Testis Germ Hücrelerinin Üç Boyutlu Kromatin Mimarisini Korumak için Slayt Hazırlama Yöntemi

Özet

Buradaki materyal testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilen bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntem subnükleer yapıların tespiti için hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) için geçerlidir.

Özet

Testis germ hücre farklılaşması sırasında nükleer kromatin yapısı dinamik olarak değişir. Aşağıda, farelerde bulunan testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin düzenini korumak için tasarlanmış bir yöntem açıklanmaktadır; bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak ad verilmiştir. Bu yöntemde, testis tübülleri doğrudan sitoplazmik malzemeyi uzaklaştıran bir permeabilizasyon adımı ve ardından nükleer malzemeleri düzelten bir fiksasyon adımı ile muamele edilir. Tübüller daha sonra ayrışır, hücre süspansiyonu sitospundur ve hücreler slaytlara yapışır. Bu yöntem subnükleer yapıların saptanmasında hassasiyeti artırır ve immünoresans, DNA ve RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve bu tespit yöntemlerinin kombinasyonu için geçerlidir. 3D slayt yönteminin olası bir uygulamasına örnek olarak, nascent RNA'ları algılamak için bir Cot-1 RNA FISH gösterilir. 3D slayt yöntemi, testis germ hücre farklılaşması sırasında kromatin yapısı, DNA ve RNA arasındaki mekansal ilişkilerin ayrıntılı olarak incelenmesini kolaylaştıracaktır.

Giriş

Testislerde, mikrop hücreleri diploid spermatogonia'dan meiosis yoluyla olgun, haploid spermatozoaya farklılaşır. Bu işlem sırasında mikrop hücrelerinin nükleer kromatin yapısı sürekli ve dinamik olarak yeniden şekillendirilir. Yüzey yayılımları genellikle bireysel spermatojenik hücrelerin sitolojik incelemesi için kullanılır. Yaygın bir yüzey yayılım yöntemi, bireysel spermatojenik hücrelerin yayıldığı ve düzleştirildiği hipotonik tedaviyi kullanmaktadır¹. Bu koşullar meiotik kromozomların ayrıntılı analizi için en uygun olanıdır. Sinaptik durum ve rekombinasyon odakları gibi kromozomal özellikler bu yöntem kullanılarak kolayca gözlenir. Bununla birlikte, hipotonik tedavi subnükleer kromatin mimarisini bozar, bu nedenle bu teknik çekirdeklerin yapısal analizi için uygun değildir. Sonuç olarak, testis germ hücrelerinin üç boyutlu kromatin yapısını korumak için geliştirilmiş bir yöntem tasarlanmıştır. Bu yöntem üç boyutlu (3D) slayt yöntemi olarak adlanmıştır (Şekil 1). 3D slayt yöntemi, başlangıçta RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH)^2,3ile testis germ hücre farklılaşması sırasında gen ekspresyasyonu ve kromatin durumlarını incelemek için optimize edildiği için çekirdeklerde nascent RNA lokalizasyonunun tespit edilmesini sağlamıştır. Bu 3D yöntem immünofluoresans, DNA ve RNA FISH kombinasyonu için de geçerlidir. Ek olarak, bu yöntem postmeiotik spermatidlerde bulunan cinsiyet kromozomlarının sessiz bir bölmesi olan postmeiotik cinsiyet kromatinin (PMSC) keşfine yardımcı olmuştur².

3D slayt yöntemi başlangıçta nükleer boyama için yaygın olarak kullanılan iki temel slayt hazırlama adımının kombinasyonu ile optimize edilmiştir: nükleer malzemeleri düzeltmek için tasarlanmış sabitleme adımı ve antikorlar ve FISH probları gibi boyama reaktiflerinin erişilebilirliğini artırmak için sitoplazmik malzemelerin çıkarılması amaçlanan permeabilizasyon adımı. Daha önce başka bir yayında açıklandığı gibi³, düşük sitoplazmik arka plan ile en uygun sonuçları elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerektiği belirlenmiştir. Bu 3D slayt yönteminde, permeabilizasyon adımı ve sonraki sabitleme adımı doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir ve slaytlara sitospinningden önce mikrop hücrelerinin tokalarla mekanik ayrışması ile takip edilir. Spermatojenik hücrelerin RNA BALIK için alternatif bir yöntem başka bir laboratuvarda geliştirilmiştir⁴. Bu yöntemde, 3D yöntemiyle tutarlı olarak, RNA FISH'in en iyi sonuçlarını elde etmek için permeabilizasyon adımının sabitleme adımından önce gelmesi gerekir.

