Yöntem makalesi

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50773

⸱

9 Aralık 2013

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

Bu makalede

Özet

Bu protokol, ultraviyole (UV) ışınlaması kullanılarak transgenik ekstrakromozomal dizilerin Caenorhabditis elegans genomuna entegrasyonu için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir prosedürü tanımlar. Ayrıca, bu protokol özellikle ekstrakromozomal dizileri yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Özet

Caenorhabditis elegans'ın sinsityal gonadının sitoplazmasına DNA enjekte etmek, ekstrakromozomal dizilerin bir sonraki nesle kısmi ve değişken iletim hızlarını sergileyen transgenik çizgiler oluşturmak için kullanılan ana tekniktir. Ek olarak, transgenik hayvanlar mozaiktir ve transgeni değişken sayıda hücrede ifade eder. Ekstrakromozomal diziler, transgenin %100 iletim hızına sahip mozaik olmayan transgenik suşlar oluşturmak için UV ışınlaması kullanılarak C. elegans genomuna entegre edilebilir. Bu kapsamda, UV ışınlanmış transgenik hayvanların F1 soyları, transgenin heterozigot bir entegrasyonunu taşıyan hayvanlar için taranır ve bu da F2 döllerine %75'lik bir Mendel iletim oranına yol açar. Bu yöntemin zorluklarından biri, bir popülasyondaki transgen iletim yüzdesini entegrasyondan önce (% X transgenik hayvanlar) ve sonra (% ≥75 transgenik F2 hayvanları) arasında ayrım yapmaktır. Bu nedenle, bu yöntem,% 75'lik Mendel ayrımından önemli ölçüde daha düşük bir transgenik hayvan yüzdesi ile entegre olmayan bir transgenik hattın seçilmesini gerektirir. Sonuç olarak, bir sonraki nesle %≤60 kromozomal dizi iletim hızına sahip entegre olmayan transgenik hatlar genellikle entegrasyon için tercih edilir ve yüksek iletimli suşlarda transgen entegrasyonu zordur. Burada, yüksek derecede ileten transgenik hatlar kullanıldığında (% ≥80) ekstrakromozomal dizilerin genoma entegrasyonunun etkinliğinin arttığını gösteriyoruz. Tarif edilen protokol, yüksek oranda ekstrakromozomal dizi iletimi sergileyen transgenik solucanların UV ışınlamasından sonra genoma homozigot transgen entegrasyonu ile birkaç bağımsız hattın kolayca seçilmesine izin verir. Ayrıca, bu yöntem oldukça hızlı ve düşük malzeme tüketir. Belirli bir entegre transgeni ifade eden farklı çizgilerin hızlı bir şekilde üretilmesi olasılığı, gen ekspresyon paterni ve regülasyonu, protein lokalizasyonu ve aşırı ekspresyonunun yanı sıra hücre altı belirteçlerin geliştirilmesine odaklanan çalışmalar için büyük ilgi görmektedir.

Giriş

Transgenler, C. elegans'ta çok çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Transgenik suşlar tipik olarak sinsityal hermafrodit gonad1,2'ye DNA enjeksiyonu ile üretilir. İlgilenilen transgeni taşıyan DNA, koenjeksiyon belirteçleri1,3,4'ü kodlayan plazmitlerle birlikte birlikte enjekte edilir. Koenjeksiyon belirteçleri, bir floresan proteinin ekspresyonuna veya spesifik bir davranışsal veya morfolojik fenotipe yol açan yerleşik transgenlerdir. Enjekte edilen DNA'lar, çok kopyalı ekstrakromozomal diziler oluşturmak için yeniden düzenlenir; Böylece, ilgilenilen transgen ve koenjeksiyon markörü birlikte iletilir5,4. Transgenik hatlar, enjekte edilen hayvanların F2 neslinde, koenjeksiyon markörünün (floresan veya spesifik fenotip) ekspresyonu tarafından indüklenen fenotipi takip ederek seçilir1. Transgenik hatlar, ekstrakromozomal dizilerin bir sonraki nesle kısmi ve değişken iletim hızlarını sergiler. Suşa bağlı olarak, hayvanların% 10-100'ü (% 100 nadir bir olaydır) ekstrakromozomal dizileri miras alır. Ek olarak, transgenik hayvanlar mozaiktir ve transgeni değişken sayıda hücrede ifade eder. Bu mozaikliğin bir sonraki nesle aktarım hızı ile ilişkili olması muhtemeldir. Gerçekten de, hem germ hattında hem de somatik hücrelerde iletim hızı, hücre bölünmeleri sırasında ekstrakromozomal dizilerin ayrılmasına bağlıdır. Bu sorunu önlemenin bir yolu, transgeni genoma entegre etmektir. Klasik olarak, bir transgenin bir kromozoma entegrasyonu, ekstrakromozomal diziler taşıyan transgenik solucanlarınışınlanmasına (ultraviyole veya gama) dayanır 3. Kısaca 50-100 adet hermafrodit hayvan L4 larva evresinde ışınlanmaktadır. F1 neslinde 200-800 transgenik hayvan seçilir ve ayrı ayrı plakalara kültürlenir. Mendel ayrımına göre, transgenin genoma heterozigot bir entegrasyonunu taşıyan transgenik F1 hayvanları, entegre dizi için heterozigot olan transgenik torunların 1/2'sini, entegre dizi için homozigot olan transgenik torunların 1/4'ünü ve diziyi entegre etmemiş torunların 1/4'ünü üretecektir (Şekil 1). Bu nedenle, F2 neslini içeren plakalar, koenjeksiyon markörünün ekspresyonu ile gözlemlendiği gibi% ≥75 transgenik hayvanlar için görsel olarak taranır. İntegral adayı olmak için seçilen F2 hayvanlarının yaklaşık 1/3'ünün entegre dizi için homozigot olduğu ve homozigot F3 hayvanlarının %100'ünü ürettiği varsayılmaktadır. Bu nedenle, seçilen her plakadan, üç ila sekiz transgenik F2 hayvanı ayrı ayrı kültürlenir ve %100 transgenik torunları olan plakalar seçilir. Daha sonra, transgenin% 100 kalıtımını doğrulamak için sekiz F3 hayvanı ayrı ayrı kültürlenir.

