Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

4.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50722

⸱

23 Aralık 2013

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

Bu makalede

Özet

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

Özet

WRN eksonükleaz, DNA replikasyonu sırasında veya endojen veya eksojen genotoksinlere maruz kaldıktan sonra meydana gelen DNA hasarının çözülmesinde rol oynar. Aksi takdirde, WRN'den yoksun hiper-rekombinant bir hücre fenotipi ile tutarlı olarak, geçici olarak durmuş replikasyon çatallarında birikecek olan recombinojenik ara ürünlerin birikimini önlemede bir rol oynaması muhtemeldir. İnsanlarda, eksonükleaz alanı, DNA ve protein etkileşimi için önemli olan ek bölgelerle birlikte, aynı zamanda helikaz aktivitesine sahip olan çok daha büyük bir proteinin N-terminal bölümünü içerir. Buna karşılık, Drosophila'da, WRN'nin (DmWRNexo) eksonükleaz aktivitesi, varsayımsal helikazdan farklı bir genetik lokus tarafından kodlanır ve genom stabilite mekanizmalarında eksonükleaz aktivitesinin rolünün biyokimyasal (ve genetik) diseksiyonuna izin verir. Burada, saflaştırılmış rekombinant DmWRNexo ve uç etiketli floresan oligonükleotidler kullanarak WRN eksonükleaz aktivitesini belirlemek için bir floresan yöntemi gösteriyoruz. Bu sistem, substrat oligonükleotidleri aylarca stabil kaldığından radyoaktif tahlillerden daha fazla tekrarlanabilirliğe izin verir ve nükleaz polaritesinin, işlenmişliğinin ve substrat tercihlerinin belirlenmesine izin vererek nükleaz aktivitesinin ayrıntılı analizi için daha güvenli ve nispeten hızlı bir yöntem sağlar.

Giriş

Nukleazlar, hücrelerde hasarlı DNA'nın uzaklaştırılmasında, Holliday bağlantıları gibi çift yönlü olmayan yapıların çözülmesinde ve DNA replikasyonu sırasında hem DNA polimerazların içinde içsel hem de onlara dışsal olarak prova okuma kapasitesi sağlamada hayati bir rol oynar1. Nükleazlar, DNA'yı serbest uçlardan (eksonükleazlar) sırayla parçalayarak veya daha uzun bir DNA molekülü (endonükleazlar) içindeki iç fosfodiester bağlarını parçalayarak etki edebilir. Nükleaz aktivitesinin kaybı, oldukça spesifik genom kararsızlık fenotiplerine neden olabilir. RecQ helikaz ailesi üyesi BLM'nin mutasyonu, aşırı yüksek kardeş kromatid değişim oranlarına ve küresel olarak yüksek kanser oranlarına neden olurken (Payne ve Hickson2 tarafından gözden geçirilmiştir), yüksek oranda ilişkili WRN proteininin mutasyonu erken yaşlanmaya yol açar3; Bu iki aile üyesi arasındaki en önemli fark, WRN4'te bulunan 3'-5' eksonükleaz alanının varlığıdır. WRN eksonükleazın genom stabilitesinin korunmasında kritik bir rolüne dair kanıtlar, WS hastalarında5 genotiplerin analizinden, izole eksonükleaz alanının6 kristalografik çalışmaları ile desteklenen insan hücrelerindeki nokta mutasyonu ve delesyon çalışmaları ile birlikte birikmiştir. Bununla birlikte, WRN'nin eksonükleaz aktivitesi ile merkezi helikaz aktivitesi7 arasındaki işbirliği ve çapraz konuşma, her birinin işlevselliğini ve genom stabilitesine göreceli katkılarını ayırmayı zorlaştırır. Bitkilerde ve düşük metazoan hayvanlarda, WRN eksonükleaz aktivitesi,helikaz aktivitesi 8-10'dan yoksun tek bir polipeptit üzerinde bulunur (Cox ve Boubriak11'de gözden geçirilmiştir); Arabidopsis'te biyokimyasal olarak, bu eksonükleazın, omurgalı WRN9'da gözlenen birleşik enzim aktivitelerini etkili bir şekilde yeniden oluşturarak, aynı kökenli WRN helikazı ile koordineli olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Mükemmel genetik araçlar, eksonükleaz mutasyonunun etkisinin (varsayımsal akraba helikazını etkilemeden) tüm organizma düzeyinde ve gelişim yoluyla analizine izin verdiği için Drosophila'da WRN eksonükleazını inceledik10,12. Ayrıca, enzim özelliklerinin13,14 tam biyokimyasal analizine izin veren rekombinant Drosophila WRN eksonükleazı (DmWRNexo) klonladık, eksprese ettik ve saflaştırdık.

