Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir

28.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50688

⸱

7 Ağustos 2013

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2Physiology and Biophyics, Virginia Commonwealth University

Bu makalede

Özet

Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan hazırlanır Vb.

Özet

Enterik sinir sistemi fonksiyonel mide-bağırsak hareketliliği kontrol gastrointestinal uzunluğu çalışan nöronlar ve glia geniş bir ağdır. Myenterik pleksustan nöron ve glia karışık bir nüfus izolasyonu ve kültürü için bir prosedür açıklanmıştır. Primer kültürlerinde nöronlar ve glia arasında gelişmekte olan bağlantıları ile, 7 gün boyunca korunabilir. Ekli myenterik pleksus ile uzunlamasına kas şerit fare ileum ya da kolon altında yatan dairesel kas sıyrıldı ve enzimatik sindirim tabi tutulur. Steril koşullar altında, izole edilmiş nöronal ve glial nüfus pelet aşağıdaki santrifüj içinde korunmuş ve lamelleri kaplama. 24-48 saat içinde, akson uzantısı oluşur ve nöronlar pan-nöronal belirteçler ile tespit edilebilir. Kültür içinde iki günden sonra izole nöronların yangın aksiyon potansiyelleri olarak yama kelepçe çalışmalar tarafından gözlenmiştir. Ayrıca, enterik glia da identif olabilirGFAP boyama ile ied. Yakın apozisyon nöronların ve glia bir ağ 5 içinde oluşturur - 7 gün. Enterik nöronların tek tek olması ve doğrudan bu immünhistokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve tek hücreli PCR gibi yöntemler kullanılarak incelenmiştir olabilir. Ayrıca, bu prosedür genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Bu metodoloji gerçekleştirmek için basit ve ucuzdur. Daha iyi normal ve hastalık durumlarında, ENS özelliğe keşfedebilir, böylece genel olarak, bu protokol, kolayca manipüle şekilde enterik sinir sisteminin bileşenlerini ortaya koyar.

Giriş

Enterik sinir sistemi (ENS) sinir ve gastrointestinal (Gİ) sistem ve tüm uzunluğu çalışır glia geniş bir ağdır. ENS işlevsel peristaltizm, sıvı emme / salgılanması, uyaranların hissi, vb (yorum için 1) da dahil olmak üzere sindirim tüm yönleriyle, kontrol eder. Bu omurilik bulunan fazla 500 milyon nöron içerir ve beyinde bulunan her nörotransmitter sınıf içerir. Ayrıca, ENS bu merkezi sinir sistemi 2 girişi olmadan refleks olarak işlev görebilir benzersizdir. ENS anlaşılması normal fizyolojik rolünü anlamak için, ama (en Hirschsprung hastalığı), satın alınan (Chagas), hastalık durumları (diyabetik gastroparezi) bağlı, ilaç doğumsal olabilir nöropati çeşitli katılımının anlamak için değil sadece, çok önemlidir bağlı (opioid bağırsak sendromu) ya da yaralanma (postoperatif ileus) 1. nedeniyle. Buna ek olarak, enterik nöronlar yeniden olabilirviral enfeksiyon (varisella zoster) 3 servoir. Çünkü beyin ve bağırsak serotonin yüksek düzeyde olan benzerlikler, merkezi sinir sistemi kusurları tedavi edilmesini amaçlayan ilaçlar genellikle ENS 2 istenmeyen yan etkileri vardır. Bu tür Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi birçok nöropatiler ENS bu hastalıkların 4 patogenezinde incelemek için bir kolay kullanılabilir hale, merkezi nöronlarda kendi görünümünü çok önce enterik nöronların benzer hücresel değişiklikler gösteriyor olması da dikkat çekicidir. Bu nedenle, ENS tam bir anlayış hastalık durumları anlama ve farmakolojik yan etkileri önlemede / tahmin bir zorunluluktur.

ENS olan nöronlar geleneksel olarak 8. 5-7 veya kültür nöronlar wholemount hazırlıkları kullanarak kobay olarak incelenmiştir. Nöronların bu büyük hayvan okudu olabilir hangi kolaylığı rağmen, bu model de dahil olmak üzere birçok sınırlamalar vardırgenetiği değiştirilmiş suşları, bu türe özgü reaktifler eksikliği ve bu konularda sipariş ve konut ile ilgili yüksek maliyetli olmaması. Bir kemirgen enterik sinir sistemi modeli geliştirme sistemleri, hücre kültürü tekniği ile birlikte kullanılabilecek diğer yöntemler arasında kurulan geniş bir dizi ve kobay modeli için bir doğrulama sağlama yeteneği üzerinden vuruş çeşitli en önemli avantajı vardır .