Bu yöntemin ana dezavantajları şunlardır:

  1. %≥75 transgenik F2 dölleri için birkaç yüz F1 plakasından oluşan bir görsel ekran gerektirir, bu da entegre olmayan ekstrakromozomal dizilerin değişken ve öngörülemeyen iletim yüzdesi nedeniyle zaman alıcıdır. Alternatif olarak, F1 plakalarının taranmasını önlemek için, P0 hayvanlarının ışınlanmasından sonra birkaç müteakip açlık aşaması gerçekleştirilebilir; ardından 100 transgenik hayvanın seçilmesi ve %100 transgenik döllerin taranması3.
  2. %60'tan daha yüksek bir kromozomal dizi iletim yüzdesi sergileyen suşlar için uyarlanmamıştır, çünkü bu yüzdeyi %75'ten ayırt etmek zordur.
  3. sadece nispeten düşük iletim hızına sahip suşlar kullanılabildiğinden, çok sayıda ışınlanmış transgenik P0 hayvanının yanı sıra çok sayıda F1 ve F2 hayvanının gözlemlenmesi gereklidir, bu da oldukça zaman alıcıdır ve önemli sayıda plaka gerektirir.

Solucanların ışınlanması muhtemelen DNA'da çift iplikli kırılmalara neden olur ve kromozom dışı dizilerin kromozomlara entegrasyonu DNA onarımı sırasında gerçekleşir. Bu nedenle, başarılı ışınlama aracılı entegrasyon elde etme şansının, ekstrakromozomal bir dizi taşıyan germ hattı hücrelerinin sayısı ile doğru orantılı olması muhtemeldir. Yüksek iletim hızına sahip suşlar,2'de önerildiği gibi düşük iletim hızına sahip suşlardan daha fazla transgenik DNA dizisi içerebilir ve ekstrakromozomal diziler taşıyan daha fazla sayıda germ hattı hücresi sergileyebilir. Bu nedenle, yüksek iletim hızına sahip hatlarda, transgenlerin entegre edilmesinin, düşük iletim hızına sahip hatlara göre daha kolay olabileceğini düşündük. Bununla birlikte, standart protokol, transgenlerin yüksek iletim frekansı ile entegre edilme olasılığını dışlar, çünkü entegre olmayan bir ekstrakromozomal diziye sahip transgenik hayvanların yüzdesi, transgenin genoma heterozigot bir entegrasyonunu taşıyan bir F1 hayvanının dölünün yüzdesinden neredeyse ayırt edilemez (Şekil 1).

Burada, belirli bir transgen için, ultraviyole (UV) ışıkla ışınlamadan sonra geri kazanılan entegre hatların sayısının, entegre olmayan dizinin ilk iletim yüzdesine bağlı olduğunu gösteriyoruz. UV ışınlaması aracılı transgen entegrasyonu için, özellikle yüksek oranda transgen dizisi iletimi sergileyen hatlarla ilgili olan gelişmiş bir protokol sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Entegrasyondan Önce Transgenik Nematodların Kültürlenmesi

Transgenik hatlar1'de açıklandığı gibi oluşturulabilir. Bu çizgiler genellikle ya bir floresan proteinin ekspresyonuna ya da belirli bir gelişim aşamasında spesifik bir davranışsal veya morfolojik fenotipe yol açan bir koenjeksiyon işaretleyici plazmid içerir1,3. Bu entegrasyon protokolü, floresan veya floresan olmayan koenjeksiyon belirteçlerini eksprese eden suşlara uygulanabilir. Aşağıdaki örnekte, floresan koenjeksiyon markörü olan bir suş kullanılmıştır.