İn vitro nükleaz analizi, geleneksel olarak radyoaktif işaretli oligonükleotidler kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve akrilamid jeller4,8,15 üzerindeki ürünlerin merdivenlenmesini arayarak bozunmayı değerlendirmiştir. Hassas olsa da, bu tür tahliller, etiketli substratların radyoaktif bozunması nedeniyle günlük olarak kantitatif olarak tekrarlanabilir değildir. Ek olarak, radyoaktif reaktiflerin kullanılması ve bertaraf edilmesi önemli çevre ve sağlık sorunları doğurur; Radyolabel tedariği de giderek daha sorunlu hale geliyor. Alternatif bir yeni yöntem, nihai bozunma ürününün miktarını kütle spektrometresi16 ile değerlendirir. Bununla birlikte, zaman alıcıdır (birkaç gün sürer), özel ekipman gerektirir ve okuma, son ürün miktarıdır (tek nükleotid), bu nedenle enzim işlenmişliği gibi yönlerin hassas ölçümü veya bazı nükleotidlerin, dizilerin veya modifikasyonların nükleaz duraklamasına veya durmasına yol açıp açmadığını belirlemek için uygun değildir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, geleneksel jel bazlı tahlilleri floresan oligonükleotid substratlarla kullanım için uyarladık, uzun süreler boyunca tekrarlanabilir şekilde kullanılabilen ve böylece farklı koşullar altında nükleaz aktivitelerinin doğrudan karşılaştırılmasına izin veren kararlı bir şekilde etiketlenmiş substratlar ürettik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Substrat Oligonükleotidlerinin Hazırlanması

  1. Özel oligonükleotidleri sentezleyin.
    1. 5'-konjuge floresein molekülü ile tek sarmallı bir oligonükleotid tasarlayın; Bu, her substrat için omurga olacaktır. (Bunun 3'-5' eksonükleaz için olduğunu unutmayın; 5'-3' polariteye sahip eksonükleaz için 3'-konjuge bir omurga ipliği kullanın). Polarite bilinmiyorsa, hem 3' hem de 5' test edilmelidir.
    2. Floresan etiketli oligonükleotid tavlandığında, tercih edilen dubleks substrat(lar) oluşacak şekilde tamamlayıcı iplikler tasarlayın. Tamamlayıcı ipliğin bir floroforla konjuge olmadığına dikkat edin. Sipariş verirken PAGE-saflaştırmayı belirtin (tuzdan arındırma yeterli değildir).
    3. Oligonükleotid stoklarını 10 mM'de 1 nmol/μl'de -20 °C'de ve karanlıkta saklayın.
  2. Oligonükleotid etiketli omurgayı, her bir tamamlayıcı etiketsiz oligonükleotid ile 1: 1.2 molar oranında etiketli: etiketsiz tamponda karıştırın (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl). (Not: 1: 1 oranı en çok arzu edilir, ancak etiketli telin TÜMÜNÜN bağlı olması daha önemlidir. 1:1 - 1:1.5 oranları işe yarayabilir.)
  3. Bir su banyosunu veya ısı bloğunu 95 °C'ye ısıtın ve tavlama karışımını 3 dakika bunun içine koyun, ardından kapatın ve bütününün yavaşça (1 °C/dk) 30 °C'nin altına soğumasını bekleyin.
  4. Elde edilen dubleks substratı doğal bir %10 poliakrilamid jel (%10 19:1 akrilamid:bis-akrilamid) içinde çalıştırarak etiketli oligonükleotidin tam tavlanmasını kontrol edin Tris-Borat-EDTA (TBE, 89 mM Tris bazı, 89 mM borik asit, 2 mM EDTA) %0.05 w/v amonyum persülfat (APS) ve %0.005 v/v TEMED ile polimerize edilmiştir). PhosphorImager ile görselleştirin (aşağıdaki bölüm 5'e bakın).

