Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Summary

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Abstract

Reaktif oksijen türleri (ROS) dinamik olarak birbirlerine ya da katalitik olarak ya da kendiliğinden ortadan reaktif ve kısa ömürlü oksijen-içeren moleküllerin, bir dizi ihtiva eder. Nedeniyle çoğu ROS ve kendi kaynakları ve subselüler yerleşimlerin çeşitliliğinin kısa yaşam süreleri için, tam bir resim sadece protokolleri bir arada kullanırken dikkatli ölçümler elde edilebilir. Burada, bir OxyBurst Yeşil (OBG) kullanarak üç farklı protokoller kümesi kaplı boncuklar, ya dihydroethidium (DHE'nin) sunmak ve Amplex ultrared (AUR), nitelik ve nicelik gibi Dictyostelium'da gibi profesyonel fagositlerin çeşitli ROS izlemek için. Biz dinamik tek hücre düzeyinde intraphagosomal ROS üretimi görselleştirmek için boncuk kaplama prosedürleri ve ikinci el OBG kaplı boncuklar ve canlı mikroskopi optimize edilmiş. Biz E'den lipopolisakkarid (LPS) tarafından tanımlanan Dictyostelium'da ROS üretimi için güçlü bir uyarıcı olarak coli. Ayrıca, developed gerçek zamanlı kantitatif olarak, sırasıyla, hücre içi ve hücre dışı H süperoksit ₂ O ₂ üretimi ölçmek için DHE ve AUR kullanılarak orta verimlilik gösteren deneyler.

Introduction

Reaktif oksijen türleri (ROS) bu tür bir ev sahibi savunma, sinyalizasyon, doku gelişimi ve yaralanmaya yanıt olarak, hipertansiyon ve kanser gibi biyolojik süreçlerin çeşitli katılmaktadırlar. Iyi çalışılmış phagosomal NADPH oksidaz makine nötrofillerin phagosomes ¹ yutulur bakterileri öldürmek için, oksidatif patlama olarak bilinen hızlı ROS üretimi, adamıştır. Buna ek olarak, mitokondriyal solunum zinciri, bir yan ürün olarak elektron kaçak önce sadece ROS düzensiz bir kaynak için sorumlu olduğu düşünülmektedir. Ancak, son zamanlarda, bu fare makrofaj ² bakteri intraphagosomal öldürülmesine katkı önemli bir mekanizma olarak tespit edilmiştir. Son yıllarda, sosyal amip, Diktiyostelyum, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının hücre içsel mekanizmaları incelemek için güçlü ve popüler bir model haline gelmiştir. Nitekim, Diktiyostelyum ve insan fagositlerdir Molecula içinde korunması bir şaşırtıcı derecede yüksek paylaşmakbakteriler, yutulmasına algılama ve ^3,4 öldürmekten sorumlu r makine. Proteinler ve bu NADPH oksidazlar, katalazlar, süperoksit dismutazlar olarak ROS üretimi veya detoksifikasyon ile ilişkili enzimlerin homologları, insan ve Dictyostelium hem de bulunabilir. En iyi incelenmiş amip gibi, Dictyostelium memeli bir model sistem üzerinde birçok benzersiz avantajlar sağlar. Bunlar, 8-10 saat arasında bir ikiye katlanma süresi ile, _CO2 için gerek kalmadan, oda sıcaklığında büyümesi. Kolaylıkla yapışkan ya da süspansiyon kültürleri olarak tutulabilir. Buna ek olarak, onların tam sıralı ve açıklamalı haploid genom için, kolay ve genetik manipülasyon sayesinde, Diktiyostelyum çok cazip bir deneysel model organizma olmuştur.

Önceki çalışmalarda, ROS ile oksidasyon, sonra flüoresans yayarlar (toplu olarak OxyBurst Green, obg olarak da bilinir) çeşitli klorlu fluoresein ve türevleri, flüorlanmış bir ROS muhabir olarak kullanılmıştır. Hücre-permeant esthücre-geçirgen olmayan dekstran-veya protein-birleştirilmiş türevleri, hücre dışı ROS ölçmek için kullanılır ise erified türevleri sitoplazmik ROS ölçmek için kullanılır. Özellikle, OBG BSA ile kaplanmış boncuklar daha önce memeli hücrelerinde ⁵ phagosomal ROS üretimini tespit etmek için kullanılmıştır. Ancak, mikroplaka okuyucu-temelli yaklaşım sadece hücrelerin bir nüfus bir ortalama ROS nesil eğrisini verebilir. Mevcut protokol ile Diktiyostelyum, profesyonel phagocyte ve optimize edilmiş deney şartları kullanılarak, biz boncuklar üzerine herhangi opsonin conjugating olmadan istikrarlı ve verimli fagositozisi edinin. DHE ROS üretimi ^6-9 tespit etmek için, memeli nötrofiller ve makrofajlar gibi çeşitli model sistemlerinde, kullanılmıştır. Bu arada, yöntem ^8,10 özgüllüğü ve duyarlılığı üzerinde bazı tartışmalar vardır. Amplex Red, AUR ölçmek için daha uygundur, pH, daha az hassas olan bir floresan yoğunluğunun geliştirilmiş bir versiyonu olarakNonneutral ya da zayıf asidik çevrelerde ROS. AUR Geçenlerde birkaç memeli sistemlerinde ^11,12 tatbik edilmiştir, ancak oldukça sık zayıf asidik büyüme ortamı gerektirir memeli olmayana modeller, kullanımı henüz rapor edilmemiştir. Buna ek olarak, nicel ve dinamik sosyal amip Diktiyostelyum ROS üretim ve yerelleştirme ölçmek için yayınlanmış protokol yoktur.