  1. Kültür plakalarını hazırlayın:
    1. Her biri 10 ml Nematod Büyüme Ortamı (NGM)6,7 ile aseptik olarak dökülen yaklaşık 500 adet 60 mm büyüklüğünde Petri kabı hazırlayın.
    2. Her plakayı 0.3 ml doymuş Escherichia coli OP50 kültürü ile standart prosedür6,7'ye göre tohumlayın.
  2. Entegre edilecek transgenik hattın iletim hızını değerlendirin:
    1. Her transgenik hat için,7'de tarif edildiği gibi bir solucan penası kullanarak bir floresan stereoskop altında on ayrı kültür plakasına on floresan gravid ergini seçin.
    2. Solucanların üremesine izin vermek için hayvanları 15-25 ° C'de (genetik arka plana bağlı olarak) bir solucan kuluçka makinesinde kültürleyin.
    3. Koenjeksiyon belirtecinin hangi gelişim aşamasında ifade edildiğini ve en iyi şekilde gözlemlenebileceğini değerlendirmek için her gün dölleri gözlemleyin. Halen kullanılan koenjeksiyon belirteçlerinin çoğunun ekspresyonu L4 larva evresinde veya yetişkinlikte gözlenir.
    4. Bir floresan stereoskop altında gözlemleyerek floresan döl yüzdesini belirleyerek döllerin iletim hızını değerlendirin.
  3. Transgen entegrasyonu için bir transgenik hat seçin:
    1. Mümkün olan en yüksek iletim hızına sahip transgenik hattı seçin (ideal olarak %≥80).
  4. Entegrasyon için L4 larva aşamasında senkronize edilmiş bir transgenik hayvan popülasyonu elde edin:
    1. Beş kültür plakasına (plakaya göre altı hayvan) 30 floresan gravid yetişkin seçin.
    2. Solucanların 15 °C'de 3-4 saat yumurta bırakmasına izin verin.
    3. Tabakta en az 30 yumurta olup olmadığını kontrol ettikten sonra yetişkinleri plakalardan çıkarın.
    4. Hayvanları, döl L4 larva aşamasına ulaşana kadar (15 ° C'de 96 saat veya 25 ° C'de 36 saat) 15-25 ° C'de bir solucan kuluçka makinesinde kültürleyin.

2. UV Işınlaması ve Transgenik Solucanların Geri Kazanımı

  1. Solucan ışınlaması:
    1. 30-100 floresan transgenik L4 hayvanını ayrı kültür plakalarına seçin (plaka başına 15-20 hayvan).
    2. Plakaları, kapakları çıkarılmış olarak bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. Solucanları 0.012 J /cm2'de ışınlayın. Suşların UV'ye az ya da çok duyarlı olduğunu ve sonuçların kullanılan UV ışınlayıcıya bağlı olarak değişebileceğini unutmayın. 0.010-0.015 J /cm2 arasında bir doz aralığı test edilebilir.
  2. Işınlamadan sonra solucan geri kazanımı:
    1. Geri kazanım için ışınlanmış solucanların bulunduğu plakaları gece boyunca 15 ° C'de yerleştirin.
    2. Canlı olan hayvanların sayısını kontrol edin. Elimizde, verimli bir ışınlama için yaklaşık %80-90'lık bir sağkalım oranı uyarlanmıştır.
    3. Işınlanmış hayvanları, adım 1.2'de belirtildiği gibi, koenjeksiyon belirteç ekspresyonunun gözlemlenmesine izin veren gelişim aşamasına ulaşana kadar 15-25 ° C'de büyütün.