2. Akrilamid Jellerin Hazırlanması

  1. Jel döküm sistemini, örneğin 16 cm x 18 cm plakalı ve 1,5 mm ara parçalı Hoefer SE400 jel teçhizatını kurun.
    1. Cam plakaları ve ara parçaları deterjan ve su kullanarak iyice temizleyin. Plakaların parmaklardan gelen yağ ile yeniden kirlenmesini önlemek için temiz eldivenler giyin, bu da tutarlı jel oluşumunu engeller.
    2. Deterjan kalıntılarını gidermek için plakaları bol miktarda damıtılmış (deiyonize edilmiş) suyla durulayın, ardından tüy bırakmayan bir mendille (örn. Kimwipes) silin.
    3. Son olarak,% 70 etanol püskürtün ve silin - cam plakalar temizse gıcırdamalıdır. Etanolün sonuncusunun buharlaşmasına izin vermek için dik olarak bir kenara koyun.
    4. Jel oluşturma ekipmanının geri kalanını damıtılmış suyla temizleyin (gerekirse önce deterjan kullanın) ve kurulayın.
    5. Sistemin sızdırmaz olduğundan emin olarak cam plakaları ve ara parçaları jel oluşturma teçhizatına monte edin.
  2. Jel çözeltisini istenen poliakrilamid yüzdesine hazırlayın
    1. Nükleaz tahlili için, 1x TBE'de 8 M üre ile denatüre edici %14 poliakrilamid jeller kullanın.
    2. 100 ml yapmak için (sızıntı için bol miktarda 2 jel için yeterli) geniş bir beherde 48.05 g üre alın ve 35 ml %40 19:1 akrilamid çözeltisi ve 10 ml 10x TBE (890 mM Tris, 890 mM borik asit, 20 mM EDTA, NaOH ile pH 8.3) ekleyin. DİKKAT: Eldiven giyin - akrilamid güçlü bir nörotoksindir. Üreyi bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanarak çözün (bu biraz zaman alacaktır).
    3. Çözündüğünde, 100 ml'ye miliQ-deiyonize su ekleyin. 0.22 μm'lik bir membran kullanarak filtre ile sterilize edin. Hemen kullanılmayacaksa, emme ekipmanı kullanarak kısa bir süre gazdan arındırın ve karanlıkta saklayın (birkaç gün tutacaktır). Üre çökeleceği için buzdolabında saklamayın.
  3. Jeli polimerize edin ve dökün.
    1. Üre-akrilamid alın ve 0.5 ml %10 (a/h) amonyum persülfat (APS, damıtılmış suda yapılır) ve 50 μl TEMED ekleyin. Hava vermeden (polimerizasyonu engelleyecektir) karıştırmak için kabı yavaşça döndürün ve jel oluşturucuya dökün. Hızlı hareket edin, aksi takdirde dökme bitmeden jel sertleşebilir.
    2. Numune yüklemesi için kuyucuklar oluşturmak üzere uygun tarağı ekleyin (jel teçhizatına ve analiz edilecek numune numarasına göre seçilir, örneğin 15 veya 29 dişli taraklar Hoefer jel teçhizatı ile kullanım için uygundur). Tarak dişlerinin altına hava kabarcığı girmediğini kontrol edin.
    3. Ayarlamak için bırakın. Sızıntı olup olmadığını izleyin. Atmosfer ile temas nedeniyle peteklerde tam polimerizasyon gecikir. Kuyular sertleştiğinde, jelin geri kalanı sertleşecektir.
    4. Tarakları çıkarın ve polimerize edilmemiş akrilamid'i su ve bir pipet kullanarak durulayın.
  4. Jeli çalıştırmak için ayarlayın.
    1. Dökme jeli jel çalıştırma sistemine yerleştirin ve uygun miktarda 1x TBE çalıştırma tamponunu alt hazneye ve jel kuyucuklarına ekleyin. Jel artık yüklenmeye hazırdır.

