Yöntem makalesi

Kültürleme ve bakımı

40K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50787

⸱

14 Eylül 2013

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Clostridium difficile sıkı anaerob ve antibiyotik ilişkili ishal (AAD) neden olan bir patojen bakteridir. Burada, izole edilmesi ve kültür C muhafaza edilmesi için yöntemler difficile bitkisel hücreleri ve sporlar açıklanmıştır. Bu teknikler optimum C için uygun koşulları sağlamak için düzenli bakım gerektirir, bir anaerobik odasını gerektiren difficile ekimi.

Özet

Clostridium difficile antibiyotik ilişkili ishal (AAD) için öncelikle sorumlu ve önemli bir nozokomiyal patojen olan bir Gram-pozitif, anaerobik, sporogenic bakteridir. C. difficile izole etmek ve geliştirmek için çok zordur ve çevre oksijen düşük seviyelerde bile son derece duyarlıdır. Burada, C izole edilmesi için yöntemler dışkı örnekleri difficile ve daha sonra kültür C. , uzun süreli depolama için gliserol stoklarının hazırlanması için difficile sunulmaktadır. Mikroskopi ve hayvan çalışmaları dahil olmak üzere alt çeşitli uygulamalar için laboratuarda spor stoklarının hazırlanması ve numaralandırma için teknikler de tarif edilmiştir. Bu teknikler en iyi C için uygun koşulları temin etmek üzere tutarlı oksijensiz bir ortamın oksijensiz odası, gerektirecek difficile büyüme. Biz ca olmadan odasının içinde ve dışında malzeme aktarımı için protokolleri sağlamakverimli ve tutarlı C için uygun anaerobik ortam sürdürmek için gerekli düzenli bakım önerileriyle birlikte önemli oksijen kirlenmeyi kullanarak difficile ekimi.

Giriş

Clostridium difficile bir zorunlu anaerob ve insanlarda ve hayvanlarda bir potansiyel olarak ölümcül bir gastrointestinal patojen olan bir Gram-pozitif, spor oluşturucu bakteridir. Başlangıçta yenidoğanlarda 1, C. dışkısında bulunan bir ortakçı organizma olarak 1935 yılında açıklanan difficile daha sonra antibiyotik tedavisi ile ilişkili 2 psödomembranöz kolit neden olan ajan olduğu gösterilmiştir. C'yi difficile enfeksiyonları (CDI), genellikle C için bir niş oluşturmak, normal kolonik floranın bozulmasına sonuçları antibiyotik tedavisi ile takip edilir difficile 2 gelişmek için. C. difficile fekal-oral yolla bir atıl sporun olarak iletilir ve daha sonra çeşitli toksinleri üreten ve ciddi hastalık ve kolit 3 neden yeteneğine vejetatif hücreleri üreten, gastrointestinal sistem içinde filizlenir edilir. CDI, genellikle geleneksel tedavilere ve bu 'de refrakterFections sık sık 4. tekrarlamış edilir. Sonuç olarak, CDI Amerika Birleşik Devletleri 5-7 sağlık maliyetlerinde kadar 4800000000 $ sorumludur.

C. difficile ortamında oksijen düşük seviyelerde bile çok hassastır. C. için difficile ortamda hayatta kalmaya ve verimli bir konağa ana bulaşabilir, metabolik olarak aktif olmayan sporun oluşumu kritik 8'dir. Çünkü C laboratuvar bakım ve manipülasyon difficile Bu teknikler, bir anaerobik odanın kullanımını gerektiren, kontrollü, oksijensiz bir ortam gerektirir. Anaerobik bölmelerin kullanılması artan geri kazanım ve zorunlu anaeroblar 9-11 izolasyonu ile sonuçlandı ve anaerobik atmosferde gerçekleştirilebilir moleküler teknikler sağladı.

