Yöntem makalesi

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

20.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50696

⸱

8 Ekim 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), 2Integrated Research Centre, University Campus Bio-medico of Rome, 3DAEMI, University of Cassino, 4National Institute of Optics (CNR-INO), 5Allen Institute for Brain Science, 6Department of Physics, University of Florence, 7ICON Foundation, Sesto Fiorentino, Italy

Bu makalede

Özet

Bu yazıda yüksek çözünürlüklü, floresan etiketli fare beyinleri ince beyin anatomisi ile, yeniden tam deneysel prosedürü açıklar. Açıklanan protokol numune hazırlama ve temizleme, görüntüleme, veri post-processing ve çok ölçekli görselleştirme için montaj örneği içerir.

Özet

Tek hücreli çözünürlükte memeli beyin mimarisini anlama nörobilim önemli konulardan biridir. Ancak, bütün beyin boyunca nöronal soma ve projeksiyonları haritalama hala görüntüleme ve veri yönetimi teknolojileri için zordur. Gerçekten de, makroskopik hacimleri Terabyte aralığında veri setleri üreten, makul bir süre içinde, yüksek çözünürlük ve kontrast ile yeniden inşa edilmesi gerekiyor. Biz son zamanlarda bir optik yöntem gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş tüm fare beyinleri mikron ölçekli imar elde edebilen (konfokal ışık levha mikroskopi, CLSM) gösterdi. Işık sac aydınlatma ve konfokal algılama birleştirerek, CLSM yüksek kontrast ve hız ile makroskopik temizledi örneklerin içinde derin görüntüleme sağlar. Burada floresan proteinleri ile etiketlenmiş tüm fare beyinleri kapsamlı ve okunabilir görüntüler elde etmek için tam deneysel boru hattını tarif. Takas ve montaj procedures birlikte bir çok paralel komşu yığınları alarak onun bütün hacmi üzerindeki bir optik tomografisi gerçekleştirmek için adımlar ile tarif edilmiştir. Biz birden fazla yığınları ve çok çözünürlüklü veri navigasyon dikilmesini sağlayan açık kaynak ısmarlama yazılım araçları kullanımını gösterdi. Tüm Purkinje hücreleri seçici olarak etiketlenmiş edildiği bir L7-GFP transgenik fare, ve rastgele seyrek nöronal etiketleme ile karakterize edilen bir thy1-GFP-M fare gelen bütün beyin beyincik: Son olarak, beyin haritalarının bir örneği tasvir.

Giriş

Moleküler ve hücresel mekanizmaları altta yatan beyin fonksiyonlarının anlayışımıza göre, ince nöroanatomi bilgimiz henüz emekleme 1 hala görünüyor. Aslında, biz hala beyin boyunca nöronal somata veya uzun menzilli çıkıntıların konumuna kapsamlı haritalar eksikliği. Aslında, birçok teknolojik çabalar mikroskobik çözünürlükte fare beyin yeniden adadık. Reçine gömülü numunelerinin seri kısımlara göre optik yöntemler Bıçak kenar tarama mikroskobu (KESM) halinde 2, Mikro-Optik Bölünmesi tomografi (ÇOK) ve floresan 3-EN (fMOST) 4, alt-mikron üç boyutlu çözünürlüğü sağlayabilir Tüm fare beyinleri görüntüleme. Ancak, tek bir numune hazırlanması ve görüntüleme için gerekli olan toplam zaman bu yöntemlerin sınırlayıcı pratik uygulama, birkaç hafta düzeyindedir. Seri kesit dayalı başka bir tekniktir (ama reçine gömme olmadan), Seri İki-Foton tomografi (STP) 5, yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görüntüleme sağlar. Ancak, bu teknik 1 bölümü her 50 mikron 5 toplama, sadece çok seyrek örnekleme ile tüm fare beyinlerinde kanıtlanmıştır, ve bizim bilgilerimize STP henüz bir fare beyninin tam örnekleme yeniden üretemiyor.

