Method Article

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

DOI:

10.3791/50786

⸱

August 8th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik hem de temel bilim, karar verme klinik giderek daha önemli hale gelmektedir. Teşhis miyokard infarktüsü (Mİ) büyük ölçüde miyokard hasarının bir göstergesi olarak hastaların serum veya plazma kardiyak-spesifik proteinlerin tespit ile tahrik edilir. Son zamanlarda kardiyak miyosin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), MI sonrası serum içinde tespit olduğunu göstermiştir, biz MI için potansiyel bir biyolojik olarak önerilmiştir. Biyolojik genellikle geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent testleri ile tespit edilir. Ancak, bu teknik, büyük bir örnek hacmi gerektiren küçük bir dinamik aralık vardır ve bir seferde sadece bir protein ölçebilirsiniz.

Burada üç kalp proteinler yüksek hassasiyet ile eş zamanlı olarak ölçülebilir hangi çok katlı bir bağışıklık göstermektedir. Kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin ile UNIPLEX veya birlikte cMyBP-C Ölçüm ben karşılaştırılabilir duyarlılık gösterdi. Bu teknik Mezo Ölçeği Discovery kullanırTespiti için elektro ile birlikte bir 96 oyuklu plaka çoğullama (MSD) yöntemi. Sadece küçük bir örnek hacimleri gerekli iken, yüksek hassasiyet ve geniş dinamik aralık elde edilir. Bu tekniği kullanarak, cMyBP-C, kreatin kinaz MB ve kardiyak troponin MI ile 16 denekten serum örneklerinde Ben düzeyleri ölçüldü ve 16 kontrol grubu ile sonuçlar karşılaştırıldı. Biz bu örnekleri her üç işaretleri tespit başardık ve MI sonrası artmış olduğu üç biyolojik bulundu. Bu teknik, bu nedenle, serum numuneleri kalp biyolojik arasında hassas bir şekilde tespit uygundur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örneğin, serum gibi karmaşık biyolojik örnekler, protein düşük miktarda ölçümü hasta yönetimi, hem de temel bilim için artan bir klinik önem taşımaktadır. Örneğin, bir klinik ortamda bu troponin I gibi kardiyak biyolojik serum, artış akut miyokard infarktüsü (Mİ) 1 ile tutarlıdır. Bu yüksek hassasiyete sahiptir ve analit ölçümü için mutlak izin verdiği serum örneklerinde proteinleri saptamak için, standart bir enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), en sık kullanılan bir tekniktir. Ancak, geleneksel ELISA, örneğin nispeten büyük miktarda (tipik olarak 100 ul) gerektiren bazı biyolojik akışkanlar içinde yüksek bir arka plan sinyali, ve ELISA 2 başına sadece bir analit ölçümü ile sınırlıdır.

Son zamanlarda, yeni bir immunoassay tekniği bu sakıncaları birçok circumvents geçilmiştir. Bu modifiye tahlil, MSD tarafından geliştirilen, electrochemiluminesc kullanırKüçük bir numune hacimlerinin kullanımını mümkün kılmak için çok düşük arka plan ve artan bir hassasiyet sağlayan sinyal tespiti için etkisiyle (ECL). Elektro algılama antikorlara bağlı raportör molekülün rutenyum (II) 'trisbipyridal esas alınmaktadır. Bu, raportör molekülün bunları 3 entegre karbon elektrot olan 96-kuyulu plakanın alt elektriksel stimülasyonu üzerine 620 nm'de ışık yayar. Ayrıca, spot kaplama kullanılarak, birden çok yakalama antikorları, tek bir örnek 4, farklı proteinlerinin aynı anda ölçümü sağlayan, iyi bir (en fazla 10, 96 oyuklu plaka) halinde kaplanabilir. Bu teknik en son serum 5,6 proinflamatuar sitokin profilleri ölçmek için kullanılmıştır. MSD gelen çok katlı levhalar olumlu diğer çok katlı testi platformlara 7 karşılaştırmak.