Aşağıdaki protokol 3D slayt yöntemini açıklar ve nükleer nascent RNA'ların tespiti için olası bir uygulama olan Cot-1 RNA FISH'e bir örnek sağlar. Karyola-1 DNA'sı genomdaki tekrarlayan elementlerden oluşur. Burada, bir Cot-1 DNA probu, nascent transkriptlerinin bir intron ve UTR'sine melezlenmiştir, böylece çekirdek^5,6'dakitranskripsiyonal olarak aktif bölgeleri tespit eder. Kromatin mimarisi arasındaki mekansal ilişkilerin detaylı incelenmesini sağlamak için 3D slaytlar çok yönlüdür ve immünofluoresans, DNA ve RNA FISH tekniklerinin bir kombinasyonuna uygulanabilir.

Protokol

1.3D Slayt Hazırlama

1. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:
   1. CSK tamponu: 100 mM NaCl, 300 mM sakkaroz, 10 mM PIPES, 3 mM MgCl₂. 1 M NaOH ile pH'ı 6,8'e ayarlayın. CSK tamponu 4 °C'de saklayın.
   2. %0,5 Triton X-100 ile CSK tamponu: 200 μl Triton X-100 ila 40 ml CSK tampon ekleyin. Triton X-100 tamamen çözünene kadar çözeltiyi manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın. CSK tamponu %0,5 Triton X-100 ile 4 °C'de saklayın.
   3. %4 Paraformaldehit (PFA)–PBS, pH 7.4: 4 g PFA'yı yaklaşık 70-80 ml suda çözün. Çözünme işlemini hızlandırmak için yaklaşık 20 μl 4 N NaOH ekleyin ve çözeltiyi PFA tamamen çözünene ve çözelti şeffaf olana kadar 60 °C'de bir su banyosunda tutun. Bu işlem yaklaşık 1 saat sürer. PFA tamamen çözüldükten sonra, 10 ml 10x PBS ekleyin. Son ses seviyesini su ile 100 ml'ye ayarlayın ve çözeltiyi oda sıcaklığına (25 °C) soğutun. Her yeni deney için yeni hazırlanmış bir çözüm kullanın.
      Not: Tüm hayvan işleri için kurumsal izin alın ve ilgili hayvan bakım yönergelerine uyun.
2. Erkek farelere ötenazi. Tokslar ve makas kullanarak testisleri fareden açın. Testisleri PBS'ye (veya RPMI 1640)'a yerleştirin. Testislerin çıkarılmasından sonra, RNA'nın bozulmasını önlemek için aşağıdaki 1.3-1.4 adımlarını hızla uygulayın.
3. Testisleri küçük bir Petri kabında yırtın ve tunica albuginea 'yıçıkarın. PBS'deki seminifer tübülleri, todükler kullanarak buz üzerinde çözün.
4. Forseps kullanarak, birkaç tübül (yaklaşık 5-10 mm uzunluğunda birkaç tübül parçası) 500 ml CSK tampon + % 0,5 Triton X-100 içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın ve 6 dakika kuluçkaya yatırın. CSK arabelleğine aşırı maruz kalmak hücrelerin bozulmasına neden olabilir.
5. Forseps kullanarak, tüm tübülleri% 4 PFA-PBS çözeltisi içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın. Bu adım stereomikroskop olmadan önceden biçimlendirilebilir, ancak isteğe bağlı olarak kullanılabilir. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Aynı zamanda kuluçka dönemlerinde 12 sitospin odası hazırlamaya başlayın.
6. Tokmakları kullanarak, tüm tübülleri PBS içeren 4 kuyulu bir kabın bir kuyusuna aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
7. Cam bir slaydın arka tarafında, tüm tübülleri 30 μl PBS'ye aktarın (katyonik yük nedeniyle slaydın üst kısmı önlenmelidir). İki yaban arısının uçlarını kullanarak tübülleri parçalara ayırın. Tübülleri iki yaban arısının uçları arasında kırparak ve tokmakları yatay olarak çekerek yatay yönde doğrayın. Bu adıma yaklaşık 10-20 saniye devam edin.
8. Süspansiyonu P20 pipet kullanarak pipetle karıştırın.
9. Süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, PBS ile yaklaşık 1,3 ml'ye seyreltin. 12 sitospin odasının her birine (toplam 1,2 ml) 100 μl süspansiyon uygulayın. Bu adımda, hücrelerin konsantrasyonunun belirlenmesi gerekmez.
10. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 rpm'de cytospin. Sitospinnlemeden sonra, laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca kuru kaydıraklar. Slaytların birkaç dakika boyunca tamamen kurumasına izin verildikten sonra, bir sonraki adıma geçin.
11. PBS içeren bir Coplin kavanozu kullanarak, slaytları oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
12. Slaytları% 70 etanol içeren bir Coplin kavanozuna aktarın ve RNA FISH'in başlatılmasından önce en az 2 dakika bekleyin. Slaytlar 4 °C'de% 70 etanolde birkaç hafta stabildir. Uzun süreli depolama için, Coplin kavanozlarında her biri 2 dakika boyunca% 80 ve% 100 etanol ile seri işlem kullanarak susuz slaytları susuz bırakın ve hava kurusu slaytları tamamen susuz bırakın. -80 °C'de bir slayt kutusunda saklayın.