Yüksek hızda üç boyutlu olarak tüm örneklerin yeniden bir üstün optik yöntem hafif levha mikroskobu 6'dır. Bu optik şemada örnek bir ışık ince bir tabaka ile aydınlatıldığında ve floresan emisyonu aydınlatma düzlemine dik olan bir eksen boyunca toplanır. Bu sayede sadece odak flüoroforlar heyecanlı ve yüksek çerçeve hızlarını garanti, geniş alan konfigürasyon optik bölümlendirilmeleri elde etmek mümkündür. Bir kırılma indeks uyumlu sıvı 7 su ile ikame göre temizleme protokolleri bağlanmış olduğunda, ışık mikroskobu tabaka uygulanmıştırFare beyinleri bütün olarak 8 makroskopik örnekleri,. Ancak, elde edilen görüntü bulanıklık genel ekler out-of-odak Flüoroforlann uyarılmaya neden ışık tabakası düşürür, hatta temizlendikten örnekleri etkiler ışık saçılması, numune kaynaklı.

Seçici sadece odak fotonları toplamak için, son zamanlarda bir konfokal algılama düzeni 9 ışık sac aydınlatma birleştiğinde. Konfokal ışık levha mikroskobu (CLSM) in, out-of-odak ve dağınık fotonlar lineer uzaysal filtre (yarık) öncesinde algılama (Şekil 1) tarafından reddedilir. Işık tabaka mimarisinde konfokal işlemi elde etmek için, bir aydınlatma tarama hattı vasıtasıyla üretilen ve algılama yolunda bir de-tarama sistemi yarığın konumunda uyarma tarama çizgisinin bir statik bir görüntü oluşturur. Üçüncü bir tarama sistemi kamera sensör üzerinde iki boyutlu bir görüntü yeniden yapılandırır. CLSM temizlenir fare% 100 kontrastlanma tanıyorKonvansiyonel ışık levha mikroskobu ile ilgili beyin, bir 10 Hz kare hızını korurken. CLSM sayesinde Z 2 XY um ve 9 um çözünürlüğü ile tüm fare beyinleri yeniden ve tek bir floresan etiketli nöronlar ayırt etmek için yeterli kontrast mümkündür.

Bu maddede biz CLSM ile bir fare beyni yeniden deneysel boru hattı açıklar. Aldehit sabit fare beyinleri peroksit içermeyen tetrahidrofuran serileri içinde suyu alınır ve daha sonra Becker et al. 10 temizlenir numune tarafından geliştirilen protokol izlenerek, peroksitsiz dibenzil eter (Şekil 2) temizlenmiş sonra dikkatli bir şekilde monte edilir uçlu plaka ve bir ısmarlama konfokal ışık levha mikroskop görüntüleme odasında konumlandırılmış. Alternatif olarak temizlenir agaroz jel bir disk (şekil üzerinde yapıştırılmış olabilir, örnek, doğrudan plaka (Şekil 3a) bir ucu üzerine dalma ile monte edilebilir3b) ya da temizlenmiş agaroz jeli (Şekil 3c) yapılmış bir beherin boşluğuna yerleştirilir. Birçok paralel komşu yığınları tüm beyin hacmi (Şekil 4) kapsayacak şekilde edinilen gibi tüm beyin bir optik tomografi, sonra yapılır. Örnek konum ve şekil kaba bir ilk üreten bir ön tomografi örnekleme, görüntüleme sadece örnek tarafından işgal edilen hacim içinde olduğunu garanti eder. Tomografi yığınlar sonradan ısmarlama yazılım ile birlikte dikişli ve bir çok çözünürlüklü hiyerarşik düzeni 11 kaydedilir. Fare beyinleri sonunda Prototypal çoklu-çözünürlüklü Google Maps gibi görselleştirme yazılımları ile keşfedilebilir. Her iki yazılım araçları açık kaynak platformu Vaa3D 12 eklentileri olarak entegre edilmiştir.

Biz nihayet ince kemirgen neuroanatom okuyan açıklanan deneysel boru hattının yeteneklerini göstermek için fare beyinleri temsili görüntülerini göstermeky.

Protokol

1.. Doku Hazırlama ve Saklama

  1. 0.01 M PBS içinde% 4 paraformaldehid, 100 ml, ardından 20 ml 0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile standart transcardial 13 perfüzyon yoluyla fare beyin düzeltildi. Dikkatli bir şekilde 7.6 'hem çözeltilerin pH değerini ayarlamak: pH biraz daha düşük değerleri, EGFP floresan söndürülmesi olabilir.
  2. 4 ° C'de paraformaldehitte% 4 gecede kesilip beyinleri Post-fix
  3. 4 ° C 'de, 0.01 M PBS içinde 0.01 M PBS ve mağaza da iki kez (her biri 30 dakika) yıkayın