C ek olarak, difficile, burada açıklanan anaerobik odası kullanımı ve bakımı uygulanabilirBu diğer Clostridial türleri (örneğin, C. perfringens), diğer mide-bağırsak türler (örneğin, Bacteroides türleri, 12) ve periodontal patojenlere (örneğin, Peptostreptococcus türlerinin 13) gibi diğer zorunlu anaeroblar için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: C, difficile gastrointestinal hastalığa neden olabilir, insan ve hayvan patojendir. C ile ilgili deneyler difficile uygun biyogüvenlik önlemleri (BSL2) ile yapılmalıdır.

1.. Anaerobik Odası Kullanım ve Bakım

C. difficile sıkı bir anaerob ve atmosferdeki oksijenin düşük konsantrasyonlarda bile son derece duyarlıdır. Bu nedenle, kontrol, anaerobik ortam başarılı manipülasyon için gereklidir. Anaerobik odası (Şekil 1A) kullanılması C. etkili ekimi için en istikrarlı ortamı ve ideal koşulları sağlar difficile ve anaerobik bakteriler 14. Burada, bir gaz karışımı (% 5 CO2,% 10 H2,% 85 N-2) ihtiva eden bir atmosfer stabil bir şekilde muhafaza edilebilir.

Önemli bir oksijen kirlenme olmadan odacık içine bir ürün sunmak için,Bir hava kilidi (Şekil 1B) kullanılmalıdır. Bu cihaz bir gaz alışverişi gibi fonksiyonları ve yarı-manuel veya otomatik olarak, el işleri. Hava kilidinin dışında ve anaerobik odasının iç kısmına erişim sağlayan diğer erişim sağlayan bir: hava kilidi iki kapı vardır. Modele bağlı olarak, hava kilidi ve böylece ayrı bir hava kilidinin maliyet tasarrufu, bitişik anaerobik odasına erişim sunabilir ek bir kapı olabilir. Aktif odasının içinde veya dışında öğeleri hareket sürece, hem kapılar oksijen kirlenmesini önlemek için her zaman kapalı kalmalıdır. Airlock önündeki bir açma / kapama düğmesi ve dört düğme içeren bir panel sahiptir. Gaz hatları ve vakum pompası hortumu biriminin tamamen manuel çalışması için anahtarları bulunan panelin yakınında hava kilidi, arkasına bağlanmıştır. Iki temizlik döngüleri, azot gazı kullanılarak (N2) altında, kullanılan önerilir gaz karışımı (% 5 CO 2 ile değişimi doldurmadan önce,% 10 H2, haznenin içine oksijen miktarını azaltmak için% 85 N2). Ayrıca, ve değişimi dışında ve öğeleri hareket ettirmek için gerekli olan miktarda daha uzun süre boyunca açık ya da kapı bırakmak hiç önemlidir dikkatli odasının içinde ve dışında öğeleri hareket sıklığını azaltmak için deneyler planlıyoruz. Vinil anaerobik odaları için farklı çalışma esasları aşağıda özetlenmiştir. Bu protokolleri takip etmeden önce, bu odacık ile donatılmıştır, üreticinin talimatlarına uygun olduğundan emin olun.

