Transsinaptik Kolera Toksin ve Biotinlenmiş Dekstran Aminler Çift Etiketleme Ardından Pseudorabies'e Virüs ile Periferik Hedefler gelen İzleme

Özet

Transsinaptik izleme, çoklu sinaptik devreler aracılığıyla periferik hedefleri düzenleyen merkezi eferentleri analiz etmek için güçlü bir araç haline gelmiştir. Burada, işlevsel bir beyin devresini tanımlamak ve lokalize etmek için transsinaptik psödorabies virüsünü kullanan bir protokol sunuyoruz, ardından tanımlanmış nöron grupları arasındaki devredeki belirli bağlantıları doğrulamak için klasik yol izleme teknikleri sunuyoruz.

Özet

Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV) ¹ kullanılarak beyinde kullanılmaktadır. PRV insanlar dahil olmak üzere büyük maymunları enfekte etmez, bu yüzden en yaygın küçük memeliler, özellikle kemirgenler üzerinde çalışmalarda kullanılmaktadır. Pseudorabies zorlanma PRV152 gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) raportör geni ifade ve sadece retrograd uzak enfeksiyon sitesinden ^2,3 sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi ile fonksiyonel sinapsların geçer. Diğer PRV suşları farklı mikrobiyolojik özelliklere sahip ve her iki yönde (PRV-Becker ve PRV-Kaplan) ^{4,5 'de} taşınabilir. Bu protokol PRV152 münhasıran ele alacağız. Böyle kas gibi, periferik yerinde virüsü teslim ederek, t içine virüsün girişini sınırlamak mümkündürnöronların belirli bir set üzerinden beyni. Beyin boyunca eGFP sinyalinin elde edilen şablon, bu durumda başlangıçta enfekte olan hücrelere bağlı nöronların giderir. Pseudorabies virüs transsinaptik izleme dağıtık yapısı zor bir tanımlanmış bir ağ içinde belirli bağlantı yorumlama yapar, biz kullanılarak tespit hücreleri arasındaki bağlantıları teyit için biyotinli dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak hassas ve güvenilir bir yöntem sunmak PRV152. Onlar uzak dendritler ^6-11 olmak üzere hücresel süreçleri ortaya etkilidir çünkü peroksidaz ve DAB (3, 3'-diaminobenzidin) ile BDA ve CTB immunokimyasal tespiti seçildi.

Giriş

Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın, özellikle zayıflatılmış suş PRV-Bartha ilk kez 1961 yılında açıklanan domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV), kullanılarak kemirgen beyinde kullanılmaktadır ^12. Burada, belirli kasların motor kortikal temsilini belirlemek için bir protokol mevcut veya gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) raportör geninin ² eksprese eden bir rekombinant pseudorabies virüs suşu (PRV152) ile kas grupları. Açıklanan yöntem çapraz sinaps fonksiyonel devre ^3,4,13 içindeki diğer nöronlar bulaştırmak için bu bulaşıcı döl üreten nörotropik virüsler, davranışını patlatır. PRV-Bartha ile izojenik olan PRV152, sadece uzak enfeksiyon sitesinden ^{3,5 retrograd sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi boyunca sinaps haçlar/ sup>. Tam olarak enfeksiyonun periferal sitesi kontrol edilmesiyle motor nöronların spesifik bir alt kümesi üzerinden beyne virüs girişini sınırlamak mümkündür. Virüs sırayla bağlı nöronların zincirlerini bozar gibi, beynin boyunca eGFP sinyalinin ortaya çıkan desen sonra başlangıçta enfekte hücrelere bağlı olan nöronların ağı çözecektir.}

Nöral izleme için virüs kullanılarak bir başka avantajı, enfekte olmuş hücreler içinde raportör proteininin (bu durumda EGFP) amplifikasyonu olup. Bu sinyal amplifikasyon bile seyrek projeksiyonlar algılanmasını sağlar duyarlılık düzeyi sağlar. Örneğin, bıyık kontrol yüz motor nöronlara bıyık motor korteks bir seyrek projeksiyon viral ifade yeşil flüoresan protein ¹⁴ ile sıçanlarda bulundu; önceki çalışmalar raportör gen amplifikasyonu ^11,15 olmadan klasik izleyiciler kullanarak bu projeksiyonu bulamadılar. Ne yazık kiBirçok viral izleme vektörleri belirtilen çalışmada kullanılan gibi, bu şekilde, çok-sinaptik devreleri izlemek için kullanımlarını sınırlamaktadır sinaps geçmez.