2. Dehidrasyon ve Takas

Not:. Dehidratasyon ve takas için protokol yakından Becker ve ark 10 tarafından açıklanan bir izler

  1. Güçlü bir kroma kullanılarak bazik aktif alüminyum oksit (Brockman aktivitesi sınıf I, THF içinde yaklaşık 250 g / L) ile XFP floresan, filtre THF söndürme dehidrasyon çözgen (tetrahidrofuran, THF), ikinci peroksitler kaldırmak içinsütunu tography. Peroksit kaldırma azaltacak, sütunun çatlama kaçının.
  2. THF önce, filtrasyondan önce stabilize edilmiş olsa bile, nihai çözeltiye dengeleyici (butile hidroksitolüen, 250 mg / L) ilave edin. Sabitleyici olmadan THF peroksitlerin büyük miktarda gelişebilir ve patlayıcı ve tehlikeli olabilir: Sabitleyici alüminyum oksit tarafından muhafaza aslında.
  3. Daha sonra% 50,% 70,% 80,% 90,% 96,% 100, 1 saat, her biri bir gece boyunca% 100: bütün fare saf su içinde THF bir aşamalı dizi beyin kurutmak. Dönen bir tekerlek üzerinde numune ile şişe yerleştirin. Işık maruz kalmasını önlemek için, bir alüminyum folyo ile sarın şişeleri.
  4. Alüminyum oksit ile temizleme çözücü (dibenzil eter, DBE) filtrele (aktif temel aktivite seviyesi Brockman I, DBE yaklaşık 250 g / L), bir filtre hunisi kullanılarak.
  5. % 100 DBE de örnek temizleyin. 3 ve 6 saat sonra çözelti değiştirin.

3. Montaj Numune

  1. Beyin, göz (Tipik kanalı'nın tarafından şeffaf görünüyor zamanİkinci DBE değişiklikten sonra Cally 1 saat), aşağıdaki yöntemlerden biri ile uçlu görüntüleme plaka üzerine monte:
    1. Doğrudan montaj - yavaşça ipuçları biri (Şekil 3a) üzerinde örnek dalma.
    2. Agaroz disk - ipuçları 6% agaroz jel yapılmış bir disk dalıyoruz. Yavaşça akrilik yapıştırıcı ile agaroz disk üzerindeki örnek düzeltmek (Şekil 3b). Tedavi için yaklaşık 1 dakika bekleyin.
    3. Agaroz beher - ipuçları% 3 agaroz jel yapılmış bir beher dalıyoruz. Yavaşça beher altındaki (Şekil 3c) üzerine numuneyi.

Not 1: bütünüyle örnek görüntüleme önemli olduğunda agaroz beher içinde montaj tercih edilmelidir, ancak, numuneyi çevreleyen agaroz jel görüntü kalitesi için zararlı olabilir, ek ışık dağılımı meydana getirir. Numunenin çok küçük bir bölümü görüntüleme dışında olabilir, bu spec monte etmek daha iyidiragaroz diskte veya doğrudan ucunda imen. Eski yöntem en iyi (koku ampuller bir kısmını görüntüleme veya spinal kord hariç) dikey beyin tutmak için yatay beyin (beynin ventral ve dorsal kısmını görüntüleme itibaren hariç), ikincisi tutmak için uygundur.

Not 2: açıkça saydam olana kadar agaroz jel (% 50 ve% 100 her biri 4 saat) daha sonra susuz THF ile su içinde hazırlanabilir, ve DBE,% 100 temizlenmiş 4 saat ya da gerekmektedir.

  1. Yukarıdaki yöntemlerden birine sonra numune monte edildikten sonra, cımbız kullanarak numune odasının içine görüntüleme plaka yerleştirin. Çözeltisi temizleme odası ile doldurun.

4. Tomografi Hazırlık

  1. Mümkün olduğu kadar çok floresan toplamak için yarık çıkarın.
  2. Photobleaching önlemek için, düşük lazer gücü ile örnek aydınlatın.
  3. Yazılım odaklı micropositioning syste kullanarak üç yönde örnek hareketm. Her yön için örnek ışıklı ve kamera (Şekil 4a) görüş alanı içinde olduğu olduğu için minimum ve maksimum koordinatlarını belirlemek.
  4. 'Pre-tomografi' alt yordam için parametre olarak yukarıda koordinatları yerleştirin. Ayrıca tomografi kullanılmak üzere bitişik yığınlar arasındaki mesafeyi ve z yönünde ön tomografi örnekleme adım belirtin.
  5. (4.4) de belirtilen z örnekleme ile her yığınında görüntüleri toplar ön tomografi, başlatın.