  1. Otomatik Mod
    Bu programlanabilir ve özelleştirilebilir modu ve hava kabinine tarafından tamamen gerçekleştirilir. Airlock programlamak için, üreticinin yönergelerine bakın. Odasına tipik giriş için tavsiye programı yakından Cham içinde tutulan atmosfer eşleşen bir gaz karışımı ile hava kilidi dolum izledi azot gazı kullanılarak iki temizlik döngüleri gerektirirber. Her vakum döngüsü sırasında standart fabrika prosedürleri 20 inHg için bir vakum çekme önermek ve 1 inHg için temizleme.
    1. Iç hava kilidi kapı tamamen kapalı olduğundan emin olun.
    2. Kabinin dış kapıyı açın.
    3. Hava kilidi içine öğeleri yerleştirmek ve Kabinin dış kapıyı kapatın. Sıvılar tanıtan ise, verimli gaz alışverişini sağlamak için yarım kapaklarını sökün. Mühürlü paketler ve kaplar önce döngüsü başlamadan açılmalıdır; bunu yaparken kaçınıyor çözgü ve hasar plasticware ve kaplar olabilir. Sterilite sağlamak için, sadece etkili gaz değişimini sağlayacak kadar paketleri açın.
    4. Başlat düğmesine basın.
    5. Hava kilidi programı aracılığıyla sağlanıncaya ve gösterge okur kadar bekleyin "anaerobik."
    6. Iç hava kilidi kapıyı açın.
    7. Odasına taşıyın.
    8. Iç kapıyı kapatın.
  2. Yarı manuel mod
    Bu mod odasının içinde veya dışında öğeleri geçerken kullanılan ve gerektiğinde c olabiliroda içindeki gazı ycling gereklidir.
    1. Iç hava kilidi kapı tamamen kapalı olduğundan emin olun.
    2. Kabinin dış kapıyı açın.
    3. Hava kilidi içine öğeleri yerleştirmek ve Kabinin dış kapıyı kapatın. Sıvılar tanıtan ise, verimli gaz alışverişini sağlamak için yarım kapaklarını sökün. Bu tür inoküle döngüler ve 96 oyuklu plakalar olarak kapatılmış ambalajların, önce döngüsü başlamadan açılmalıdır.
    4. Menü tuşuna basın.
    5. Başlat tuşuna basın. Airlock Her düğmenin işlevini gösterecektir ve bu tamamlanana kadar cevap vermez:
      • Yukarı ok: Vakum pompası devreye sokar.
      • Aşağı ok: azot (tasfiye) gaz akışı başlatır.
      • Başlangıç: gaz karışımı akışını başlatır.
      • Menüsü: Varsayılan ekrana dönmek.
    6. Ekran 20 İnHg okur kadar düğmesine "Up", hava kilidi gaz çıkarmak.
    7. Basın "Down" ekran az 1 İnHg okuyana kadar, azot ile hava kilidi dolduruyor. Ov etmeyinershoot, bu gibi kendi bütünlüğünü etkileyebilecek, hava kilidi içinde pozitif basınç yaratacaktır.
    8. Ek bir temizleme döngüsü gerçekleştirmek için 6. ve 7. adımları tekrarlayın.
    9. Ekranda kadar basın "Up" 20 İnHg okur.
    10. Basın "Başlat", gaz karışımı ile alışverişini doldurma ekranı daha az 1 İnHg okuyana kadar.
    11. Iç hava kilidi kapıyı açın.
    12. Odasına taşıyın.
    13. Iç kapıyı kapatın.
  3. Manuel Mod
    Otomatik veya yarı-manuel mod çalışmıyor veya basınç kabinine hiçbir güç olduğunda bu mod kullanılabilir. Hava kilidi ile ilgili olduğunda bu modu çalışmaz, bu nedenle hava kilidi içindeki basıncı belirlemek zordur. Vakum çekme ve gaz boşaltma kere vakum ve gaz akış hızlarına bağlıdır olduğu için, sırası ile, içindeki değişimi, bir manometre kullanımı basıncını izlemek ve yaralanma ve hava kilidi zarar riskini azaltmak için gereklidir.
    1. Iç hava kilidi kapı tamamen kapalı olduğundan emin olun.
    2. Kabinin dış kapıyı açın.
    3. Hava kilidi içine basınç göstergesi dahil öğeleri, koyun ve Kabinin dış kapıyı kapatın. Sıvılar tanıtan ise, verimli gaz alışverişini sağlamak için yarım kapaklarını sökün. Bu tür inoküle döngüler ve 96 oyuklu plakalar olarak kapatılmış ambalajların, önce döngüsü başlamadan açılmalıdır.
    4. Etiketli Hava kilidinin arkasındaki üç anahtarları bulun "Manuel Kontrol Cihazları." Bunlar ayrı ayrı etiketli olarak:
      • Vakum için
      • Azot
      • Gaz Mix
    5. Basınç göstergesi yaklaşık 20 İnHg okur kadar durumlu vakum anahtarı çevirmek.
    6. Basınç göstergesi yaklaşık 1 İnHg okur kadar Azot geçiş anahtarını çevirin.
    7. Basınç göstergesi yaklaşık 20 İnHg okur kadar durumlu vakum anahtarı çevirmek.
    8. Basınç göstergesi yaklaşık 1 İnHg okur kadar Azot geçiş anahtarını çevirin.
    9. Basınç göstergesi yaklaşık 20 İnHg okur kadar durumlu vakum anahtarı çevirmek.
    10. Basınç göstergesi yaklaşık 1 İnHg okur kadar Gaz Mix geçiş anahtarı çevirmek.
    11. Iç hava kilidi kapıyı açın.
    12. Odasına taşıyın.
    13. Iç kapıyı kapatın.