3. His Etiketli Rekombinant DmWRNexo Proteininin Hazırlanması

  1. DmWRNexo proteininin bakteriyel ekspresyonu
    1. Bir aşılama döngüsü kullanarak, -80 ° C'de tutulan gliserol stoklarının yüzeyini kazıyarak bakterileri toplayın (bakteriler pIVEX2.3d-DmWRNexo ile dönüştürülmüş E. coli T7 Iq LysY'dir (NEB). 50 μg/ml ampisilin ile LB-agar plakalarına (10 g tripton, 5 g maya özütü, 5 g NaCl, damıtılmış su ile 1 L'ye kadar yapılmış ve pH 7.4'e ayarlanmış 15 g agar) çizin. Gece boyunca 37 °C'de ters çevrilerek inkübe edin.
    2. Plakadan tek bir koloniyi 50 μg / ml ampisilin (suda yapılmış ve 0.22 μm'ye kadar filtreyle sterilize edilmiş) ile desteklenmiş 50 ml LB'ye (10 g tripton, 5 g maya özütü, 1 L'ye kadar damıtılmış su ile yapılmış 5 g NaCl) seçin. Gece boyunca 220 rpm'de 37 °C'de çalkalayarak büyütün.
    3. LB-ampisilin'in 1.8 L'sini (yeterli havalandırmayı sağlamak için üç 2 L'lik erlene her biri 600 ml'lik alikotlar) gece boyunca 50 ml kültürle aşılayın ve OD600 ~ 0.8'e kadar büyütün. IPTG'yi 0.7 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve 26 ° C'de (protein toplanmasını önlemek için) 4-8 saat çalkalayarak inkübe edin.
    4. Hücre peletini 8.000 rpm'de 4 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile hasat edin - her birinde 300 ml hücre süspansiyonu bulunan 6 x 500 ml steril plastik santrifüj şişesi kullanın. Süpernatanı atın ve peleti orijinal LB-amp'in küçük bir hacminde (10 ml) yeniden süspanse edin, 15 ml'lik bir Falcon tüpüne aktarın ve ardından hücreleri peletlemek için 5.000 rpm'de yeniden döndürün - süpernatanı tekrar çıkarın ve -80 °C'de dondurun (bu lizise yardımcı olur).
  2. Bakteriyel hücre lizisi
    1. 1 ml 5 M NaCl, 1 ml 1 M DTT, 200 μl 1 M benzamidin ve 1 ml 10 mg / ml lizozim (damıtılmış suda yeniden süspanse edilmiş) içeren 3.2 ml lizis tamponu oluşturun.
    2. 300 ml bakteri süspansiyonundan elde edilen her pelete 320 μl lizis tamponu ekleyin. Mümkün olduğunca yeniden askıya alın - 'kesilmiş' bir p1000 ucu kullanın ve karıştırın, ayrıca yukarı ve aşağı pipetleyin. Buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. 100 μl'lik bir lizis tamponu daha ekleyin ve iyice karıştırın, ardından yeniden askıya alınan lizatı mümkün olduğunca bir mikrofüj tüpüne aktarın (çok viskoz ve pipetlenmesi zor olacaktır).
    3. Lizatı 14.000 rpm'de önceden soğutulmuş bir mikrofüj rotorunda 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı temiz bir mikrofüj tüpüne alın: bu, rekombinant proteini içerir.
  3. His-tuzak arıtma
    1. Reaktiflerin hazırlanması: Aşağıdaki imidazol konsantrasyonlarının her biri için 5 mikrofüj tüpünü etiketleyin: 40 mM, 60 mM, 100 mM, 300 mM ve 500 mM (örn. etiket 40-1, 40-2, 40-3, vb.), kolon fraksiyonlarını toplamak için kullanılacaktır. Tüpleri, kapakları açık bir rafta buz üzerinde saklayın (ancak diğer her şeyi hazırlarken temiz tutmak için streç film veya benzeri bir şeyle gevşek bir şekilde örtün). Seyreltici olarak 1x PBS (8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH 2 PO 4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4'e ayarlanmış ve damıtılmış su ile 1 L'ye kadar yapılmış) kullanarak 25 ml üniversal tüplerde 25 ml 20 mM imidazol ve diğer imidazol konsantrasyonlarının her birinden 10 ml stok oluşturun.
    2. Uygun hacimde 2 M imidazol stok çözeltisi kullanarak bakteriyel lizatı 20 mM imidazole ayarlayın ve 20 mM imidazol kullanarak hacmi en az 1 ml'ye (<5 ml) ayarlayın.