Protokoller sunulan kümesinin amacı çeşitli ROS ve yerelleştirme izlemek için kolay ve çok yönlü bir çözüm sağlamak ve daha fazla ROS ile ilgili hücresel mekanizmaları içgörü vermektir. OBG deneyi için, Dictyostelium hücreler tarafından OBG-kaplı tanelerin alımından sonra phagosomal ROS kuşağın tüm süreç izlemek için canlı mikroskobu kullanılır ve bakteri öldürme intraphagosomal mekanizmasını incelemek için yeni bir yaklaşım sağlanmaktadır. Bu hücre içi superox ölçmek için, Dictyostelium 'da orta verim DHE ve AUR tahlilleri optimizegüçlü bir ROS uyarıcı olarak LPS ile sırasıyla ide ve hücre dışı H ₂ O ₂ üretimi,. Son zamanlarda LPS fagosite bakteriler ¹³ doğru Dictyostelium bakterisit aktivitesini artırdığı gösterilmiştir dikkat etmek gerekir. Buna ek olarak, DEDTC ve katalaz ile tedavi açıkça bu iki yöntem özellikle farklı türde ve Dictyostelium'da ROS hücre içi lokalizasyonu ölçmek olduğunu doğruladı. Son olarak, OBG deneyi daha da hayvan hücrelerinin fagositik reseptörleri için ligandlar olan boncuk opsonizing ile, herhangi bir yapışkan fagositik bir hücre için adapte edilebilir. İlke olarak, DHE ve AUR deneyler ayrıca ince ayarlı uygun deneysel koşullar altında herhangi bir yapışkan ya da yapışkan olmayan hücre ölçümler için olabilir.

Protocol

1.. Görselleştirme ve Phagosomes ROS Üretim Niteliksel Ölçümü

OBG-kaplı boncuklar önceden hazırlanmış olmalıdır. Boncuk kaplama prosedürleri ve ağar bindirme tekniği yayınlanmış kaynaklardan ^5,14 uyarlanmıştır.