2. Kültüre, numaralandırma ve Depolama C. Tabure Örneklerden difficile

Bu prosedür C kurtarmak için tasarlanmıştır difficile dışkı örnekleri sporlarını ihtiva eden ve daha sonra gliserol stoklan halinde, uzun süreli depolama bitkisel hücre veya sporlar halinde izole koloniler korumak. Alternatif olarak, bu prosedür C'ye sayısını saymak için kullanılabilir (örneğin, hayvan çalışmalarında) dışkı örneklerinde difficile mevcut. Seçici ve diferansiyel C için zenginleştirmek difficile, taurokolat-sefoksitin-sikloserin fruktoz agar (TCCFA), normal dışkı 15-16 bitki büyümesini inhibe etmek için kullanılır. Sefoksitin daha geniş C hariç olmak üzere, Gram-negatif ve pozitif hem bakteri büyümesini inhibe ederken, sikloserin, Gram-negatif bakteriler için bakteriyostatik difficile ve en kok suşları girin. Fruktoz fermantasyon pH düşüşü ve sarı, kırmızı / turuncu bir sonraki renk değişimi ile sonuçlanır gibi bir pH göstergesi, nötr kırmızı, ortam içine dahil edilebilir. Verimli C. sporları kurtarmak için difficile bitkisel bakteri olarak, safra tuzu sodyum taurokolat çimlenme 17-18 indüklemek için kullanılır. Çünkü C. C. difficile verimliliğini artırmak olabilir ki, kontamine bitki büyümesini sınırlayan, bitkisel hücreleri azaltmak veya ortadan kaldırmak için kullanılabilir sporlar, alkol veya numune ısıl işlem oluşturmaktadır difficile kurtarma 19. Yukarıda belirtildiği gibi, bu kalıntı oksijen kaldırılmasını sağlamak için kullanımdan önce, anaerobik odası içinde en az 1-2 saat boyunca tüm plakaları ön azaltmak için çok önemlidir. Hava drying odacık içinde kullanılmadan önce, plakalar yoğunlaşmayı azaltabilir. Sıvı ortam hacmi ve ikinci kabın yüzey-hava oranına bağlı olarak azaltmak için en fazla 24 saat gerekebilir.

Başlamadan önce, aşağıdaki öğeler anaerobik odasına konulmalıdır:

  • Dışkı örneği
  • Steril bezlerden
  • Steril aşılanması döngüler
  • 1x PBS (Malzeme)
  • TCCFA plakaları (Malzeme)
  • BHIS (Brain Heart Infusion maya ekstresi ortamı) plakaları ve suyu (Malzeme)
  • % 50 gliserol (sterilize edilmiş)
  • % 10 L-sistein (sterilize edilmiş)
  • Kriyojenik depolama şişeler

* Alternatif olarak, izole edilmiş koloniler -80 ° C de, uzun süreli depolama için% 15 gliserol ile BHIS agar plakaları üzerine yayılır ve daha sonra kazınır ve BHIS sıvı bir ortam içinde yeniden süspanse edilebilir ** Gram-boyama C. belirlemek için etkili bir strateji değildir dikkat etmek önemlidir dışkı örneklerinden 23 doğrudan difficile ; C difficile, ilk olarak dışkıda mevcut diğer bitki izole edilmelidir.