Bağırsak peristaltik eylemleri için esas sorumlu olan dış myenterik pleksus (uzunlamasına ve dairesel kas arasında), hem de submukozal ve mukozal pleksi, (: ENS gastrointestinal sistem uzunluğu çalışan üç pleksi oluşur büyük ölçüde sıvı emilimi / salgılanmasını uyaran ve 1 algılama kontrol mukoza, sırasıyla) altında ve içinde bulunan. Bu yöntem, soyma ile uzunlamasına kas / myenterik pleksus (LMMP) hazırlık izolasyonu ile başlargastrointestinal dış kas tabakası kapalı. Bu dramatik mukoza tabakası izolasyon söz konusu olduğunda ortaya çıkan kirlenme sorunları azalır. Sonuç olarak, bu işlem oldukça ENS salgı işlemleri daha motilite sinirsel kontrolü çalışma için idealdir.

Yöntemi burada enterik nöronlar ve glia karışık bir kültür sonuçlarını sundu. Nöronların en az iki farklı türde önceki mevcut elektrofizyolojik ve immünositokimyasal gözlemler 9 dayanmaktadır. Glia varlığı kendi başlarına çalışmak için önemli bir hücre tipi sadece gibi, son derece avantajlıdır, ancak enterik nöronlar 10 hayatta kalma katkıda bulunmak ve nöronal hücre yüzeyinde 11 yerli reseptör ifade korumak. Ayrıca, enterik glia eksiklikleri 'nöro-gliopathies' 12 icat anormal gastrointestinal motilite hastalık durumları, yol açabilir. Bu nedenle, ENS kültür Burada yer RSoruşturma için olgunlaşmış birkaç hücre tiplerinde onu ç lar.

Bu yöntem için avantajları izolasyon, ucuz araç gereksinimleri ve deneyimli laboratuvar personeli tarafından teknik ana kısa bir süre kolaylığı vardır. Metodoloji sınırlamaları düşük genel hücreli yüksek doku birimleri verim ve mukozal ve submukozal pleksi gelen ENS nöronların dışlama içerir. Bu işlem elektrofizyoloji, immünhistokimya, tek hücreli PCR ve diğer yöntemler konusunda uzmanlaşmış bilim adamları için son derece avantajlı olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürlere uygun olarak ve Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. 24-yuvalı plakalar içinde steril Poli-D-lizin ve laminin kaplı cam lameller hazırlanması

  1. Adım 1 için tüm işlemler steril koşullarda yapılmaktadır, bir başlık altında ve steril reaktifler ile. Cam lamelleri ve çift deiyonize su (GKD 2 O) önceden sterilize edilmelidir. Tabak hazırlanması nöron izolasyonu önce iki hafta kadar yapılabilir.
  2. Kaputun altında, bir 24 plaka 12 kuyu otoklava cam lamelleri yerleştirmek için steril forseps kullanabilir.
  3. Vaktinden poli-D-lizin stok hazırlayın. 5 mg poli-D-lisin ile steril ddH2O 50 ml ilave edilir. -20 ° C'de vorteks ve 3 ml alikotları mağaza Kullanmadan önce alikotları çözülme.
  4. Pipet 80 ul: 25 cm2 başına 1 ml poli-D-lizin hazır bir son konsantrasyon için,Her bir cam lamel üzerine (2 cm 2) üstüne poli-D-lisin stoklar. Çözüm 10 dakika dinlendiriniz.
  5. Poli-D-lizin kullanarak vakum çıkarın ve steril GKD 2 O. ile 3x lamelleri yıkayın
  6. Plakaları başlık altında en az 2 saat kurumasını bekleyin.
  7. Plakalar 4 ° C veya saklanabilir - 20 ° C laminin kaplama geçmeden önce.
  8. Vaktinden laminin stok hazırlayın. Buz üzerinde laminin çözülme ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. 50 ug / ml 'lik bir konsantrasyona kadar seyreltilir; konsantrasyonu çok dikkat edin; her biri çok farklı olacaktır. Çok konsantrasyonuna bağlı olarak, yaklaşık 20 ml GKD 2 O laminin her flakon eklenecektir. -80 Alikot (5 mi) ve mağaza ° C Kullanmadan önce buz üzerinde hacimde çözülme.
  9. 5 mg / cm 2 laminin ile kaplayın lamelleri, her lamel laminin stok pipet 200 ul.
  10. 1 saat boyunca lamelleri, laminin çözelti inkübe edin.
  11. Kalan laminin çözüm aspire ve bir kez lamelleri yıkayınGKD 2 O. Lamelleri yüzey kazıma kaçının.
  12. Kadar iki hafta boyunca 4 ° C'de saklayın plakalar.