    3. 1 ml'lik bir His-Trap kolonunu (Amersham) 10 ml MilliQ su ile 5 veya 10 ml'lik bir Luer kilitli şırınga ve hafif manuel basınç kullanarak yıkayın, ardından PBS'de oluşturulan 10 ml 20 mM imidazolden geçirerek kolonu dengeleyin (yukarıdaki adım 3.3.1'e bakın).
    4. Lizatı kolona yükleyin. Lizat kolona yüklendiğinde, önemli bir geri basınç yaşanabilir; Bu tamamen normaldir. Şırıngaya çok fazla kuvvet uygulamak için cazip olmayın ve sabit bir eşit basınç sağlayın. Lizat kolona girerken hafif bir renk değişikliği görmek olağandır. Akışı bir Sterilin bijou şişesinde (7 ml kapasiteli) toplayın ve buz üzerinde saklayın.
    5. Kolonu 10 ml 20 mM imidazol ile yıkayın ve bunu 'yıkama' olarak etiketlenmiş 25 ml'lik evrensel bir buz tüpünde toplayın.
    6. Mikrofüj tüplerinin her birine (40.1, 40.2, 40.3, vb. olarak etiketlenmiş) 1 ml fraksiyonlar toplayarak kolondan 5 ml 40 mM imidazol geçirin: 1 ml'lik ölçüme izin verdiği için şırınganın pistonunu dikkatlice izleyin.
    7. Şimdi sırayla 60 mM, 100 mM, 300 mM ve 500 mM imidazolün her birinden 5 ml'den geçin ve yine her tuz konsantrasyonunda 5 x 1 ml fraksiyon toplayın.
  4. Kolon kesirlerinin analizi
    1. Nokta lekesi: Her bir kolon fraksiyonunun 2 μl'sini bir nitroselüloz tabakasına yerleştirin (ve ayrıca yükleyin, akın ve yıkayın) - bunun yumuşak bir kalem kullanılarak bir ızgara ile yönetilmesi daha kolaydır). Havada kurumaya bırakın. Nokta lekesini, %0,2 v/v Tween 20 ile PBS'de oluşturulan% 5 yağsız kurutulmuş sütte 15 dakika ila 1 saat oda sıcaklığında bloke ederek işleyin, daha sonra PBS-Tween'de birkaç kez yıkayın ve PBS-Tween'de 1:500 oranında seyreltilmiş HRP-anti-his antikoru ile 30-60 dakika inkübe edin. PBS-Tween ve ardından PBS ile yoğun bir şekilde yıkayın ve Hyperfilm MP'de görselleştirilen gelişmiş kemilüminesans (ECL) kullanarak bağlı antikoru tespit edin. Bu nokta lekesi, SDS-PAGE analizinden önce tepe fraksiyonları hakkında mükemmel bir fikir verir ve gerekirse sonraki saflaştırma adımlarını bilgilendirebilir (örneğin, protein stabilitesi bir sorunsa, nokta leke sonuçlarına dayalı olarak pik fraksiyonları bir araya getirmek ve doğrudan jel filtrasyon kolonlarına yüklemek mümkündür - aşağıdaki adım 3.5'e bakın).
    2. SDS-PAGE: Her kolon fraksiyonunun 50 μl'sini 50 μl 2x SDS-PAGE yükleme boyaları içeren etiketli bir mikrofüj tüpüne toplayın (% 4 w / v SDS,% 20 v / v gliserol, 120 mM Tris-HCl pH 6.8 ile 200 mM DTT). Bu numuneleri 95-100 °C'de 5 dakika kaynatın (ısıtılmış kapağı olmayan sıcak bir blok kullanıyorsanız, tüplerin ısınırken 'patlamasını' önlemek için her tüpün kapağında dar bir şırınga iğnesi ile küçük bir delik açın). Her bir kolon fraksiyonundan 10 μl yükleyerek %10 SDS-PAGE minigelleri çalıştırın ve proteinin tepe fraksiyonlarını ve % saflığını doğrulamak için Coomassie brilliant blue ile boyayın. Gerekirse, SDS-PAGE ile ayrılan proteinleri nitroselüloz üzerine aktararak his etiketli protein için western blot yapmak da mümkündür; membranları PBS-0.2% Tween 20'de% 5 yağsız sütle bloke edin, daha sonra nokta lekesinde olduğu gibi HRP konjuge anti-his antikoru (1:500) ile yıkayın ve araştırın.
  5. Saflığı arttırmak için, his-trap kolonundan gelen tepe fraksiyonları bir araya getirilebilir ve artan tuzda elüsyon ile bir Superdex 75 jel filtrasyon kolonuna yüklenebilir (daha önce tarif edildiği gibi Boubriak ve ark.13 ve Mason ve ark. 14).