  1. 1x PBS (bu, aerobik şartlar altında gerçekleştirilebilir) 'de dışkı örnek tekrar ve tam olarak dışkı örneği vorteks ile 1x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş olduğundan emin olun. Eğer C'yi numaralandırma gaita difficile önce, 1x PBS eklenmesi için dışkı örneği tartın.
  2. Dışkı gramı başına koloni oluşturan birim (CFU) uygun izolasyon veya numaralandırma için 1x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş dışkı numunesinin bir seri seyreltmeleri yapın.
  3. Aseptik teknik kullanılarak, TCCFA plakalarına her bir seri seyreltme 100 ul geçerlidir.
  4. Steril bir aşılama döngüler, bir dizi çizgi izole edilmiş koloniler veya eşit kolonilerin sayımı için TCCFA levhasının yüzeyi üzerinde uygulanan kültür yaymak için uygulanan kültür kullanılması.
  5. 37 ° C'de 48 saat boyunca anaerobik olarak inkübe Bu, C tespit etmek ve belirlemek mümkündür 24 saat içinde difficile kolonileri dayalıkolonilerin 15 düz, düzensiz, buzlu cam görünümü, daha doğru tanımlama ve numaralandırma 48 saat sonra elde edilir rağmen.
  6. Steril bir aşılama döngü kullanarak, C gibi görünen herhangi bir koloni altkültürü % 0.03 L-sistein 20 ile takviye edilmiş, önceden indirgenmiş, BHIS agar plakaları üzerine difficile. Izole koloniler elde etmek için, her bir kadranda için yeni bir steril aşılama döngü kullanarak, kadranda plaka üzerine bireysel kolonisi ve çizgi seçin. Alternatif olarak, C sayısı Her bir seyreltme difficile kolonileri (bu aerobik koşullarda gerçekleştirilebilir) ve dışkı örneğinin gramı başına koloni oluşturma birimlerinin sayısını hesaplar.
  7. C'yi onaylamak Gram-boyama ile difficile tanımlanması. Mesai Gram boyama, C. difficile mor çubuklar olarak görünür ve bazı hücreler terminali endosporlar içerebilir. Toksin B kodlayan genlerin Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kimlik doğrulamaya sağlayabilirC. Toksijenik suşları difficile 21 multilokus dizisi yazarak (MLST) tanımlama ve C bilinmiyor ve nontoxigenic suşları doğru yazım için başarılı ise 22 difficile.
  8. C 'lik bir stok tutmak için -80 ° C'de difficile, steril bir aşılama döngü kullanılarak BHIS agar levhasından tek bir izole edilmiş koloni almak ve sıvı ortam,% 0.03 L-sistein ile takviye önceden indirgenmiş BHIS 10 ml koloni tekrar süspansiyon. *
  9. Gece boyunca anaerobik olarak kültürü bulanık hale, 37 ° C 'de, ya da kadar inkübe edin.
  10. % 50 gliserol, 333 ul ve 666 ul C ekleme İzole soyun,% 15 gliserol stoku oluşturmak için bir 1.8 ml kriyojenik tüpe difficile kültürü.
  11. Sıkıca kriyojenik tüp kap, iyice karıştırın ve hemen uzun süreli saklama için -80 ° C derin dondurucuda anaerobik odası ve yerden stok kaldırmak.