2. Nöron İzolasyon Çözümleri önceden hazırlanması

  1. (: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO3, 11 glikoz ve 2.5 CaCl 2 NaH mM) Krebs çözeltisi hazırlayın. Yeri 13.79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3.96 g glukoz (FW 180.2), ve 2 L GKD 2 0 içinde 0.555 g CaCI2 (FW 111). 4 ° C'ye soğutun
  2. Ortamı (% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik / antimikotik ile F12 ortamı) durulama hazırlayın: F12 ortamı 500 ml'lik bir şişe için 50 ml FBS ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı (Gibco) ve 5 ml ekleyin.
  3. Enterik nöron ortamı (Neurobasal B-27 içeren bir ortam, 2 mM L-glutamin,% 1 FBS, 10 ng / ml, gliyalden türevlenmiş Neurotr hazırlanmasıophic faktör (GDNF) ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı). GDNF stok yapmak için, -80 ° C de 10 mg GDNF için 1 ml GKD 2 O ekleyin ve 50 ul alikotları, mağaza geri dondurma Tam nöron bir ortam 50 ml'lik bir şişe için, 47.5 mi Neurobasal bir ortam, 1 mi B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 ul 200 mM L-glutamin (Gibco) ve 50 ul stok GDNF ve 500 ul / antibiyotik kombine antimikotik 100x Sıvı. Medya GDNF tazelik sağlamak ve bu pahalı cep medya karışımı büyük miktarda kirlenmesini önlemek için küçük 50 ml gruplar halinde yapılır.