Birincil test platformu olarak MSD kullanarak, daha fazla 3-karmaşık plaka yapılmış bir özel geliştirilen cbir anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C (cMyBP-C), kreatin-kinaz MB (CK-MB) ve kardiyak troponin I (cTnI) seviyesini ölçmek ve sonuçları cMyBP-C Monoplex tespiti ile karşılaştırıldı. CK-MB ve cTnI MI için köklü biyolojik bulunmaktadır. Ancak bu biyolojik artışlar örneğin miyokardit veya böbrek yetmezliği 8, MI dışındaki patolojiler neden olabilir. Bu MI tanı özgünlüğünü artırmak için ek biyolojik eklenmesi için savunuyor. Son zamanlarda cMyBP-C de mi 9 için potansiyel bir biyolojik olduğunu göstermiştir. cMyBP-C kalp, iskelet veya değil, düz kaslarda, 10-12 olarak ifade edilir, kalın filaman ilişkili bir proteindir. Bu nedenle, kan dolaşım sistemi içinde cMyBP-C artan seviyesi kalp hasarı 13 belirli bir göstergesidir.

Bu çalışmada, serum seviyelerinin ölçülmesi için özel bir 3-Plex tahlilin kullanımı ile cMyBP-C UNIPLEX tespiti görecMyBP-C, CK-MB ve MI hastaların serum cTnI. Gelecekte, bu imza teknik acil serviste göğüs ağrısı ile başvuran hastalarda MI teşhis etmek için kullanılabilir.

Loyola University Chicago kurumu inceleme kurulu (KİK) deidentified insan örneklerinin kullanımı ve immunoassay ve kullanımı (LU # 20392) için çalışmayı onayladı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. UNIPLEX cMyBP-C Testi

  1. Yakalama antikor ile deney, kat 96-MSD çıplak standart plaka önceki gün. CMyBP-C, 5 mg / fosfat içinde seyreltilmiş ml 'lik bir konsantrasyonda, fare monoklonal anti-cMyBP-C antikoru (jelatin serbest) bir 30 ul hacim kullanımı salin (PBS) tamponlu.
  2. Iyi hidrofobik olduğu için, kuyunun dibinde köşeye çözüm pipetle, daha sonra tüm aşkın çözüm yaymak için plaka yanlarına dokunun.
  3. Plaka plaka örtücü ile kaplı ve sallayarak olmadan 4 ° C'de O / N inkübe edilir.
  4. Bir lavabonun üzerinde ve sonra kağıt havlu bir yığın çözüm dokunarak yakalama antikor çözüm çıkarın. Plakasına Spesifik olmayan bağlanma,% 5 (w / v) engelleyici her oyuğa PBS içinde bir (yüksek dereceli BSA) çözeltisi 150 ul ilave edilerek bloke edilmiştir.
  5. 700 rpm'de çalkalayarak, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe plakası ve Seal.
  6. Bloke adım sırasında, standart hazırlama ve Sdepas'lar. 1% 2.000 ng / ml (k / h) engelleyici bir PBS / bir başlangıç ​​konsantrasyonuna - Rekombinant cMyBP-C protein parçası (271 amino asit 1) seyreltilmesi ile standart seri olun. Daha sonra seri olarak% 1 (w / v) 'engelleyici ° C'de PBS / 5 oranında seyreltilir. 7 standartları toplam + 1 boş (% 1 (w / v) 'engelleyici A / PBS) kullanılmıştır.
  7. Bloke etme çözeltisi uzaklaştırılır ve 150 ul% 0.05 (v / v) ile 3 kez Tween-20/PBS plaka yıkayın. Her zaman, bir lavabo üzerinde ters plaka ile yıkama solüsyonu çıkarın. Üçüncü yıkama adımdan sonra, şiddetle bir lavabonun üzerinde plaka fiske ve tamamen kuruyana kadar kağıt havlu tabakası üzerinde şiddetle plaka pat. Kuluçka hacimleri küçük gibi bu, çok önemli bir adımdır, ve kalan yıkama solüsyonu önemli ölçüde bir sonraki kuluçka sulandırmak olur.
  8. Kuyulara standartlar ve numuneler bir pipetle 25 ul. 1 saat boyunca 700 rpm'de çalkalayarak, oda sıcaklığında plaka ve inkübe Seal.
  9. % 1 engelleyici / PBS içinde 1 ug / ml 'de tespit antikor çözeltisi hazırlayın. Bir CuMSD sülfo-TAG etiketleme algılama antikoru olarak hizmet ile - zel cMyBP-C antikoru (14 epitop amino asitler 2) yapılmıştır. Kitler, herhangi bir antikor etiketlemek için nispeten basit bir işlem yapmak, sülfo-TAG etiketleme için kullanılabilir.
  10. , Adım 1.4 'de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin.
  11. Her kuyucuğa algılama antikor çözeltisi 25 ul ekle çalkalayıcı 700 rpm'de bir plaka üzerine, 1 saat boyunca oda sıcaklığında ve plaka ve inkübe mühür.
  12. Kuluçka döneminde, Sektör Görüntüleyici ve yazılım (Reaktif bölüm bakınız) uygun çalışmasını sağlamak için MSD demo-levha (LED ışıkları ile plaka) çalıştırın. Aynı zamanda, 15 ml distile su ile 4x salt tampon 5 ml eklenerek MSD tarafından sağlanan salt tampon, seyreltin.
  13. , Adım 1.4 'de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin.
  14. Bir çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun salt tampon 150 ul ekleyin. Hava kabarcıkları (ters pipetleme uygun bir yöntemdir) önlemek için emin olun. Salt tamponu ilave edildikten sonra hemen Sektördeki plaka taramaGörüntüleyici.