4. Nükleaz Testi

  1. Alt tabakaların çalışma stoklarını yapın.
    1. Reaksiyon başına 20 pmol substrat kullanın (ancak bu, ele alınacak soruya göre değişebilir), bu nedenle uygun bir çalışma stoğu 200 pmol/μl'dir (yani 10x). Çalışma stokları, enzim duyarlılığına veya yapılacak tahlillere göre tuz veya EDTA olmadan küçük hacimlerde tavlama tamponunda (10 mM Tris-HCl pH7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl) veya 10 mM Tris-HCl pH 7.0'da (nükleaza göre pH 8.5'e kadar) yapılır.
    2. 4 °C'de ve karanlıkta (folyoya sarılı) saklayın. Yüzeyler, çift yönlü bütünlük veya floresan sinyali kaybı olmadan haftalarca dayanır.
  2. Kolorimetrik analiz veya Abs260'ta UV spektrometresi ile eksonükleaz protein konsantrasyonunun tahlil edilmesi.
    1. -80 °C'de küçük alikotlar halinde saklayın.
    2. Numuneler bir kez dondurulursa/çözülürse, %5'lik bir protein yanlış katlanma oranı varsayalım (veya test edilecek her protein için ampirik olarak tanımlayın) ve konsantrasyonları buna göre ayarlayın.
    3. İki donma / çözülme döngüsünden sonra eksonükleaz aktivitesinin tahlili için proteinleri atın ve her deney için proteinin durumunu not edin.
  3. Numuneler için ana karışım (MM) miktarlarını tasarlayın, deneyin ve hesaplayın.
    1. Numuneler arası varyasyonu azaltmak için test edilen numuneler için ortak olan tüm bileşenleri (genellikle enzim veya substrat dışındaki her şeyi) içeren bir MM yapın.
    2. MM'yi oluştururken pipetleme hatasına izin verin, örneğin (N + 0,1N) numuneler için yeterli yaparak N numuneler için hacimleri hesaplayın.
    3. 1 pmol enzim ve 20 pmol substrat içeren toplam 20 μl/numune hacminde reaksiyonlar kurun (optimizasyondan önce varsayılan olarak - tabii ki miktarlar test edilene göre değişir, örneğin enzim konsantrasyonunun etkisi test ediliyorsa enzim miktarını değiştirin). DmWRNexo için, nükleaz aktivitesi için en uygun tamponun ampirik olarak 0.1 mg / ml moleküler biyoloji sınıfı BSA ile 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM MgCl2, 5 mM ditiyotreitol içerdiği bulundu.
  4. Tepkileri ayarlayın.
    1. Tüm reaktifleri 4 °C'de tutun (buz kovası veya kriyoraf).
    2. Ana karışımı hazırlayın ve uygun sayıda steril DNaz içermeyen 0,5 ml mikrofüj tüpüne alın. İlk substratı görselleştirmek için enzim içermeyen bir kontrol ekleyin (bozulmamış kontrol).
    3. Enzim aktivitesi için uygun sıcaklığa bir ısı bloğu ayarlayın (37 ° C, 30 dakikalık bir son zaman noktası DmWRNexo için en uygundu, ancak bunun seçilen enzimin bir dizi sıcaklık ve zamandaki aktivitesini karşılaştırarak ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir). Tamponlarda yaygın olarak bulunan potansiyel enzim inhibitörleri, dikkatli bir şekilde test edilmelidir (ör. EDTA, muhtemelen nükleaz aktivitesi için kritik olan Mg2 + şelasyonu ile aşırı ATP14'te olduğu gibi DmWRNexo'yu inhibe eder). Yüksek konsantrasyonlarda imidazolün (>300 mM) bile DmWRNexo enzim aktivitesi üzerinde hiçbir etkisi olmadığını ve floresanı söndürmediğini unutmayın.
    4. STOP solüsyonunu oluşturun (% 80 Formamid, 1x TBE). Bu 3x'te. Bu, gerekirse bromofenol mavisi gibi boyalar içerebilir. RT'de saklayın.
    5. Aşağıdakileri ısı bloğunun yanına yerleştirin: reaksiyon karışımına eklenecek son reaktif(ler) (genellikle enzim); 1-10 μl'lik bir pipetleyici ve uçlar, bir zamanlayıcı, kriyoraf veya buz kovası ve STOP çözeltisi.
  5. Reaksiyonu başlatın.
    1. İlk tüpe enzim ilavesi için zamanlayıcıyı ayarlayın. Tüpü ısı bloğuna yerleştirin.
    2. Tüplerin geri kalanına uygun aralıklarla enzim eklemeye devam edin. (15 saniye, yalnızca STOP çözeltisinin tamamlanmasını gerektiren basit reaksiyonlar için yeterlidir). Enzim eklenir eklenmez ısı bloğuna yerleştirin.
  6. Reaksiyonu durdurun.
    1. Zamanlayıcı doğru süreye ulaştığında (örneğin 15 dakika) ilk numuneye 10 μl STOP solüsyonu ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Hemen buzun üzerine/kriyorafa yerleştirin.
    2. Reaksiyonları uygun zaman aralıklarında ve kuruldukları sırayla durdurmaya devam edin, böylece her reaksiyon tam olarak aynı inkübasyon süresine sahip olur.
  7. Numuneler artık hazırlanan denatüre edici jel üzerine yüklenmeye hazırdır.
    1. Doğru pipetleme için jel yükleme uçlarını kullanarak her numunenin yarısını (veya tamamını) yükleyin. Reaksiyonda kullanılan oligonükleotid seviyelerinde, reaksiyonun yarısı görselleştirme için iyi bir çıktı verecek ve bir tekrarın çalıştırılmasına izin verecektir (örneğin, ilk jel doğru şekilde çalışmıyorsa).
    2. Jelin nasıl çalıştığını belirlemek için boya içeren 1x STOP solüsyonunu (örn. bromofenol mavisi) bir veya daha fazla şeritte yüklemek uygundur.
    3. Bilinen boyutlardaki floresan oligonükleotidler, bir boyut işaretleyici olarak numunelerin yanında çalıştırılabilir.
  8. Jeli çalıştırın.
    1. Üstte çalışan tampon haznesini jel aparatına ekleyin ve numunelerin rahatsız edilmediğinden emin olarak çalışan tampon (1x TBE) ile doldurun. Tampon sızıntısı olup olmadığını kontrol edin.
    2. Jel teçhizatını bir güç kaynağına bağlayın ve 150-200 dakika boyunca 200 V'ta (sabit voltaj) veya bromofenol mavisi boya (kullanılıyorsa) jelin yaklaşık üçte ikisi kadar olana kadar çalıştırın (bu yüzde jelde 10nt DNA seviyesi civarında çalışır). Eğrilebilecek veya ayrılmayı önleyebilecek arabellek sızıntısını izleyin.
    3. Jeli durdurun ve çalışan aparattan çıkarın.