Not: Toplanan görsel örnek şekil ve konum kaba bir ilk görüntüleme süresini azaltır ve bu nedenle, foto ağartıcı sadece gerçekten numune kapladığı hacme tomografi satın alma sınırlayan sağlar: (Şekil 4b), hazırlanması için bir yazılım tarafından kullanılır.

5. Tomografi Acquisition

  1. Micropositioning sistemi kullanılarak ışık tabakanın dışında örnek hareket ettirin.
  2. A.Ş.rease lazer gücü ve görüş alanının merkezinde tek bir sabit hat aydınlatmak amacıyla, tüm tarama sistemlerinin hareketini durdurur.
  3. Yarık montaj ve takas çözüm otofloresans sinyali kullanarak hizalayın. Bu açıkça görüş alanının merkezinde yarık satır göreceksiniz.
  4. , Tarama sistemini yeniden aktive lazer gücü azaltmak ve micropositioning sistemi kullanılarak ışık tabakanın içindeki örnek hareket ettirin. Yarık birlikte kullanılan lazer gücü, ışığın uzamsal filtre blok yana olmayan bir ihmal edilebilir bir payıdır olmadan kullanılan daha yüksek olacağını not edin.
  5. Görüntüler net ve parlak bir görünüm kadar, genlik ayarlayın ve kontrol yazılımı ile tarama ve de-tarama sistemlerinin ofset.
  6. Deney için uygun z adımı ayarladıktan sonra, tomografi toplama yazılımı çalıştırın. Hacmi çok paralel, kısmen örtüşen yığınlarının (Şekil 5a) görüntülü olacak, ve görüntüler kaydedilirhiyerarşik bir klasör yapısı.

6. Dikiş ve Görselleştirme

  1. Bir otomatik yazılım (Şekil 4c) kullanarak sentetik siyah görüntüleri ile (toplanan aynı tip ve boyutlarda yani görüntüleri olanlar-, ama sıfır yoğunluğu ile) edinilen seviyesini tamamlayın. Bu adım, tam bir küp hacmi ile başa çıkmak için dikiş yazılım için zorunludur.
  2. Başlat Vaa3D yazılım (serbestçe indirilebilir http://www.vaa3d.org/ TeraStitcher ve TeraManager yüklü eklentileri ile).
  3. TeraStitcher eklentisi yükleyin. Görüntülü hacim içeren dizini seçin, (bir referansa göre koordinat sistemi sağlak) eksenlerin göreli yönelimleri işaret ve voksel boyutu.
  4. Dikiş ilk bölümünü başlatın. Yazılım yığınlarının çiftler arasındaki nispi yer değiştirmeyi hesaplamak, ve genel bir optimum placem bulabilirsinizbirlikte tüm yığınlarının ent (Şekil 5b).
  5. Tek çözünürlükte veya çoklu-çözünürlük formatında dikişli hacmini kaydetmek için seçin. İkincisi TeraManager eklentisi ile çoklu-çözünürlüklü görüntüleme için olanak sağlar. Yüksek çözünürlüklü görüntü birkaç gigabayt daha büyük ise her iki durumda da, aynı yöntemi kaydetmek çok yığını seçin ve bireysel substacks boyutunu belirtin. Bu depolanan verilere verimli bir erişim sağlayacak.
  6. Dikiş ikinci bölümünü başlatın. Yazılım hizalanmış yığınları birleştirme ve tek veya çoklu-yığın modu (Şekil 5c ve 5d) onları kurtaracak. Sonunda TeraStitcher eklenti kapatın.
  7. TeraManager eklentisi yükleyin. Çok yığılmış çok çözünürlüklü hacmi ile klasörü seçin ve voksel boyutunu gösterir ve yönelimleri eksenleri. Hacmi minimum çözünürlükte yüklenecektir.
  8. Daha yüksek bir çözünürlüğe yakınlaştırmak için, sağ-tıklama modalit kullanarak bir dönüm noktası seçinVaa3D y, sonra fare kullanarak kaydırma yakınlaştırmak. Alternatif olarak doğrudan bir sağ tıklama ile yakınlaştırmak için ROI seçin, ya da ilgi hacminin koordinatlarını belirleyebilirsiniz.
  9. Düşük çözünürlüğe geri yakınlaştırmak için, sadece fare kaydırma kullanın.