3. Entegre Transgenik Hatların İzolasyonu

  1. F1 hayvanlarının seçimi:
    1. Tek 150-200 floresan F1 hayvanlarını ayrı kültür plakalarına. Yüksek iletimli hatlar için (% ≥80), 100 F1 hayvanı yeterlidir.
    2. Bu F1 plakalarını, döl floresan F2 hayvanlarının gözlemlenmesi için uygun bir aşamaya gelene kadar 15-25 °C'de tutun.
    3. i) F1 hayvanının kısır olduğunu veya öldüğünü gösteren hiçbir döl göstermeyan veya ii) F1 hayvanının transgeni beklenen oranda iletmediğini gösteren floresan F2 hayvanı olmayan veya sadece birkaç floresan F2 hayvanı sergileyen tüm F1 plakalarını atın. Bu adım hızlıdır ve %≥75 floresan döl sergileyen F1 plakalarını seçmek için floresan F2 solucanlarının yüzdesinin tahmin edilmesini gerektiren standart protokolle karşılaştırıldığında gerçek bir avantajı temsil eder (Tablo 1).
  2. F2 hayvanlarının seçimi:
    1. Seçilen her F1 plakasından tek dört floresan transgenik F2 hayvanı. Floresan transgenleri kullanırken (örneğin mCherry8, gfp9 veya dsRed10), yüksek düzeyde floresan ile F2 solucanlarını seçin, çünkü bu, bu hayvanların entegre dizi için homozigot olduğunu gösterebilir. F2 hayvanlarını toplarken, bir sonraki adımda yanlış negatiflerden kaçınmak için yumurta veya larva taşımamanın çok önemli olduğunu unutmayın.
    2. F2 hayvanlarını 15-25 °C'de büyütün.
  3. Entegre transgenik suşların izolasyonu ve validasyonu:
    1. % 100 floresan transgenik F3 solucanları için ekran F2 plakaları. Floresan olmayan tek bir solucanın varlığı plakanın atılması gerektiğini gösterdiğinden ekran oldukça hızlıdır. Entegre transgen için homozigot bir F2 hayvanı, %100 homozigot floresan döl verecektir.
    2. Transgenin %100 kalıtımını doğrulamak için seçilen plakalardan tek sekiz floresan F3 hayvanı. Teorik olarak, bu adımda bir hayvan seçmek yeterlidir. Bununla birlikte, ışınlama, solucan fizyolojisi için önemli olan genleri etkileyen mutasyonları rastgele indükleyebileceğinden, verimsiz veya sağlıksız hayvanları seçmekten kaçınmak için sekiz floresan F3 hayvanının seçilmesi gerekli olabilir.
    3. Mümkünse, birkaç bağımsız entegre transgenik suşu, yani farklı F1 hayvanlarından geri kazanılan suşları saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ekstrakromozomal dizileri yaklaşık aynı frekansta (%50-60) aktaran iki farklı hattaki transgenlerin entegrasyonları, standart ve geliştirilmiş protokoller kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Tablo 1). Standart protokol, 91 transgenik L4 hayvanın UV radyasyonuna maruz bırakılmasından sonra üç bağımsız entegre hattın geri kazanılmasını sağlarken, geliştirilmiş protokol 30 transgenik L4 hayvanın UV radyasyonuna maruz bırakılmasından sonra bir entegre hattın geri kazanılmasını sağlamıştır. Bu durum, entegrasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, ekstrakromozomal transgenik dizileri C. elegans'ın genomuna entegre etmek için etkili bir yöntem sağlar. Aynı transgen Pdyc-1::d yc-1::gfp'yi (pKG45) farklı oranlarda (%10-15, %50-60 ve >%80) ileten farklı entegre olmayan hatlar kullanarak, UV ışınlamasından sonra geri kazanılan entegre suşların sayısının, entegre olmayan hattın başlangıç iletim seviyesine bağlı olduğunu gösterdik (Tablo 2). Bu nedenle, transgenlerin yüksek iletim hızı sergileyen hatlara enteg...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, entegre olmayan Pdyc-1::d yc-1::gfp oluşturdukları için Claire Lecroisey ve Laurent Ségalat'a teşekkür eder; Pmyo-2::d sRed ve Pmyo-3::gfp transgenik suşları. Pmyo-2::d sRed plazmid hediyesi için Andy Fire'a ve Pmyo-3::gfp plazmid hediyesi için Pamela Hoppe'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Fransız Ulusal Bilimsel Araştırma Merkezi (CNRS) ve Lyon Claude Bernard Üniversitesi tarafından kurulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NGM (nematod büyüme ortamı) hazırlığı içinAgarProlabo20768.292
NaClChimie-Plus40045NGM hazırlığı için
Bacto-peptoneBD211820NGM hazırlığı için
KH2PO4NGM hazırlığı içinRoth3904-1
K2HPO4Prolabo26930.293NGM hazırlığı için
MgSO4RothP027.2NGM hazırlığı için
CaCl2NGM hazırlığı içinProlabo22317.297
NGM hazırlığı içinKolesterolRectapur
LBSigmaL3022 bakteri
EKİPMANLARI
UV çapraz bağlayıcıFischer BilimselDalga Boyu 254 nm
Mikroskop SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Petri kapları, 60 mmCMLBPS55E6
Platin tel 0,25 mmAlfa Aesar7440-06-4Solucanlar için bir seçim yapmak için (7)
(6,7)NGM hazırlığı için OP50 kültürü için suyu

Kaynaklar

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

UV I nlamasTransgenik Hat Se imiFloresan TaramaHomozigot EntegrasyonTransmisyon Oran AnaliziF1 Nesli TaramasF2 Plaka Se imiBa ms z Su Olu turma

İlgili makaleler