Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan hazırlanır Vb.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Enterik sinir sistemi fonksiyonel mide-bağırsak hareketliliği kontrol gastrointestinal uzunluğu çalışan nöronlar ve glia geniş bir ağdır. Myenterik pleksustan nöron ve glia karışık bir nüfus izolasyonu ve kültürü için bir prosedür açıklanmıştır. Primer kültürlerinde nöronlar ve glia arasında gelişmekte olan bağlantıları ile, 7 gün boyunca korunabilir. Ekli myenterik pleksus ile uzunlamasına kas şerit fare ileum ya da kolon altında yatan dairesel kas sıyrıldı ve enzimatik sindirim tabi tutulur. Steril koşullar altında, izole edilmiş nöronal ve glial nüfus pelet aşağıdaki santrifüj içinde korunmuş ve lamelleri kaplama. 24-48 saat içinde, akson uzantısı oluşur ve nöronlar pan-nöronal belirteçler ile tespit edilebilir. Kültür içinde iki günden sonra izole nöronların yangın aksiyon potansiyelleri olarak yama kelepçe çalışmalar tarafından gözlenmiştir. Ayrıca, enterik glia da identif olabilirGFAP boyama ile ied. Yakın apozisyon nöronların ve glia bir ağ 5 içinde oluşturur - 7 gün. Enterik nöronların tek tek olması ve doğrudan bu immünhistokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve tek hücreli PCR gibi yöntemler kullanılarak incelenmiştir olabilir. Ayrıca, bu prosedür genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Bu metodoloji gerçekleştirmek için basit ve ucuzdur. Daha iyi normal ve hastalık durumlarında, ENS özelliğe keşfedebilir, böylece genel olarak, bu protokol, kolayca manipüle şekilde enterik sinir sisteminin bileşenlerini ortaya koyar.
Giriş
Enterik sinir sistemi (ENS) sinir ve gastrointestinal (Gİ) sistem ve tüm uzunluğu çalışır glia geniş bir ağdır. ENS işlevsel peristaltizm, sıvı emme / salgılanması, uyaranların hissi, vb (yorum için 1) da dahil olmak üzere sindirim tüm yönleriyle, kontrol eder. Bu omurilik bulunan fazla 500 milyon nöron içerir ve beyinde bulunan her nörotransmitter sınıf içerir. Ayrıca, ENS bu merkezi sinir sistemi 2 girişi olmadan refleks olarak işlev görebilir benzersizdir. ENS anlaşılması normal fizyolojik rolünü anlamak için, ama (en Hirschsprung hastalığı), satın alınan (Chagas), hastalık durumları (diyabetik gastroparezi) bağlı, ilaç doğumsal olab....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürlere uygun olarak ve Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. 24-yuvalı plakalar içinde steril Poli-D-lizin ve laminin kaplı cam lameller hazırlanması
- Adım 1 için tüm işlemler steril koşullarda yapılmaktadır, bir başlık altında ve steril reaktifler ile. Cam lamelleri ve çift deiyonize su (GKD 2 O) önceden sterilize edilmelidir. Tabak hazırlanması nöron izolasyonu önce iki hafta kadar yapılabilir.
- Kaputun altında, bir 24 plaka 12 kuyu otoklava cam lamelleri yerleştirmek için steril forseps kullanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
LMMP türetilmiş hücreler, nöronlar ve diğer hücre tipleri arasında hemen takip eden izolasyon kolayca belirgin olmayacaktır. Yaşam, belirsiz fenotip yuvarlak hücreler de tam olarak sindirilir doku parçaları ve bağ dokusu doku döküntü olarak görülebilir. Bu ayaktakımı hiçbir endişe ve büyük ölçüde iki gün içinde ilk medya değişikliği ile kaldırılacak. Sağlıklı, canlı hücreler de silinecektir bu önce slaytlar temizlemek için çalışmayın.