2. 3-karmaşık cMyBP-C, CK-MB ve cTnI Testi

  1. 96 oyuklu bir plaka 3-Plex ve bir seyreltici solüsyonların kullanımı daha önce oda sıcaklığına kadar denge sağlaması için izin verilmiştir. Bu plaka MSD tarafından cMyBP-C, CK-MB ve cTnI için yakalama antikorlar ile ön kaplı.
  2. % 1 (w / v) 'engelleyici her bir A / PBS içinde 25 ul ekle. Tüm iyi çözüm kapalı olduğundan emin olmak için plaka yanlarına dokunun.
  3. Bir tabak mühürleyen ile plaka mühür, bir plaka çalkalayıcı plaka yerleştirin ve 30 dakika için 700 rpm'de sallayın.
  4. Bu arada, bireysel kalibratörlerin bir seyreltme serisi hazırlanır. Her iyi üç yakalama antikorlar olduğu için üç kalibratör karışık olması ve seri olarak kullanılmadan önce seyreltilmiş gerekir. 2.000 ng / ml 'cMyBP-C, 100 ng / ml' si ile bir örnek oluşturmak için% 1 birlikte yeniden birleştirici cMyBP-C, CK-MB (MSD) ve cTnl (MSD) (w / v) 'engelleyici A / PBS ile seyreltilir CK- MB ve 25 ng / ml cTnI (örnek A).
  5. En az 100 ul son hacim, her bir standart için hazırlanmıştır. KarşıStandart seri tamamlamak, seri örneklerin 5 kat olan sulandırmak. Örnek, 25 ul kullanarak bir 100 ul% 1 (w / v) 'engelleyici örnek oluşturmak C için 100 ul% 1 (w / v)' engelleyici A / PBS içinde örnek B 25 ul kullanımı, daha sonra örnek B'yi oluşturmak için A / PBS içinde ve benzeri. MI ile 16 konu ve 16 kontrol grubu insan serum örneklerinde cMyBP-C, CK-MB ve cTnI düzeylerini ölçmek için kullanıldı. Bu örnekler,% 1 (w / v) 'engelleyici A / PBS içinde 2x seyreltilmiştir.
  6. 3-Plex plaka gözenekleri içinde zaten mevcut olan 25 ul standart ve seyreltilmiş numune, 25 ul ekle. Ayrıca, boş (sadece seyreltici) dahil edilmesi önemlidir. Tekniğin kurmak için, numuneler teknik üçlü olarak yüklenir. Aksi takdirde, çiftleri yeterlidir.
  7. Tekrar plaka Seal (plaka örtücü yeniden kullanılabilir) ve 2 saat oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı (700 rpm) üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
  8. Kuluçka tamamlandıktan hemen sonra, algılama antikoru çözeltisi hazırlanır. Kullanılan seyreltici, PBS içinde% 1 (w / v) 'engelleyici. Tüm thrEE sülfo-etiketli antikorlar tespit 1 ug / ml her biri bir son konsantrasyon halinde bir araya seyreltilir. Algılama antikorlar tipik bir 50x stok konsantrasyonu sağlanır.
  9. Tam 96 oyuklu plaka için, toplam seyreltik çözeltinin 2.700 ul (hata dahil pipetleme ile) gereklidir. 2.538 ul% 1 (w / v) 'engelleyici bir PBS / her bir algılama antikoru 54 ul ekle.
  10. 2 saat sonra, şiddetle bir lavabo üzerinde plaka hafifçe vurarak çözümler çıkarın. PBS içinde% 0.05 Tween-20 150 ul ile kuyu 3x yıkayın. Algılama antikor çözeltisi 25 ul her bir çok kanallı bir pipet kullanarak, ve plaka iki tüm iyi çözelti ile kapalı olduğundan emin olmak için aday edilir.
  11. Plaka sızdırmaz ve 700 rpm'de çalkalayarak, 1 saat boyunca inkübe edilir.
  12. Kuluçka döneminde, Sektör Görüntüleyici ve yazılım düzgün çalışmasını sağlamak için MSD demo-levha (LED ışıkları ile plaka) çalıştırın. Ayrıca 4x oku-5 ml eklenerek MSD tarafından sağlanan salt tampon, seyreltik15 ml distile su için tampon.
