One

658175

polistiren

CELLSTAR 10 ml  Kağıt/Plastik Sarılı Serolojik Pipet

Greiner Bio One

607180

polistiren

CELLSTAR 2 ml  Kağıt/Plastik Sarılı Serolojik Pipet

Greiner Bio One

710180

polistiren

CELLSTAR 5 ml  Kağıt/Plastik Sargılı Serolojik Pipet

Greiner Bio One

606180

polistiren

CELLSTAR 25 ml  Kağıt / Plastik Sarılı Serolojik Pipet< / p>

Greiner Bio One

760180

polistiren

1 cm küvet

N/A

N/A

polistiren

CELLSTAR, 96W Mikroplaka, Doku Kültürü İşlemli, Siyah, Kapaklı

96 oyuklu Plaka

Greiner Bio One

655086

polistiren

Combitips

Eppendorf

022266501

Polipropilen/

polietilen

Kaynaklar

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861(1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937(2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

RBL-2H3 HücreleriTriklozan AnaliziMikroplaka FloresansıBeta HegzosaminidazUV-Vis SpektrofotometrisiSulu Çözelti HazırlamaKalsiyum İyonofor StimülasyonuAntijen SensitizasyonuYüksek Kapasiteli Tarama
Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.