1. Bir 1.5 ml tüp içine 3,0 um karboksillenmiş silis boncuklar (yaklaşık 1.8 x 10 ⁹ boncuk) 1 ml süspansiyonu ekleyin, taneler hızlı bir dönüş ve vorteks ile 1 ml PBS ile 3 kez yıkayın.
2. 25 mg / ml siyanamit (BSA prelabeled kovalent bağlamak için karboksillenmiş silis boncuklar aktif hale getirmek için) ihtiva eden 1 ml PBS içinde yeniden süspanse boncuklar, 15 dakika boyunca bir tekerlek üzerinde inkübe edilir.
3. Birleştirme 1 ml tampon ile yıkayın 3x hızlı bir dönüş ile (0,1 M sodyum-borat, pH 8.0) (alternatif olarak 5 saniye boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde küçük tam hızda santrifüj ya da bir masa üstü santrifüjü içinde 1 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüj) ve fazla siyanamid çıkarmak için karıştırın.
4. C 500 ul ile yıkandı, boncuk karıştırınOxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihidro-2 ', 4,5,6,7,7'-hexafluorofluorescein)-BSA 1 mg içeren tampon oupling, standart kapatma önce gaz-can nitrojen gazı ile tüp doldurmak ve karanlıkta, oda sıcaklığında 14 saat boyunca (gece boyunca) bir tekerlek üzerinde inkübe edilir.
5. Boncuklar (PBS içerisinde 250 mM glisin) hızlı bir dönüş ve vorteks ile söndürme tampon kaldırmak için bağlantı tamponu ile iki kez reaksiyona girmemiş obg kaldırmak ve su verme için tampon 1 ml 2x yıkayın.
6. BSA'ya konjuge Alexa Fluor 594 süksinimidil ester, 50 ug içeren bağlama tamponu 1 ml ilave edilir. Kapatma önce azot ile tüp doldurun ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat için bir tekerlek üzerinde inkübe edilir.
7. Boncuklar hızlı bir dönüş ve vorteks ile 1 ml PBS ile 3 kez yıkanmış, daha sonra, taneler hızlı bir dönüş ve reaksiyonu durdurmak için girdaplanır tampon söndürülmesi, 1 ml ile 3 kez yıkayın.
8. Son olarak, uzun süreli depolama için v azit / ağ% 10 2 ul PBS içinde 1 ml boncuk tekrar süspansiyon. Concentratio ölçünBir hemasitometre (genellikle yaklaşık 1-2 x 10 ⁹ boncuk / ml) ile süspansiyon içinde boncuk n, daha önce azot ile kapatma tüpü doldurmak ve karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
9. OBG fluoresein kaplama etkinliği, 500 nm'de uyarma kullanılarak emisyon spektrumunu kontrol ile test edilebilir. Yaban turpu peroksidaz (HRP) mevcudiyetinde, _{H2O 2} yükseltgenmiştir olduğunda, emisyon tepe (538 nm) oksitlenmiş boncuk floresans yoğunluğu, nonoxidized kaplanmış boncuklar daha 11-12x daha yüksektir.
10. Hasat katlanarak optik şeffaf plastik veya cam alt ile 3 cm yemekleri hücrelerin farklı yoğunlukları plaka ve gecede onları büyümek, 10 cm Petri kabı Diktiyostelyum hücreleri büyüyor. Deney için yaklaşık% 80 konfluent olan tabakları seçin. Dictyostelium hücrelerin yetiştirilmesi için detaylı bir protokol ¹⁵ yayınlanmıştır.
11. Loflo ortamında (LF ortamı) ile kültür ortamı yerine inkübasyonaHL5C kültür ortamının hücre dışı ve intraendosomal otoflüoresanı azaltmak amacıyla, deneyden önce 2 hr.
12. Buna paralel olarak, 10-15 bekle, yaklaşık 1 mm kalınlığında bir agar tabakasının oluşturulması için düz bir yüzey (10 cm x 10 cm, yani, bir cam plaka) üzerine dökün agar, LF ortam içinde, 10 ml% 1.5 Bacto agar eriyik dk katılaşmaya. Daha sonra kullanmak için LF ortamda 2 cm x 2 cm kareler ve yeri içine agar tabakası kesti.
13. Bu arada, iplik-diski veya geniş alan mikroskobu hazırlamak 22 ° C çevre odasının sıcaklığını ayarlamak ve bu deney için ayarları yapın. (Tartışma ek açıklamalara bakınız).
14. Kuluçkadan 2 saat sonra, 3 cm çanak LF ortam aspire, ancak hücre ortamı hala tek tabaka ince bir film tabakası ile kaplanmış olmalıdır. 1.5 x 10 ⁷ boncuk / ml 'ye seyreltilir kaplı boncuklar ve hücre tabakası üzerine 10 ul ekle.
15. Bir kare ağar levha alın, aşırı sıvı drenaj ama ıslak tutun. Yavaşça inci koymakHücre tabakanın üstünde e agar kare. Bu hücreleri üzerinde yatarken ağar kare hareket ettirmeyin. Agar kalıbı böylece alımını arttırır, boncuk ve hücreler arasındaki teması geliştirmek için kullanılabilir ve aynı zamanda hafifçe amaç odak düzleminde daha tutarak, hücreleri sıkıştırmaktadır.
16. , Yemeğin üzerine kapağını yerleştirin mikroskop sahne üzerine yerleştirin ve otomatik olarak, kırmızı, yeşil ve faz kanallarda fotoğraf çekmek 2 saat ya da daha uzun süre her 1 dk.
17. Seçin ve fagositoz tüm süreci içeren hücresel olaylara odaklanır. Optimize 3 kanal Birleştirme ve profesyonel görüntü işleme yazılımı kullanarak bir film haline resimleri bir araya. Kırmızı ve yeşil kanallarda seçilen her boncuk floresan yoğunluğu ölçmek ve yeşil / kırmızı oranı, hücrelerin dinamik phagosomal ROS üretimini yansıtır.