Kültüründe bir gün sonra, nöronlar akson uzantısı g.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kullanılan hayvanların
Bu protokol İsviçre Webster fareler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, sıçan gibi diğer küçük ölçekli memelilere ve farenin diğer suşları için de uyarlanabilir. Biz başarıyla C57 fare ve μ-opioid reseptör knock-çıkışları ile ön izolasyonları gerçekleştirdik. Ancak, bu farelerin diğer suşları GI morfolojik farklılıklar nedeniyle sorunlu olabilir olması da mümkündür. Ayrıca, nihai izolasyon nöronların çıkan karışım etkileyebilir LMMP hazırlanması 13.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar önemli bir çıkar çatışması var olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Sağlık Hibe DA024009 Ulusal Enstitüsü, DK046367 & T32DA007027.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Fisherbrand Büyüme Kapak Camları için Kapak Camı (12 mm çap) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poli-D-lizin | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24 oyuklu hücre kültürü plakası | CELLTREAT | 229124 | Herhangi bir marka |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Laboratuvarda hazırlayabilir | ||
| 15 ml Steril Santrifüj Tüpü | Greiner Bio-one | 188261 | Herhangi bir marka |
| 50 ml Steril Santrifüj Tüpü | kullanabilir Greiner Bio-one | 227261 | Herhangi bir marka |
| kullanabilir NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glikoz | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 medya | Gibco | 11330 | ve nbsp; |
| Fetal Sığır Serumu | Kalite Biyolojik A.Ş. | 110-001-101HI | Herhangi bir marka |
| Antibiyotik / antimikotik 100x sıvı | Gibco | 15240-062 | & nbsp |
| Nörobazal A ortamı | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamin | Gibco | 25030164 | |
| Glial Kaynaklı Nörotrofik Faktör (GDNF) | Nöromik | PR27022 | |
| Keskin Uçlu Diseksiyon Makası | Fisher Scientific | 8940 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| Diseksiyon Doku Forsepsleri | Fisher Scientific | 13-812-41 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| Pamuk Uçlu Aplikatörler | Fisher Scientific | 23-400-101 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| 250 ml Dereceli Cam | Beher Fisher Scientific | FB-100-250 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| 2 L Cam Erlenmyer şişesi | Fisher Scientific | FB-500-2000 | Herhangi bir marka |
| kullanılabilir Plastik çubuk (çocuk boya fırçası) | Crayola | 05 3516 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | %5 CO2 |
| >10 ml Leur-lock Şırınga | Becton Dickinson | 309604 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| 21 G x 1 1/2 inç. Hipodermik İğne | Becton Dickinson | 305167 | Herhangi bir marka |
| Kollajenaz tip 2 | Worthington LS004174 | ||
| Sığır Serum Albümini | Amerikan Biyoanalitik | AB00440 | |
| 2 ml Mikrosantrifüj Eppendorf tüpleri | Fisher Scientific | 13-864-252 | Herhangi bir marka |
| Nitrex Mesh 500 & micro kullanabilir; M | Elko Filtering Co | 100560 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| Pipet Seti | Fisher Scientific | 21-377-328 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | Herhangi bir markayı |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biyolojik Güvenlik Kabini (hücre kültürü başlığı) | Nuaire | NU-425-400 | Herhangi birini kullanabilir marka |
| 10 L Çalkalama Su Banyosu | Edvotek | 5027 | Herhangi bir marka |
| Mikrosantrifüj 5417R | Eppendorf | 5417R | Boyut adaptörleri ile daha büyük tek bir santrifüj kullanabilir |
| Allegra 6 Serisi Santrifüj | Beckman Coulter | 366816 | Herhangi bir marka |
| kullanabilir HuluMixer Numune Karıştırıcı | Invitrogen | 15920D | & nbsp; |
| AutoFlow Su Ceketi CO2 İnkübatörü | Nuiare | NU-4750 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
| Analitik Terazi | Mettler Toledo | XS104 | Herhangi bir markayı kullanabilir |
Kaynaklar
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: A second brain. Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).
- Gershon, A. A., C....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