5. Jel Analizi ve Görüntüleme

  1. Kullanılacak Görüntüleyicinin hassasiyetini belirleyin, örneğin Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Floresan Görüntüleyici, F1000'lik en yüksek hassasiyet ayarını ve 50 μm'lik en küçük piksel okumasını (çözünürlük) kullanarak mavi bir 473 nm lazer kullanarak floresan floresan floresansını algılayabilir.
  2. Jeli tarayın.
    1. Ara parçaları ve bir jel plakayı dikkatlice çıkarın. Aksi takdirde taramayı engelleyecek çökelmiş üre izlerini gidermek için diğer jel plakasında kalan jeli iyice (ancak dikkatli bir şekilde) durulayın.
    2. Plakayı (jel hala takılıyken) jeli jel tutucunun cam yüzüne yerleştirin ve Görüntüleyiciye yerleştirin. Camdaki jelin koordinatlarına dikkat edin (eğer tüm yüzeyi doldurmuyorsa).
    3. Bağlı bilgisayarda uygun yazılımı açın ve jelin bulunduğu tarama alanının belirtilen bölgesini tarayın. Adım 5.1'de olduğu gibi belirlenen en iyi koşulları kullanın. Ortaya çıkan dosya nispeten büyük (birkaç MB) olacaktır, ancak gerekirse görüntü kırpılabilir ve sıkıştırılabilir.
    4. Kaydedin, ardından analiz yazılımı tarafından okunabilen bir dosya olarak dışa aktarın, örneğin ImageJ kullanarak analiz için bir .tiff olarak dışa aktarın.
  3. Verileri analiz edin.
    1. Başarılı bir eksonükleaz testi, substratın oligonükleotid boyunca florofora doğru sırayla bozulmasına neden olacak ve bu da jel üzerinde karakteristik bir merdiven benzeri floresan DNA fragmanı modeli ile sonuçlanacaktır. Jel üzerinde daha yüksek hareketliliğe sahip türler (daha fazla uzanan), bozulmamış başlangıç substratından daha küçüktür ve bu nedenle eksonükleaz bozunmasının ürünlerini temsil eder.
    2. Her bir numunedeki bozunma seviyelerini ve dolayısıyla eksonükleaz aktivitesini belirlemek için hareketliliklerine bağlı olarak her şeritteki türlerin nispi yoğunluklarını ölçmek için ImageJ'deki 'Jeller' aracını kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ekzonükleaz aktivitesinin in vitro analizinin gerçekleştirilmesi, asıl analize ek olarak bir dizi hazırlık adımı gerektirir. Prosedürlerin genel bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