  13. Adım 2.8 'de tarif edilen yıkama adımı tekrar edin.
  14. De, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir salt tampon 150 ul ekleyin. Hava kabarcıkları kaçınmak önemlidir (ters pipetleme uygun bir yöntemdir). Salt tamponu ilave edildikten sonra hemen Sektör Imager plaka tarama.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3-Plex tahlilinin temel ilkeler ve akışı Şekil 1 'de gösterilmektedir ve genel akışı Tablo 1' de tarif edilmektedir. UNIPLEX deneyleri tüm alt iyi bir yakalama antikor ile kaplı olması dışında aynı prensip boyunca çalışır. Sinyal algılama bir elektrik sinyali kuyunun dibine uygulandığı ECL yapılır. Bu da, algılama antikoru üzerindeki sülfo-etiketi ile salt tampon, bir kimyasal reaksiyon yoluyla bir ışık yerel üretimini başlatır. Bu, düşük arka plan ve analiz için yüksek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, hastalarda serum birden fazla kardiyak biyolojik tespiti için bir multipleks immunoassay uygulanabilirliğini göstermektedir. Bu teknik, geleneksel ELISA üzerinde birçok avantajı vardır. İlk olarak, test kiti ECL kolorimetrik tespit yerine kullanılır. ECL olarak, bir elektrik sinyali 14 azaltır, böylece arka plan sinyali, ikinci uyarım durumunda ayrılmasının, ölçülen özelliği (ışık) yerel üretimini uyarır. Bu durum, Tablo 2'de de görülebileceği gibi, yüksek hassasiyet sağlama...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan vücut sıvısı içine cMyBP-C bozulması ve serbest bırakılması ile ilişkili risk faktörleri belirlemek için: Tam patent başvurusu (05/04/12. Başvuru Seri 13 No'lu / 464, 466, Birahane No US 2012 / 0.282.618 A1 ve tarihi) beklemede ve insan vücut sıvısında cMyBP-C düzeyini nicelendirmek.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri R01HL105826 ve K02HL114749 (Dr Sadayappan) ve Amerikan Kalp Derneği Midwest Arkadaş grupları tarafından finanse edildi; 11PRE7240022 (Bay Barefield) ve 13POST14720024 (Dr Govindan). Yazarlar minnetle tahlil gelişmekte olan kendi mükemmel teknik ve edebiyat destek için Dr Jimmy Page, Jill Clampit ve Dr John Hudson, MSD, yardımı kabul.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
MSD Yüzey Aktif MaddeMeso Scale DiscoveryR92TC-2 
Ara-20Acros9005-64-5 
MSD Engelleyici AMeso Scale DiscoveryR93BA-1 
Fosfat tamponlu tuzlu su, 10XFisher BioReagentsBP399-4Kullanmadan önce filtreleyin
Miyozin bağlayıcı protein C antikoru, fare monoklonal (E7), jelatin içermezSanta CruzSC-137180LKaplama için antikor jelatin içermemelidir
colspan="4" Plakalar ve Ekipman
Çok Dizili 96 oyuklu standart plakaMeso Scale DiscoveryL15XA-3 
Meso Scale DiscoveryN452A-1 prototip 3 pleks, dört noktalı, 96 oyuklu plaka
ThermaSeal Sızdırmazlık FilmiYaşam Bilimleri Ürünleri A.Ş.ST-3098 
MSD SECTOR Imager 2400AMeso Scale Discovery 
MTS 2/4 dijital mikro titre çalkalayıcıIKA3208001 
cMyBP-C, cTnI ve CK-MB ile ;