Motor devresinde katılan hücrelerin ağını tanımlamak için farklı avantajlar sunarken, transsinaptik dağıtık yapısı PRV-152 zorlu devre içinde belirli bağlantıları yorumlama yapar ile izleme. Bu nedenle, biz biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak çift etiketleme PRV-152 kullanılarak tespit devreler içinde belirli bağlantıları doğrulamak için basit bir yöntem mevcut. BDA ve CTB kombine kullanımının nöronlar ^6-8,11 özel setler arasındaki bağlantıları izlemek için köklü bir yaklaşımdır. Birlikte kullanıldığında, bu iki izleyiciler iki renkli DAB (3, 3'-diaminobenzidin) prosedürü ¹⁶ kullanarak aynı bölümünde görülebilir. Yüksek molekül ağırlıklı BDA (BDA10kDa) bu protokol için seçildi bu y çünkünöron ^6,7,9 ayrıntılı etiketleme ields. BDA10kDa diğer avantajları arasında aşağıdakiler bulunmaktadır: bu tercihan anterograd yönünde ^6-8 taşınır; o iyontoforetik veya basınçlı enjeksiyon ^6-8 teslim edilebilir; basit bir avidin biotinillenmemiş HRP (ABC) prosedürü ¹⁷ tarafından görüntülenmiştir olabilir; ve ışık veya elektron mikroskobu ^6,7,18 tarafından görüntülenebilir. Distal dendritler ^10,19 gibi hücresel süreçleri ortaya çıkartılmasında etkili olduğu için peroksidaz ve DAB ile CTB immünokimyasal algılama motor nöronlar retrograd etiketlenmesi için seçildi. Biz son zamanlarda farelerde vokal motorlu yolu belirlemek ve daha önce ²⁰ eksik olarak kabul edildi laringeal motor nöronların, primer motor korteks gelen seyrek bir bağlantı ortaya çıkarmak için bu yaklaşımı kullanılır.

Protokol

NOT: Tüm hayvan prosedürleri gözden geçirilecek ve Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Depolama Pseudorabies'e Virüs

1. Biz 1 x 10 ⁹ pfu / m titrede Princeton Üniversitesi'nden Dr. Lynn Enquist laboratuvar canlı virüsü (PRV152) edinin. Virüs üretmek için bir protokol ² yayımlanmıştır.
2. Uygun biyogüvenlik koşulları altında -80 ° C'de BSL-2 biyogüvenlik kabini ve mağaza içindeki tüp başına 20 ul virüs alikotu.
3. Hemen enjekte önce PRV bir kısım çözülme.

Muscle içine Enjeksiyonlar 2. Cerrahi Hazırlık

1. (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak.
2. Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun.
3. T hazırlayınsaç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile cerrahi siteyi dezenfekte tarafından aseptik tekniğe uygun diye cerrahi alan. Cerrahi alanları kapsayacak şekilde steril örtüler kullandığınızdan emin olun. Prosedürler boyunca steril tekniklere uymak için emin olun.
4. Bir cilt kesi yapmak ve ilgi kas ortaya koymaktadır. Örneğin, ilk sternohyoid kas örten kısmını çıkarmak için gerekli olan krikotiroid gırtlak kası erişmek için.
5. VetBond doku yapıştırıcısı ile herhangi transected kasları kapatın.

Muscle içine PRV 3. Enjeksiyon

1. 34 G paslanmaz çelik iğne takın, taze çözülmüş PRV çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin.
2. Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikroenjektör ucu çıkar doğrulayın. Bioharzard atık olarak sıvı atın.
3. Bir stereotaksik microp kullanılmasıositioning cihazı dikkatlice ilgi kasına mikroenjektör ucu yerleştirin ve hafif şişlik görülebilir olana kadar yavaş yavaş kas doldurun. Kas ve birimin boyutuna bağlı olarak değişir enjeksiyon oranı enjekte edilecek. Örneğin, 4 nl / sn bir hızda 200 nl (1 ul toplam) beş enjeksiyonları krikotiroid kas doldurmak için aynı sitede 1 dakika arayla yapılmalıdır. Ilgi sonraki kas şırınga (bu durumda yanal krikoaritenoid) hareket ettirin ve enjeksiyon işlemi tekrarlayın. Sadece bir kez, her kas delinme.
4. Beş dakika sonra mikroenjektör geri çekin.
5. VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak fasya mola Seal.
6. Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak yarayı kapatmak. Yerel institional hayvan kullanım yönergelerine, dikiş veya yara klipleri bağlı kullanılabilir.
7. Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak ve y gereği olarak bakımkurumsal hayvan kullanımı kurallar.
8. Deneysel olarak belirlenen yaşam süresinden sonra (bu durumda, 90 saat 2 etiket ^nd kortikal nöronların sipariş), pentobarbital doz aşımı ile hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transcardially serpmek.
9. Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin.
10. En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect.