2. Hücre içi süperoksit Üretim Kantitatif ve Orta-verimlilik ölçümü

1. O toplayınne% 80 konfluent HL5C ortamı 10 ml Dictyostelium'un tabak. 5 dakika dikkatlice ve tamamen aspire aşırı ortam için 850 xg santrifüj Diktiyostelyum hücreleri. SS6.4 tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücreleri [Sorensen tamponda 0.12 M sorbitol (14,69 mM KH ₂ PO ₄ ve 6.27 mM Na ₂ HPO _4), pH 6.4], hücrelerin sayısı ve 6 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir son yoğunluğa seyreltilmiş (tartışma ek yorumlara bakınız).
2. (Tartışmada ek açıklama bakınız), saydam olmayan, beyaz bir 96 yuvalı plakanın her oyuğuna hücre süspansiyonu, 50 ul ekle.
3. Gerekirse her bir çok kanallı pipet kullanarak içine DHE stokları (DMSO içinde 30 mM) ile seyreltildi DHE SS6.4, pipet 50 ul ile 500 kat seyreltilir. DHE nihai konsantrasyonu, 30 uM'dir. Reaksiyon hemen başlar.
4. Uyarılar veya inhibitörleri özel ihtiyaçlarına göre bu noktada ilave ya da başka bir zaman noktalarında edilebilir.
5. Son nokta "üst okuma & # kullanın34, 522 nm/605 nm fluoresans uyarım / emisyon ile bir floresan mikroplaka okuyucu, şekli, 22 ° C'de, 1 saat, orta çalkalama 5 saniye / dakika boyunca her 2 dakikada bir okuma

3. Kantitatif ve hücre dışı Yüksek Verimli Ölçüm H ₂ O ₂ Üretimi

1. 2.1 ve 2.2 'de açıklandığı gibi aynı adımları izleyin.
2. SS6.4, girdap 10 ml HRP stoklar 5 ul (damıtılmış su içinde 100 U / ml) eklenerek seyreltilmiş HRP hazırlayın ya da iyice karıştırın ve daha sonraki kullanım için buz üzerinde tutmak için tüp ters. Seyreltilmiş HRP solüsyonu 0,05 U / ml 'de olduğu.
3. Sırasıyla AUR stok (DMSO içinde 10 mM AUR) ve 6.25 uM nihai konsantrasyonlara SS6.4 tampon seyreltilmiş HRP solüsyonu ve 0.005 U / ml karıştırılarak AUR tepkime karışım hazırlayın. Bir örnek olarak, 40 reaksiyonlar için reaksiyon karışımı hazırlamak için seyreltilmiş HRP 400 ul ve AUR stok çözeltisi 2.5 ul SS6.4 1600 ul karıştırın.
4. AUR karışımı 50 ul ekleGerekirse her zamanda bir çok kanallı pipet kullanarak içine Ture. Şimdi reaksiyon başlar.
5. Uyarılar veya inhibitörleri özel ihtiyaçlarına göre bu noktada ilave ya da başka bir zaman noktalarında edilebilir.
6. 530 nm/590 nm'de floresan uyarma / emisyon ile bir floresan mikro plaka okuyucu bitiş noktası "üst okuma" modunu kullanın, 22 ° C'de, 1 saat, orta sallamak 5 sn / dk boyunca her 2 dakikada okumak

Results

Phagosomes ROS nesil mikroskobu (Dosya S1) ile niteliksel ve dinamik görülebilir. Alexa Fluor 594 tarafından yayılan kızıl flüoresans pH-duyarlı ve obg oksitlenmesi yeşil kanal içindeki floresan artar, phagosomal ortamda sabit kalır. In vitro emisyon spektrumu oksitlenmiş ve nonoxidized OBG-kaplanmış boncuklar oksidasyon sonra yoğunluğunda önemli bir artış gösteren, Şekil 1B karşılaştırılmaktadır. Canlı etkinlikleri vizüalizasyon, iki kanal alımının 1 dk içinde Yabanitip AX2 hü...

Discussion

Daha önce anlatılan yöntemler ile karşılaştırıldığında, deney OBG dinamik yerine hücre popülasyonundan bir ortalama ROS ölçüm sinyalinin, tek hücre düzeyinde phagosomal ROS üretim süreci görüntüler. Bu tür nüfus ortalama yöntemleri nonsynchronous fagositozu nedeniyle kritik bilgilerini gizlemek için eğilimindedir. Biz başarıyla Dictyostelium'un için DHE'nin ve AUR tahlilleri uyarlanmış ve protokolleri optimize. En önemlisi, biz bu iki deneylerle ölçülen türleri ve ROS hücre içi lokalizasyonu belirtildi....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
OxyBURST Yeşil H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Karboksilatlı silika boncuklar	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C orta	ForMedium	HLC0102
LoFlo orta	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihidroetidyum	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Yaban turpu peroksidaz	Roche	10108090001
Dietilditiokarbamat (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Katalaz	Sigma	C9322-1G
Siyanamid	Sigma	187364-25G
Lipopolisakkaritler	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
>ibidi μ-Çanak 35 mm, yüksek	ibidi	81156	Alt kısım optik olarak şeffaf plastikten yapılmıştır
MatTek çanak 35 mm	MatTek şirketi	P35G-1.5-14-C	Alt kısım bir cam lamel
Asa Hücre Sayacı	Merck Millipore	PHCC00000
Beyaz 96 kuyulu plaka	Nunc	236108
Santrifüj	SORVALL	Legend RT
Mikroplaka okuyucu	BioTek	Synergy Mx