Sonuçlar

Açıklanan protokol, fiziksel kesit için gerek kalmadan, mikron çaplı bir çözünürlük tüm Fare beyinleri ya da kesilmiş ya da parçalar ile yeniden kullanılabilir. Temsili bir sonucu olarak, Şekil 6'da bir L7-GFP fare (doğum sonrası gün 10) bütün serebellum gösterilmiştir. Bu hayvanın tüm Purkinje nöronlar EGFP'nin ile etiketlenmiş. Biraz yakından bakarsak, serebellar korteks tipik katmanlı yapının (Şekil 7) görülebilir. Dahası yakınlaştırma açıkça her Purkinje hücre soma (Şekil 8) ayırt sağlar. Açıklanan protokol, böylece çeşitli nörogelişim çalışmalarda nöronal mekansal organizasyon taranması için kullanılabilir.

Ikinci bir tipik Sonuç olarak, yetişkin bir thy1-GFP-M fare beyninden unsectioned görüntüler sunmak. Bu transgenik hayvanda EGFP rastgele seyrek nöronal alt kümesi olarak ifade edilir. Beynin sağ yarısı Şekil 9'da gösterilmiştir. Olarak,ayrıca zoom-in ve daha da (Şekil 10 ve 11), nöronal süreçleri ayırt olur. Bu sonuç, tarif edilen protokol nörodejeneratif hastalığın fare modellerinde hücre çözünürlükte tüm beyin eğitim anatomiyi olasılığını açılması, tüm yetişkin fare beyinlerinde mikron çaplı çözünürlüklü görüntü olanak sağladığını gösterir.

figure-results-1
Şekil 1. Uyarma yolunu gösteren aparatın konfokal hafif levha mikroskobu (CLSM) optik şeması. (A) Üst görünümü. 488 nm diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer lazer emisyon, ilk teleskop tarafından genişleme ve kolimasyonu sonra, ışın yoğunluğunu ayarlayan bir acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF) girer. Daha sonra, ikinci bir teleskop daha da ışın genişletir. (Y birlikte) dikey bir galvo ayna olmak tarar deteksiyon yolunu gösteren tertibatın numune odasının iç tarafında bir mercek tarafından odaklanmıştır AM. (b) yanal görünüşüdür. Algılama objektif tarafından toplanan hafif dikey bir galvo ayna tarafından descanned ve hareketli uyarım hattı sabit bir görüntü üreten, bir lens tarafından odaklanmıştır. Sabit görüntünün konumunda bir doğrusal uzamsal filtre (yarık) yerleştirilir. Yarık sonra, 4f lens sistemi içine yerleştirilen bir galvo ayna, bir elektron-çarparak şarj bağlı cihaz (EM-CCD) ve çip üzerinde 2 boyutlu görüntüyü yeniden yapılandırır. Bir floresan bant geçiren filtre tespiti önce tüm uyarma başıboş ışık kaldırmak. Uyarma, algılama ve bant geçiren filtreden algılama ışık Temsilcisi ışınları sırasıyla, mavi, açık mavi ve yeşil ışınları tarafından tasvir edilmektedir. Aslında mikroskop kullanılan tüm lenslerin odak uzunlukları gösterilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

"fo: keep-together.within-page =" jove_content hep "> figure-results-2
Şekil 2,. Örnek takas. Formaldehit sabit fare beyinleri, 4 ° C'de PBS içinde 0.1 M depolanır (a), ((THF, b) ve daha sonra% 100 dibenzil eter içinde temizlenmiş, tetrahidrofuran kademeli bir dizi suyu alınır DBE , c). Dehidratasyon adım, aynı zamanda bazı doku büzülme neden olur.

figure-results-3
Şekil 3.. Numune CLSM görüntüleme için montaj. Temizledi beyni doğrudan (a), temizlenmiş bir agaroz disk (b) üzerine yapıştırılmış veya temizlenmiş bir agaroz beher (c) takılı uçlu montaj plakası üzerine dalmış olabilir.

figure-results-4
Şekil 4. Tomografi elde etme. Ön tomografi rutin örnekleri beyin (a) bir görüntü için tüm gerekli numune paralel komşu yığınlarının sayısı ve uzunluğu tanımlamak için ihtiva eden bir paralel yüzlü (b). Tomografi sonra, siyah görsel bir paralelyüzlü sanal alınan hacmi tamamlamak için oluşturulan (c).