3. Fareler ile hasat boyuna kas / myenterik Pleksus (LMMP) hazırlanması

  1. Hayvan deneylerinde gerçekleştirmeden önce uygun ulusal ve kurumsal etik yerinde olmalıdır. 25 g (genellikle yaş 8 hafta boyunca) üzerinden ağırlığında Yetişkin Swiss Webster fareler önce deneylere 6 gruplar halinde yerleştirilmiştir. İki farelerden alınan dokular İleal enterik nöronlar ve glia izolasyonu için kullanılır ve üç farenin için kullanılırkolon hücrelerin izolasyonu.
  2. Cerrahi alan hazırlayın. Küçük cerrahi makas, açılı forseps, pamuklu, üç 200 ml cam bardak ve cam / plastik çubuk (fırça) toplayın. Tüm malzemeleri iyice yıkanmış ve kontaminasyonu en aza indirmek için kullanmadan önce durulanır olun. Bu adım, deney bir gün önce gerçekleştirilebilir.
  3. PH stabilize etmek için, en az 30 dakika karbojen (% 95 oksijen,% 5 CO2) buz ve kabarcık Krebs çözeltisi yerleştirin.
  4. Istenen sıcaklıklarda stabilize etmek için çeşitli ekipman ve sıcak kimyasal açmak; 37 ile sıcak su banyosu (ler) ° 4 ° C'de, bir yer Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve su banyosu içinde% 0.5 tripsin (37 ° C-C, serin santrifüj .) Komple nöron medya ve durulama medya buzdolabında kalmalıdır.
  5. Yeri 150 ml buz gibi 'kirli', 'temiz' ve 'LMMP' etiketli üç 200 ml cam bardak içinde Krebs kabarmış. Kabarcık beher carbogen ile 'LMMP' etiketli.
  6. Etik kurul, euthanize m onayından sonraservikal dislokasyon veya CO 2 boğulma ouse.
  7. % 70 EtOH ile cerrahi yüzey, temiz cilde dorsal recumbence fare yerleştirin ve forseps kullanarak karın cilt kaldırın. Makas, açık karın boşluğu ve iç sindirim organları ortaya kullanma.
  8. Ileum bir bölüm kaldırma ve mezenteri ortaya çıkararak, gastrointestinal yolun uzunluğu çıkarın. Makasla mezenter ile Snip yavaşça çıkarın ve ileum / kolondan mezenter çekmek için dikkatli olmak, ileum ve kolon çözülmeye.
  9. Bağırsak tam uzunlukta sökülmüş sonra, bağırsak yoluyla çekum için mide distalinde ve proksimal keserek ileum çıkarın Not:. Bu prosedür de proksimalinde için çekum için distalinden kolon kaldırarak kolon doku ile yapılabilir anüs.
  10. Dokular daha proksimal ve distal kolon ve jejenum ve ileum arasında bölünebilir. Bu işlemi geri kalanı ileum izolasyonu sevk edecektir; to işlem kolon LMMP en izolasyonu için aynıdır. Buz Krebs 'kirli' olarak işaretlenmiş bir cam kapta tüm ileum yerleştirin.
  11. Ileum temizlemek için bir araç oluşturmak ve bir dosyalama taş kullanarak künt büyük 20 G iğne buz soğuk Krebs içeren büyük bir şırınga (10 ml) ekleyin.
  12. Üç ya da daha fazla büyük parçalar halinde ileum kesit tarafından ilumundan dışkı temizleyin. Beher bir ileal kısmını çıkarın ve bir ileal parçasının ucunu Kör İğne yerleştirin.
  13. Tüm dışkı ayrı bir atık kabı içine kaldırılır kadar yavaşça bağırsak bölümü üzerinden Krebs çalıştırın. 'Temiz' olarak işaretlenmiş Krebs kaba temizlenmiş bölümüne yerleştirin. Tüm ileum temizlenir kadar tekrarlayın.
  14. LMMP kaldırmak için, yaklaşık 2, küçük bölümler halinde ileum kesmek - 4 cm. Bir plastik veya cam çubuk üzerinde ileum bir segment yerleştirin; ileum kuytu uygun ama (~ 2 mm) gevşek veya gergin olmamalıdır. Yavaşça mezenter parçaları kaldırarak LMMP çıkarılması başlayın hala eklemekBir forseps kullanarak gastrointestinal (Gİ) sistem için ed. Yavaşça başparmak kullanarak çubuk için tüp iğneleyerek çubuk etrafında dönmesini gastrointestinal önleyin.
  15. Temel dairesel kas LMMP ayırın, önce hafifçe hafifçe uzunlamasına kas bir boşluk yaratarak, üst segment altına, mezenter bağlı olduğu tüm hat boyunca forseps kenarına sürün. Sonra yavaşça Krebs ile ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanarak uzunlamasına kas uzak kızdırmak.
  16. Uzunlamasına kas boşluğu üst başlar ve uzunlamasına kas sadece dairesel kas ayrı başlayana kadar çok hafif bir basınç uygularken hafif yatay vuruş kullanarak uzak kızdırmak; mezenter bağlantı noktası birlikte tüm şerit aşağı yapıyoruz.
  17. Sonra yavaşça GI tüp etrafında çalışmaya başlar, boyuna kas yavaş yavaş tüp etrafında dairesel kas tüm yol ayrılır gibi yukarıdan aşağıya ve geriye hareket. Tamamlandığında,LMMP doğal olarak GI borusunun kalanı kapalı gelecektir.
  18. 'LMMP' işaretli beher uzunlamasına kas elde edilen ince bir şerit yerleştirin. Tüm kesimleri için tekrarlayın.
  19. LMMP tüm şeritler tek bir fare elde edildikten sonra, kullanılan diğer fareler için işlemi tekrarlayın. Iyice Tekrar kullanmadan önce 'kirli' ve 'temiz' bardak durulayın.
  20. Biyolojik kirlenme kaldırmak için 3x LMMP durulayın. Buz Krebs ile üç 2 ml Eppendorf tüpleri doldurun. Bir santrifüj içinde 356 x g'de 30 saniye boyunca ilk tüp ve spin LMMP şeritleri yerleştirmek 4 ° C'ye kadar soğutuldu Dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve sonraki temiz Krebs dolu tüpe LMMP şeritler hareket ettirin. Kalan her tüp için bu işlemi tekrarlayın.