EGFP 4. immunokimyasal Algılama

1. Sürgülü mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin. Monte edilmiş bölümleri kullanılarak boyanması daha ince bölümleri, örneğin, 30 um için kullanılabilmektedir.
2. Işıktan koruyarak PBS içinde% _0.3, H2O ₂ 30 dakika boyunca bölümler söndürülür.
3. PBS VECTASTAIN Elit Kit normal keçi serumu ile% 0.3 Tween 20 ihtiva eden 30 dakika boyunca bölümler halinde spesifik olmayan antijenleri engelle (kiti VE).
inkübe tavşan 3,5 saat boyunca anti-eGFP (1000 1) bölümleri engelledi.
4. RT de kiti VE den daha sonra keçi anti-tavşan ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır.
5. Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın.
6. RT de kiti VE den daha sonra ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır.
7. % 0.05 DAB (3, 3'-diaminobenzidin) ve% 0.015 _{H2O 2} ihtiva eden, 10 dakika süre ile fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın ve fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir.
8. Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100).
9. İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel.
10. Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler. DAB reaksiyon ürünü inside hücreler kahverengi görünmelidir. Sayısallaştırılmış görüntüleri ince süreçleri vurgulamak için ters bir renk olabilir.

PRV İzleme tarafından keşfedilen Beyin Bölgeler içine izleyicilerin Enjeksiyon için 5. Cerrahi Hazırlık

1. (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak.
2. Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun.
3. Uygun bir stereotaksik çerçeve içinde kafası sabitleyin.
4. Saç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile site dezenfekte ederek aseptik tekniğe uygun cerrahi siteyi hazırlayın.
5. Bir kafa derisi kesi yapmak ve ilgi beyin bölgesi üzerindeki deriyi geri çekin.
6. Uygun stereotaksik koordinatlarda küçük bir kraniotomi gerçekleştirin. Örneğin, PRV bir izlemeyi tespit laryngeally bağlanan motor korteks koordinatların erişkin fare 1,2 mm yanal ve bregmaya 0.2 mm rostral bulunmaktadır.

Beyin içine Biyotinilat Dekstran Aminler 6. Enjeksiyon

1. Steril tuz 333 ul BDA 25 mg (10.000 MW) eritilmesi ile% 7.5 biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) hazırlayın.
2. Planlanan enjeksiyonlar için yeterli BDA çözeltisi ile Nanoject II mikropipet sistemi yükleyin.
3. Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikropipet ucu çıkmadan doğrulayın.
4. Stereotaksik micropositioning cihazı kullanarak dikkatlice ilgi beyin bölgesi içine mikropipet ucu düşürmek ve yavaş yavaş BDA enjekte edin. Bölgenin büyüklüğüne bağlı olarak enjeksiyon oranı etiketlenmesine ayarlayın. Örneğin, 4.6 nl 12 enjeksiyonları dışında 0.2 mm (postero-kaudal yönde) yetişkin farelerde laryngeally bağlı motor korteks kapsayacak şekilde dört farklı konumlarda olması yaptırdı olmalıdır. Nihai enjeksiyon hacmi ilgi beyin bölgesinin boyutuna göre ayarlanabilir olmalıdırEtiket beyin dokusu sayesinde ve etiketli nöronların süreçler boyunca difüzyon ile enjeksiyon çekirdek yayılabilir akılda tutmak.
5. Diş çimento kullanarak kraniotomi Seal ve VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak kafa derisi yarayı kapatmak.
6. Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum.

Kas içine kolera toksin alt-birimlerinin b 7. Enjeksiyon

1. Steril tuzlu su, 100 ul CTB, 1 mg çözülmesiyle 1% kolera toksin alt-birimlerinin b (CTB) hazırlayın.
2. Altı gün beyine BDA enjeksiyonundan sonra, kas içine enjeksiyon için PRV yukarıda tarif edildiği gibi, cerrahi hazırlama gerçekleştirin.
3. 34 G paslanmaz çelik iğne takın, CTB çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin.
4. Daha önce de olduğu gibi ilgi kas (lar) microinjections gerçekleştirinPRV için kayıtsız kalamayız.
5. Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum.
6. Üç gün CTB enjeksiyonundan sonra, pentobarbital aşırı doz hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transkardiyal serpmek.
7. Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin.
8. En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect.