figure-results-5
Şekil 5,. Cilt dikiş. Toplanan görüntü kısmen TeraStitcher eklentisi (b) ile hassas uyumu sağlayan, (a) aralarında üst üste yığar. Eklenti daha sonra, tek yığılmış (c) ya da çok-sta ya hizalanmış yığınları birleştirircked (d) çoklu çözünürlük gösterimi.

figure-results-6
Şekil 6,. Tüm Purkinje nöronları EGFP. Ölçek çubuğu, 1 mm ile etiketlenmiş olduğu bir P10 L7-GFP fare, tamamı serebellum.

figure-results-7
Şekil 7. Serebellar korteks. Ölçek çubuğu, 500 um, tipik katmanlı yapısını gösteren, Şekil 6'da gösterilen beyincik bir kısmı, bir zoom-in.

figure-results-8
Şekil 8,. Şekil 6'da gösterilen serebellum bir bölümünün ayrıntılı zoom-in. Purkinje hücreleri soma açıkça ayırt olabilir,ed. Ölçek çubuğu, 200 mikron.

figure-results-9
Şekil 9,. Seyrek spesifik nöronal EGFP etiketleme. Ölçeği bar, 1 mm ile karakterize bir yetişkin thy1-GFP-M fare, gelen beynin sağ yarısı.

figure-results-10
Şekil 10. Yaklaştırma, Şekil 9'da gösterilen yarı beyin bir kısmının,. Ölçek çubuğu, 200 um hipokampus ve korteks bir kısmını gösteren.

figure-results-11
Şekil 11. Kortekste, Şekil 9'da gösterilen yarım beynin bir bölümünün ayrıntılı Yaklaştırma. Çeşitli neurites açık bir şekilde ayırt edilebilir. Ölçek çubuğu, 50 um.

Tartışma

Kimyasal temizlenmesi ile birleştiğinde CLSM floresan probları, proteinler ya da sentetik boyalarla işaretlenmiş tüm fare beyinleri nöroanatomisini incelemek için güçlü bir araç temsil eder. Odak düzlemi dışında yayılan ışık fiziksel mekansal filtre tarafından engellenen beri hafif levha mimarisinin tipik yüksek çerçeve hızlarını korurken, yüksek kontrastlı görüntüleme, kalın kesitlerle da mümkündür.

Açıklanan yöntemler kullanılarak zaman başa ana konu kontrast maksimizasyonu olduğunu. Aslında, mevcut sinyal kimyasal ve optik faktörler tarafından her iki düşürülür. Bakış kimyasal açıdan bakıldığında, bir organik çözücü göre temizleme işlemleri floresan protein ve diğer floresan boyalar 7 emisyon söndürülmesi olabilir. Becker et al., 10 tarafından tarif edildiği gibi çözücünün süzülmesi, peroksitleri çıkarmak için, solvent-temizlenmiş dokularda da floresan iyi bir düzeyde muhafaza sağlar. YayınlamakTüm kemirgen beyinleri ile uğraşırken ed su bazlı temizleme yöntemleri 14 en azından doğrusal optik teknikleri ile, floresan verimliliğini azaltır, ancak yoksul şeffaflık yol açmaz.

Diğer yandan, şu anda, yüksek kırılma indeksi (n ≈ 1.56) kullanılan çözümler temizleme için düzeltilmiş uzun çalışma mesafesi olan ticari amaçlar vardır. Bu durumda, numune içine gömülmüş olduğu orta ve objektif tasarımında bir kırılma endeksi arasındaki uyumsuzluk güçlü küresel sapmaları yol açmaktadır. Mikroskobun çözünürlüğünü azaltarak yanı sıra, bu tür sapmaları ışığı daha geniş bir alana yayılmış olduğundan, görüntü yoğunluğu ve kontrast bir düşüşe neden. Bu konuya Yapılabilecekler uyarlanabilir optik 15 ve / veya statik asferik düzelticisi kullanımını içerir.