3. C Kültürleme difficile Dondurulmuş Gliserin Stoklar

Bu prosedür C'ye geri kazanımı sağlar difficile -80 ° C'de saklanan gliserol stoklarından Tekrarlanan donma-çözülme döngüleri vejetatif hücrelerini öldürebilir, çünkü o her zaman dondurulmuş gliserol stokları tutmak önemlidir. Bu kuru buz buharlaştırma odası içinde çevre değiştirmek gibi odacık içinde ve dışında suşları aktarımı için kuru buz kullanılmasını önerilmez. Bunun yerine, taşıma sırasında donmuş gliserol stokları tutmak için dondurulmuş soğutma rafları kullanmanızı öneririz. Çeşitli seçici ve farklı amaçlar için, üç media, genellikle C kültürlenmesi için kullanılan difficile. TCCFA, yukarıda ele alındığı gibi, C için seçicidir difficile ve sodyum tarokolat içeren bir filizlenen. Maya özü (BHIS) ile desteklenmiş beyin kalp infüzyon organizmaların geniş bir yelpazede (Şekil 2A) 24 büyümesine izin veren bir yaygın olarak kullanılan, zenginleştirilmiş ve seçici olmayan bir ortamdır. Sık sık, L-sisteine, bir indirgeme maddesi olarak 20 BHIS eklenir. Son olarak, ortam (Şekil 2B) kan eklenmesinin TCCFA üzerinde daha etkili sporlanma sağlar ve C tarafından sergilenen benzersiz yeşilimsi veya açık yeşil floresans algılama sağlar difficile uzun dalga ultraviyole (UV) ışık 15 (Şekil 2C) altında. C kültürlemek zaman spore stoktan difficile, bu sodyum taurokolat çimlenme sağlamak için ortama ilave edilmesi gereken hatırlamak önemlidir.

Başlamadan önce, aşağıdaki öğeler anaerobik odasına konulmalıdır:

  • Dondurulmuş gliserol stok (raf soğutma)
  • Steril aşılanması döngüler
  • TCCFA veya BHIS plakaları (Malzeme)
  • BHIS suyu (Malzeme)
  • % 50 gliserol (sterilize edilmiş)
  • Kriyojenik depolama şişeler
  1. C donmuş gliserol stokları yerleştirin -80 ° C pr saklanmış bir soğutma rafa difficileçözülme önlemek için kullanmak mekanına.
  2. Anaerobik odasına kuru buz üzerinde donmuş gliserol stokları getirin.
  3. Aseptik teknik ve steril bir aşılama döngü kullanılarak, plakanın bir kadran arasında plaka ve şerit üzerine stokunun küçük bir miktar.
  4. Plakası 90 ° döndürmek ve yeni bir steril aşılama döngü kullanarak, ikinci çeyrek boyunca çizgi devam ediyor.
  5. Tek tek kolonilerin izole sağlamak için, üçüncü ve dördüncü çeyrek için tekrarlayın.
  6. Hemen anaerobik odasından donmuş gliserol stokları kaldırmak ve -80 ° C'ye geri
  7. 37 ° C de bir gece boyunca anaerobik olarak inkübe Bağımsız koloniler izole edilmiş, gece boyunca büyütüldükten sonra dikkate alınmalıdır.

4. C. saflaştırmak sporlar difficile

Sporülasyon oksijen açısından zengin ortamlarda hayatta kalma ve hastalık 8 etkin iletimi için gerekli olduğu gibi, spor stoklarının hazırlanması ofte olduğumikroskopi ve hayvan çalışmaları ile sınırlı değildir alt uygulamalar için gerekli olan n. Bu sporlar sıralandıran sayıları Tekrarlanabilirligin sağlamak tekrarı gerektirdiğini unutmayın önemlidir. Sporlar iyi plastik uymak beri seyreltilerde arasında yukarı ve aşağı pipetleme birkaç kez de kaybını azaltır.

C. Sporlanma difficile sporogenic diğer türler gibi hızlı veya homojen değildir. , Spor üretimi ve kurtarma optimize sporulasyon orta (SMC) 17,25 veya 70:30 orta 26 ya önerilir. Büyüme 72 saat sonra - (mililitre başına 10 8 sporlar 10 7) yaygın olarak kullanılan diğer ortam etkin bir sporülasyon 27 görülmektedir önce büyüme 4-5 gün gerektirir BHIS, ve Clospore, sporların yüksek titrelerini üreten bir sıvı ortam bulunmaktadır. Diğer protokoller yerine PBS 20 1x daha buz gibi soğuk su kullanmak, ancak, izotonik bir çözeltinin kullanımı birbirleriyle ve plastik yüzeylere yapışmasını sporlar azaltabilir. Seçenek olarak,Bazı araştırmacılar, ayrıca tamamen bitkisel hücreleri ve enkaz 29 kaldırmak için sukroz gradyan kullanılarak bunların sporlarının arındırmak.