Aynı bölümlerde BDA ve CTB 8. Algılama

1. Bir mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin.
2. Işıktan koruyarak PBS içinde% _0.3, H2O ₂ 30 dakika boyunca bölümler söndürülür.
3. Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın.
4. Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın.
5. 10 dakika boyunca fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın, ve% 0.05 DAB (3, 3'-diaminobenzidin),% 0.015 _{H2O 2,} ve% 0.05 nikel klorür içeren fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir. Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü siyah görünmelidir.
6. VECTASTAIN Elit Kit normal tavşan serumu ile Tween 20% 0.3 içeren PBS içinde 30 dakika boyunca blok bölümleri.
7. RT'de: inkübe keçi 2 saat boyunca anti-CTB (10,000 1) bölümleri engelledi.
8. RT de kiti VE den daha sonra tavşan anti-keçi ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın.
9. Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın.
10. Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 30 dakika boyunca, onları tepki, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın.
11. % 0.05 DAB (3, 3 ihtiva eden, 10 dakika boyunca kısımlar fosfat tamponu içinde üç kez yıkayın ve fosfat tamponu içinde 8 dakika, pH 7.4 için geliştirmek'-diaminobenzidine) ve% 0.015 _{H2O 2.} Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü kahverengi görünmelidir.
12. Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100).
13. İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel.
14. Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler.

Sonuçlar

EGFP için boyama kasına PRV152 enjekte sonra birincil motor nöronların yaklaşık 72 saat zayıf sinyali gösteren başlamalıdır. Çoğaltma ve virüsün transsinaptik taşıma titer- ve zamana bağlı ⁴ bulunmaktadır. Yaklaşık 90 saat enjeksiyonundan sonra, eGFP boyama ^2. sırası ile enfekte hücrelerde sağlam sinyal ortaya çıkaracaktır. Daha uzun yaşam süreleri 3 ^rd ve yüksek mertebeden hücreleri ortaya çıkaracaktır ama sağkalım süreleri yaklaşık 5 gün aşılamadan sonra PRV ölümcül ile sınırlıdır.

Tartışma

PRV152 ^4,21 kullanarak bir deney planlanırken dikkate alınması gereken konulardan bir dizi vardır. Daha da önemlisi, pseudorabies virüs öldürücü. Daha önce belirtildiği gibi, insanlar da dahil olmak üzere büyük maymunlar, enfeksiyona duyarlı değildir, ancak uygun bakım diğer hayvanları korumak için dikkatli olunmalıdır. Yetişkin farelerde tipik haliyle beş ila yedi gün, zayıflatılmış PRV152 suşu ile aşılamadan sonra hayatta. Bu nedenle, PRV152 bir haftadan daha uzun bir hayatta kalma süresi gerektirir deneyle...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif/Malzeme	Firma	Katalog Numarası	Yorumlar
NanoFil Mikroenjeksiyon Sistemi	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G seçeneği
Stereotaksik çerçeve	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Otomatik Nanolitre Enjektör	Drummond Scientific Company	3-000-204
Kayar mikrotom	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
İzofloran (Forane)	Baxter
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 adet
Permount Montaj Ortamı	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus slaytlar	Fisher Scientific	12-550-15
Biyotinile edilmiş dekstran aminler	Invitrogen	D-1956	10.000 MW
Psödokuz virüsü	Laboratuvarı Dr. Lynn Enquist (Princeton Üniversitesi)	PRV152	Titre >1 x 107
Anti-Kolera Toksin B Alt Birimi (Keçi)	Listesi Biyolojik Laboratuvarlar	703
Kolera Toksin B Alt Birimi	Listesi Biyolojik Laboratuvarlar	103B
Anti-eGFP	Açık Biyosistemler	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidin	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tabletler
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 geçirmez
Formaldehit	Sigma-Aldrich	F8775	%4'e seyreltin
Hidrojen peroksit	Sigma-Aldrich	H3410	%30
Ketamin HCl & Ksilazin HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg / ml ve 6 mg / ml
Nikel klorür	Sigma-Aldrich	339350
Fosfat tamponu	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Fosfat tamponlu salin	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Sodyum Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg / ml doz
Sükroz	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Ksilenler	Sigma-Aldrich	534056	Histolojik sınıf
VECTASTAIN Elite ABC	Kiti Vektör Laboratuvarları	PK-6101 (tavşan); PK-6105 (keçi)
Optixcare oftalmik merhem	Veteriner Deposu 1017992