4. Digest LMMP

  1. 10 ml carbogen-kabarmış Krebs solüsyonu 13 mg kollajenaz tip 2 ve 3 mg BSA koyarak sindirim çözeltisi hazırlayın.
  2. Sindirim çözüm ve kullanım SCIS içine durulanır LMMP Yeri segmentlerisors küçük parçalar halinde LMMP snip için.
  3. ° C su banyosunda çalkalayıcı ile 37 60 dakika hafifçe carbogen ile kabarmış olan süre Digest LMMP.
  4. Sindirim tamamlandıktan sonra, 356 x g'de santrifüj az 8 dakika boyunca santrifüj hücreleri toplamak için 4 ° C'de soğutuldu
  5. Bu noktadan itibaren tüm işlemler bir hücre kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır! Tüm reaktifler ve kaplar kullanımdan önce sterilize edilmelidir.
  6. Santrifüj sırasında, 1 mi yerleştirerek% 0.05 tripsin solüsyonu hazırlamak% 0.25 tripsin ısıtıldı ve 4 ml steril bir 50 ml hücre kültür tüpüne HBSS ısıtıldı.
  7. Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. Bir vakum kullanmayın, bu olasılığı düşük santrifüj hızı nedeniyle hücre pelet emmek olacaktır. Dikkatlice% 0.05 tripsin solüsyonu 5 ml temiz bir tüp içine hücre pelet ve yer çıkarın.
  8. 37 7 dakika boyunca çalkalanarak ° C su banyosu içinde% 0.05 tripsin solüsyonu hücreleri Digest. 7 mi aşmayınn toplam tripsin tedavi ya da nöronların yok olacak.
  9. Tripsin muamelesi 7 dakika sonra soğuk durulama ortam 10 ml tripsin nötralize edilir.
  10. 356 x g 8 dakika hücreler santrifüj. Çıkarın ve medya atın.
  11. Santrifüj sırasında, steril bir 15 ml'lik hücre kültürünün tüpün üstüne sterilize Nitex örgü bir bölümü dengesi.
  12. Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. 3 ml tam ortam nöron içinde öğütülerek yavaşça tekrar süspansiyon hücre karışımı. Bu adımı ve hücre karışımı toz haline olduğu gelecekteki tüm adımları sırasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Tüm triturations çok nazikçe yapılmalıdır. Temiz 15 ml hücre kültürü tüp içine Nitex örgü süzülür hücre çözümü.
  13. İsteğe bağlı: Cap hücre kültürü tüp ve 30 dakika için hafif haddeleme ve devirme ile soğutmalı Hula mikser yer (veya dönme sağlayan herhangi bir mikser). Bu adım isteğe bağlıdır, ancak önerilen olduğunu.
  14. İsteğe bağlı: Hula mikser sonra hücreler yıkamak için 2 ml soğuk durulama medya ekleyin.
  15. Santrifüj hücreleri (8 dk, 356 x g) toplayın. Çıkarın ve supernatant atın.
  16. 1.200 ul tam nöron medya hücreleri tekrar süspansiyon. Yavaşça 1 ml plastik pipet kullanarak hücreleri Karışım. Hava kabarcıkları oluşturmaz. En parçalar kırık ve hücrelere sıvı içine askıya kadar yavaş ve nazikçe pipetle.
  17. Bir ön-kaplamalı cam lamel içeren 12 gözeneği için tam ortam 750 ul ilave edilerek ezildi hücre çözeltisinden 100 ul ilave edin.
  18. % 5 CO2 ile 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe inkübe nöronlar.
  19. Hücre ortamı her 2 günde bir yarısı değiştirin.
  20. Nöronlar 1 sonra elektrofizyolojik kayıtlar için hazır - kültüründe 2 gün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

LMMP türetilmiş hücreler, nöronlar ve diğer hücre tipleri arasında hemen takip eden izolasyon kolayca belirgin olmayacaktır. Yaşam, belirsiz fenotip yuvarlak hücreler de tam olarak sindirilir doku parçaları ve bağ dokusu doku döküntü olarak görülebilir. Bu ayaktakımı hiçbir endişe ve büyük ölçüde iki gün içinde ilk medya değişikliği ile kaldırılacak. Sağlıklı, canlı hücreler de silinecektir bu önce slaytlar temizlemek için çalışmayın.

Kültüründe bir gün sonra, nöronlar akson uzantısı g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kullanılan hayvanların