Başlamadan önce, aşağıdaki öğeler anaerobik odasına konulmalıdır:

  • Steril aşılanması döngüler
  • BHIS, SMC ve / veya 70:30 plakaları (Malzeme)
  • BHIS suyu (Malzeme)
  • 1x PBS, filtre sterilize (Malzeme)
  1. Kültür önceden indirgenmiş BHIS plakalar üzerine dondurulmuş gliserol stokundan suşları ve 37 ° C de bir gece boyunca anaerobik olarak inkübe
  2. Birçok ön-indirgenmiş SMC ve 70:30 plakalar üzerine Restreak ve 24-48 saat boyunca 37 ° C'de anaerobik olarak inkübe edilir. Spor Oluşumu faz kontrast mikroskobu ile takip edilebilir. Sporlar faz parlak iken vejetatif ve anne hücreleri faz karanlık görünür görünecektir. * Bir alternatif olarak, sporlar Strai bağlı olarak, mililitre başına 10 5 -10 6 sporlar getirir ve burada, 24-48 saat sonra 70:30 sıvı ortam saflaştırılabilirn kullanılır.
  3. Steril bir aşılama döngü kullanarak, plakaları kazımak ve 10 ml steril 1x PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon.
  4. Plakaları atın ve anaerobik odasından spor süspansiyonu çıkarın. 15 dakika boyunca 3000 x g'de Pelet hücreleri. Tam olarak hücre topağı, her zaman yeniden süspansiyona, 1 x PBS içinde hücreleri iki kez yıkayın.
  5. Bitkisel ve ana hücrelerin parçalanması yardımcı olmak için 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  6. Herhangi bir artık bitkisel hücrelerini öldürmek için 20 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edilir.
  7. Mililitre başına birimler (CFU) oluşturan koloni belirlemek için, seri +% 0.1 sodyum taurokolat BHIS her bir spor 1x PBS içinde hazırlanmasını ve plaka seyreltin. Koloniler numaralandırma 24 saat önce en az inkübe edin.
  8. Sporlar, uzun süreli depolama boyunca oda sıcaklığında ya da 4 ° C ya da 1 x PBS içinde saklanabilir. 4 ° C'de saklanır, bu etkin çimlenme yeniden 15 dakika boyunca 55 ° C de spor hazırlık yeniden ısıtmak için yararlı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

C. bir örneği BHIS ve Columbia anaerobik koyun kan agar ortamı üzerinde büyütülmüş difficile, Şekil 2'de görülebilir. C. difficile düz ve hem de medya üzerinde belirgin bir buzlu cam görünümü sahip düzensiz koloniler oluşturur. Burada, C'lik bir eritromisin duyarlı klinik izolat difficile, 630E 30, 37 ° C '(Şekil 2A), 24 saat boyunca, BHIS ağar, bir zenginleştirilmiş ve seçici olmayan ortam üzerinde yetiştirilir. Columb...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan yöntemler, C, basit ve hızlı bir iyileşme sağlar insan, fare ve hamster, hem de C, uzun süreli depolama içeren dışkı örnekleri, çeşitli difficile gliserol veya spor hisse senetleri gibi difficile. C. difficile yetiştirmek için zor bir organizma olabilir, ancak dikkatli bir anaerobik ortam bakım ve aseptik tekniklerin uygulanması güçlü büyüme ve kirlenme bir azalma sağlayabilir.