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
  2. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63, 879-884 (2008).
  3. Thompson, I., et al. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).
  4. Kingsmore, S. F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).
  5. Altan, Z. M., et al. A long-acting tumor necrosis factor alpha-binding protein demonstrates activity in both in vitro and in vivo models of endometriosis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 334, 460-466 (2010).
  6. Patel, K. D., et al. High sensitivity cytokine detection in acute coronary syndrome reveals up-regulation of interferon gamma and interleukin-10 post myocardial infarction. Clin. Immunol. 133, 251-256 (2009).
  7. Fu, Q., Zhu, J., Van Eyk, J. E. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin. Chem. 56, 314-318 (2010).
  8. Mahajan, V. S., Jarolim, P. How to interpret elevated cardiac troponin levels. Circulation. 124, 2350-2354 (2011).
  9. Govindan, S., et al. Cardiac myosin binding protein-C is a potential diagnostic biomarker for myocardial infarction. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 154-164 (2012).
  10. Barefield, D., Sadayappan, S. Phosphorylation and function of cardiac myosin binding protein-C in health and disease. J. Mol. Cell Cardiol. 48, 866-875 (2010).
  11. Kuster, D. W., et al. Cardiac myosin binding protein C phosphorylation in cardiac disease. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 43-52 (2012).
  12. Sadayappan, S., de Tombe, P. P. Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function. Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).
  13. Sadayappan, S. Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury. Biomark Med. 6, 69-72 (2012).
  14. Fichorova, R. N., et al. Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study. Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).
  15. Malekzadeh, A., et al. Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases. Methods. 56, 508-513 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Myosin Binding Protein CElectrochemiluminescence ImmunoassayMultiplex ImmunoassaySerum Biomarker DetectionMeso Scale Discovery96 Well PlateCalibrator Standard CurveDetection Antibody LabelingReid Buffer AdditionCross Reactivity Analysis

Related Articles