Bu protokol İsviçre Webster fareler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, sıçan gibi diğer küçük ölçekli memelilere ve farenin diğer suşları için de uyarlanabilir. Biz başarıyla C57 fare ve μ-opioid reseptör knock-çıkışları ile ön izolasyonları gerçekleştirdik. Ancak, bu farelerin diğer suşları GI morfolojik farklılıklar nedeniyle sorunlu olabilir olması da mümkündür. Ayrıca, nihai izolasyon nöronların çıkan karışım etkileyebilir LMMP hazırlanması 13...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar önemli bir çıkar çatışması var olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Sağlık Hibe DA024009 Ulusal Enstitüsü, DK046367 & T32DA007027.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reagents
Fisherbrand Büyüme Kapak Camları için Kapak Camı (12 mm çap)Fisher Scientific12-545-82 
Poli-D-lizinSigmaP6407- 5 mg 
24 oyuklu hücre kültürü plakasıCELLTREAT229124Herhangi bir marka
LamininBD Biosciences354 232 
ddH2OLaboratuvarda hazırlayabilir 
15 ml Steril Santrifüj TüpüGreiner Bio-one188261Herhangi bir marka
50 ml Steril Santrifüj Tüpükullanabilir Greiner Bio-one227261Herhangi bir marka
kullanabilir NaClFisher BioReagentsBP358-212MW 58.44
KClFisher BioReagentsBP366-500MW 74.55
NaH2PO4 .2H2OFisher ChemicalsS369-3MW137.99
MgSO4Sigma AldrichM7506-500GMW 120.4
NaHCO3Sigma AldrichS6014-5KGMW 84.01
glikozFisher ChemicalsD16-1MW 180.16
CaCl22H2OSigma AldrichC5080-500GMW 147.02
F12 medyaGibco11330ve nbsp;
Fetal Sığır SerumuKalite Biyolojik A.Ş.110-001-101HIHerhangi bir marka
Antibiyotik / antimikotik 100x sıvıGibco15240-062& nbsp
Nörobazal A ortamıGibco10888 
200 mM L-glutaminGibco25030164 
Glial Kaynaklı Nörotrofik Faktör (GDNF)NöromikPR27022 
Keskin Uçlu Diseksiyon MakasıFisher Scientific8940Herhangi bir markayı kullanabilir
Diseksiyon Doku ForsepsleriFisher Scientific13-812-41Herhangi bir markayı kullanabilir
Pamuk Uçlu AplikatörlerFisher Scientific23-400-101Herhangi bir markayı kullanabilir
250 ml Dereceli CamBeher Fisher ScientificFB-100-250Herhangi bir markayı kullanabilir
2 L Cam Erlenmyer şişesiFisher ScientificFB-500-2000Herhangi bir marka
kullanılabilir Plastik çubuk (çocuk boya fırçası)Crayola05 3516Herhangi bir markayı kullanabilir
CarbogenAirgasUN 3156%5 CO2
>10 ml Leur-lock ŞırıngaBecton Dickinson309604Herhangi bir markayı kullanabilir
21 G x 1 1/2 inç. Hipodermik İğneBecton Dickinson305167Herhangi bir marka
Kollajenaz tip 2Worthington LS004174
Sığır Serum AlbüminiAmerikan BiyoanalitikAB00440 
2 ml Mikrosantrifüj Eppendorf tüpleriFisher Scientific13-864-252Herhangi bir marka
Nitrex Mesh 500 & micro kullanabilir; MElko Filtering Co100560Herhangi bir markayı kullanabilir
Pipet SetiFisher Scientific21-377-328Herhangi bir markayı kullanabilir
Sharpeining StoneFisher ScientificNC9681212Herhangi bir markayı
Equipment
LabGard ES 425 Biyolojik Güvenlik Kabini (hücre kültürü başlığı)NuaireNU-425-400Herhangi birini kullanabilir marka
10 L Çalkalama Su BanyosuEdvotek5027Herhangi bir marka
Mikrosantrifüj 5417REppendorf5417RBoyut adaptörleri ile daha büyük tek bir santrifüj kullanabilir
Allegra 6 Serisi SantrifüjBeckman Coulter366816Herhangi bir marka
kullanabilir HuluMixer Numune KarıştırıcıInvitrogen15920D& nbsp;
AutoFlow Su Ceketi CO2 İnkübatörüNuiareNU-4750Herhangi bir markayı kullanabilir
Analitik TeraziMettler ToledoXS104Herhangi bir markayı kullanabilir
kullanabilirsiniz; kullanabilirsiniz; kullanabilir

Kaynaklar

  1. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
  2. Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
  3. Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).
  4. Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).
  5. Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig. J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).
  6. Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig. Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).
  7. Rugiero, F., et al. Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia. J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).
  8. Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation. Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).
  9. Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels. PLoS One. 7 (9), e45251(2012).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55 (5), 630-637 (2006).
  12. Bassotti, G., et al. Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies. World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).
  13. Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice. J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).
  14. Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract. Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).
  15. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  16. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).
  17. Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin. Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Longitudinal KasEnzimatik SindirimHücre İzolasyonuİmmünohistokimyaElektrofizyolojiKalsiyum GörüntülemeTek Hücre PCRGFAP Boyama
Bir
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.