Anaerobik odaları: Hususlar ve Bakım

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz nazik anaerobik odasının fotoğraflarını sağlamak için Coy Laboratuvarları teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe DK087763 (SMM) ve STEP / HHMI Müfredat Geliştirme Bursu (ANE) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Proteoz Pepton no. 2BD212120
Na2< / sub>HPO4< / sub>FisherS373
KH2< / sub>PO4< / sub>FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO4< / sub> (susuz)FisherM65
á'...-FruktozFisherL96
Sodyum taurokolatSigmaT4009
á'...-sikloserinSigmaC6880
SefoksitinFlukaC4786
Beyin kalp infüzyon ortamıBD237300
Proteoz PeptonBD211684
(NH4)2SO4SigmaA5132
Tris tabanıFisherBP152
AgarBD214010
L-sisteinSigmaC7755
BactoPeptoneBD211684
Kolombiya koyun kanı agarFisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
GliserolFisherBP2291
Steril aşılama halkalarıFisher22363596
Steril swablarFisher1495990
Coy Vinil Anaerobik Oda ve AksesuarlarıCoy Laboratuvar Ürünleri, IncMüşteri Tarafından BelirtilenBu ürünler laboratuvar ihtiyaçlarına
Materials
TCCFA agar

Proteoz pepton no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (susuz) 0.1 g
Fruktoz 6 g
Agar 20 g

Deiyonize su ve otoklav ile 121 &°C'de 1 L'ye getirin; Sterilize etmek için 20 dakika C.

Otoklavlamadan sonra ekleyin:
10 ml %10 (a/h) sodyum taurokolat, filtreyle sterilize edilmiş (suda çözülür; nihai konsantrasyon, %0.1)
25 ml 10 mg/ml á'...-sikloserin, filtreyle sterilize edilmiş (suda çözülür; nihai konsantrasyon, 250 μ g / ml) < br / > 1.6 ml 10 mg / ml sefoksitin, filtreyle sterilize edilmiş (suda çözülür; nihai konsantrasyon, 16 & mu; g/ml)

BHIS Orta

Beyin kalp infüzyonu 37 g
Maya özütü 5 g

Plakalar için 15 g agar ekleyin. Deiyonize su ve 121 ° C'de otoklav ile 1 L'ye getirin; Sterilize etmek için 20 dakika C.

İsteğe bağlı (otoklavlamadan sonra ekleyin):

3 ml %10 (a/h) L-sistein (suda çözünür; son konsantrasyon, %0.03)
10 ml %10 (a/h) sodyum taurokolat (suda çözünür; nihai konsantrasyon, %0.1)

SMC Sporülasyon Ortamı
BactoPeptone 90 g
Proteaz pepton 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris tabanı 1.5 g
Agar 15 g

Deiyonize su ve otoklav ile 121 &°C'de 1 L'ye getirin; Sterilize etmek için 20 dakika C.

İsteğe bağlı (otoklavlamadan sonra ekleyin):
3 ml %10 (a/h) L-sistein (suda çözülür; son konsantrasyon, %0.03)

70:30 Orta

BactoPeptone 63 g
Proteaz pepton 3.5 g
Beyin kalp infüzyonu 11.1 g
Maya özü 1,5 g
(NH4)2SO4 0,7 g
Tris tabanı 1,06 g

Plakalar için 15 g agar ekleyin. Deiyonize su ve 121 ° C'de otoklav ile 1 L'ye getirin; Sterilize etmek için 20 dakika C. Otoklavlamadan sonra 3 ml %10 (a/h) L-sistein (nihai konsantrasyon, %0.03) ekleyin.

Kan agar

Hazır Columbia anaerobik koyun kanlı agar plakalarının (Fisher Scientific, L21928) kullanılması 35 kullanılması önerilir.

1X Fosfat tamponlu salin (PBS)

NaCl 8,01 g
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,44 g
KH2PO4 0,27 g

Deiyonize su ile 1 L'ye getirin ve HCl ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Filtreleme Kullanmadan önce sterilize edin.
göre özel olarak sipariş edilir

Kaynaklar

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Anaerobik KabinFekal rnek zolasyonuGliserol Stok Haz rlamaSpor Say mSelektif Besiyerine EkimAnaerobik nk basyonCFU HesaplamasBiyog venlik D zeyi kiVejetatif H cre K lt r

İlgili makaleler