Daha kısa bir görüntü kontrast Başlangıcı ve yoğunluk herhangi bir gelişme, hali hazırda, aynı zamanda görüntüleme hızını etkilergörüntü başına tegration zaman seçilebilir. Şu anda CLSM 100 msn 9 bir kamera maruz kalma süresi ile, yaklaşık 10 um 6 3 / sn 'lik bir görüntüleme hızı gelemez. Bu hızda bu numune boyutuna bağlı olarak 1-3 gün görüntüye bütün bir fare beyin alır. Görüntü kalitesinde önemli bir bozulma çünkü çoğunlukla hafif sac aydınlatma 6 içsel düşük ağartmanın böyle uzun görüntüleme oturumu boyunca görülmekle birlikte, uzun süre tek bir fare beyin pratikte CLSM uygulanabilirliğini azaltabilecek görüntü gerekiyordu. Tespiti için yüksek hızlı kameranın kullanımı ile birlikte sistem verimliliği bir 10-kat artış, tarif edilen protokol rutin bir kullanımına izin veren, bir kaç saat için bir görüntüleme zamanı azaltacaktır.

Tüm yukarıda belirtilen sınırlamalara rağmen, az bir de mikron çaplı bir çözünürlüğe sahip tüm fare beyinleri yeniden dokular izinlerinin kimyasal açıklığa birleştiğinde CLSM görüntülemehafta. Tüm beyin görüntüleme için diğer optik yöntemler CLSM daha yüksek çözünürlüğe göze, ancak daha uzun hazırlık ve / veya görüntüleme süresi 2-4 fiyata, ya da seyrek z örnekleme 5.

Bu makalede açıklanan yöntemler floresan etiketlemesi için farklı stratejiler ile kombinasyon halinde kullanılabilir: transgenik hayvanlar, vb seçilmiş nöron alt gruplarının, viral transfeksiyonu, intraparenkimal boya enjeksiyon, floresan proteinleri ifade Uygulamada, hayvan kurban önceki tüm boyama stratejileri CLSM uyumludur . , Boyama bu tür yakın gelecekte mümkün olurdu neyse, CLSM ile yeniden olabilir örneklerin sayısı daha fazla olur, aslında, tüm fare beyinleri otopsi floresan etiketleme bugüne kadar ortaya konmamıştır potansiyel olarak insan beyin dokusu da dahil olmak üzere.

Sonuç olarak, konfokal mikroskopi ışık tabaka TBS ile birlikte kullanılırsue takas ve çok çözünürlüklü veri yönetimi araştırmacılar çoğu laboratuarların elinde iyi olan teknolojik çabaları ile, mikron ölçeğinde çözünürlüğe sahip makroskopik örnekleri yeniden ve analiz etmek için izin verebilir. CLSM potansiyel uygulamaları nörobilim sınırlı değildir elbette, ama 16,17 ve küçük hayvanların 18 anatomisini embryogenesis olarak, hafif levha mikroskobu zaten kullanılmış olan tüm araştırma alanları kapsar.

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu sonuçlara yol açan araştırma n hibe anlaşmaları kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) fon aldı. 228334 ve 241526. Bu araştırma projesi, aynı zamanda İnsan Frontier Bilim Programı araştırma bursu (RGP0027/2009) tarafından desteklenen ve olmuştur Flagship Proje Nanomax çerçevesinde Eğitim, Üniversite ve Araştırma İtalyan Bakanlığı tarafından ve çerçevesinde İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından "Kök Hücreler Teklif Çağrısı". Bu araştırma, "Ente Cassa di risparmio di Firenze" tarafından desteklenen ICON vakıf araştırma faaliyetlerinin çerçevesinde yürütülmüştür.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfat Tamponlu Tuzlu TabletlerSigma-AldrichP4417_100TAB
ParaformaldehitAgar ScientificR1018
Peroksit içermeyen TetrahidrofuranSigma-Aldrich186562
Alüminyum oksit aktif, bazik, BrockmannI Sigma-Aldrich199443
Dibenzil eterSigma-Aldrich108014
Bütillenmiş hidroksitoluenSigma-AldrichW218405
Agaroz Tip III-A, Yüksek EEOSigma-AldrichA9793
Akrilik yapıştırıcıBostikD2498
Vaa3D yazılımıaçık kaynakhttp://www.vaa3d.org/

Kaynaklar

  1. Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
  2. Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
  3. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
  4. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
  5. Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
  7. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  8. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
  9. Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
  10. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916(2012).
  11. Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316(2012).
  12. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  14. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  15. Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
  16. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  18. Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1(2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Beyin G r nt lemeDoku effafla t rmaG r nt Birle tirmeok z n rl kl G rselle tirmeFloresan Protein EtiketlemeBenzil Eter effafla t rmaDehidrasyon ProtokolYaz l m Navigasyonu

İlgili makaleler