Floresans tabanlı ekzonükleaz analizleri yürütülmeden önce, uygun bir floresans görüntüleme sistemi kullanılarak üre-akrilamid jellerinde ayrıştırma sonrası floresan işaretli oligonükleotid substratın saptamasını optimize etmek kritik öneme sahiptir. Filtre seçimi, analizin genel hassasiye...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Saflaştırılmış proteinlerin eksonükleaz aktivitesinin belirlenmesi, DNA bölünme ürünlerinin analizini gerektirir. DNA'nın eksonükleazlar tarafından sıralı bölünmesi, akrilamid jeller üzerinde etiketli bölünme ürünlerinin ayrılmasıyla görselleştirilebilir. Tarihsel olarak bu, DNA substratının bir radyoetiketle (örneğin 32P veya 35S) son etiketlenmesini içeriyordu, ancak radyoetiket kullanımının doğasında var olan dezavantajlar (maliyet, güvenlik sorunları ve zaman içinde istikrarsızlık) vard...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmayı finanse ettiği için konseyler arası Yeni Yaşlanma Dinamikleri Programı'na [ES/G037086/1] ve Fuji FLA-3000'e erişim için Prof. Dave Sherratt'a (Oxford Üniversitesi Biyokimya Bölümü) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reagent/Material
Custom oligonükleotidlerEurogentecBunların PAGE saflaştırması ile yüksek saflıkta örn. elde edilmesi gerekir.
5'FLOfluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTCTGA
CTACGTACAAGTCACC - 3'kabarcık
5'- GGTGACTTGTACGT
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Akrilamid çözeltisiSevern Biotech20-2400-05DİKKAT: güçlü nörotoksin bu nedenle her zaman
eldiven giyilmelidirHis-Trap sütunları (1 ml)GE Healthcare17-5247-01
Diğer tüm reaktiflerherhangi bir saygın tedarikçiMoleküler biyoloji sınıfı gereklidir (DNaz içermez); mikrofüj tüpleri benzer şekilde DNaz ve RNaz içermemelidir
Equipment
Hoefer SE400 jel aparatıHoeferSE400-15-1.5
FLA-3000 (fosfor ve floresan görüntüleyici)Fuji
Görüntü Okuyucu V2.02FujiFilm
Görüntü Göstergesi V3.3FujiFilm

Kaynaklar

  1. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
  2. Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome). Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).
  3. Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science. 272, 258-262 (1996).
  4. Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease. Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).
  5. Goto, M. Syndrome-causing mutations in Werner syndrome. Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).
  6. Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).
  7. Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).
  8. Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).
  9. Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).
  10. Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity. Aging Cell. 7, 418-425 (2008).
  11. Cox, L. S., Boubriak, I. DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging. Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).
  12. Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).
  13. Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease. Biogerontology. 10, 267-277 (2009).
  14. Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordr). , (2012).
  15. Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains. BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).
  16. Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry. Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).
  17. Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities. Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).
  18. Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA. Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DmWRNexo KarakterizasyonuWRN Ekzon kleaz AktivitesiFloresan DNA SubstratAkrilamid re JeliFlorasan G r nt lemeN kleaz Polarite AnaliziProsesivite BelirlemeSubstrat Tercihi TestiN kleaz Aktivite Kantifikasyonu
İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.