2. Rastgele Astarlama ile Cot-1 DNA Prob Hazırlama

1. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:
   1. Hibridizasyon tamponu: 900 ml hibridizasyon tampon stoğu hazırlamak için işlem bileşenlerini karıştırın; bu çözüm probları stoklamak için kullanılacaktır. Bu hibridizasyon tampon stoğu, hibridizasyondan önce% 10 hacimli RNase inhibitör çözeltisinin (Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi) eklenmesini sağlar.

      parça	Miktar (μl)	Son konsantrasyon
      Formamid	500	%50 (v/v)
      %50 Dektran	200	%10 (w/v)
      20x SSC	100	2x
      %1 BSA	100	0.1%

      Hibridizasyondan önce, son konsantrasyona uyacak şekilde hibridizasyon tampon stoğuna 200 mM Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi'nin 1/10 vol'unu veya suyu ekleyin. -20 °C'de, bu karışım bir yıldan fazla bir süre stabildir.
   2. 20x SSC: Yaklaşık 800 ml suda 88,2 g sodyum sitrat ve 175,3 g NaCl çözün. Birkaç damla 1 M HCl kullanarak pH'ı 7,0'a ayarlayın. Hazırlık sonrası oda sıcaklığında 20x SSC saklanabilir.
   3. % 50 (w/v) Dektran: Suyu karıştırın ve yavaşça 50 g dektran sülfat ekleyin. Oda sıcaklığında gece boyunca karıştırmaya devam edin. Son ses seviyesini 100 ml'ye ayarlamak için su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
2. Aşağıda listelenen aşağıdaki bileşenleri bir PCR tüpüne ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, çözeltiyi 95 °C'de 5 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın.

   parça	Reaksiyon başına miktar (μl)	son
   Karyola-1 DNA:1 mg/ml	1	1 μg
   Rastgele 9mer astar (kitten)	10
   Su	27

3. Santrifüj kısa bir süre ve buza yerleştirin.
4. Aşağıdaki bileşenleri ekleyin. Pcr makinesi kullanarak 37 °C'de 30 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın. (Kullanılan kitin ayrıntıları için reaktifler ve ekipman tablosuna bakın).

   parça	Reaksiyon başına miktar (μl)	Son konsantrasyon
   Adım 2.2'den hazırlanan karışım	38
   5x nükleotid tampon (kitten)	9.2
   Cy3-dUTP (1 mM)	0.8	16 μM
   Klenow (kitten)	2

5. Reaksiyonu durdurmak için 2 μl durdurma tamponu (kitten) ekleyin.
6. Mikrospin sütunlarını kullanarak durdurulan reaksiyonun saflaştırılması.
7. Saflaştırılmış fraksiyona 50 μg (5 μl) fırlayan sperm DNA'sı (50 kat şablon Cot-1 DNA fazlalığı) ekleyin.
8. Pipet kullanarak toplam hacmi ölçün. 4 °C'de bir mikrosantrifüj kullanarak maksimum hızda (17.000 x g) 0,7x hacim % 100 etanol ve 0,1x hacim 3 M sodyum asetat (pH 5,2) ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüj ekleyin.
9. Sıvıyı çıkarın ve % 70 etanol 200 μl ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de maksimum hızda 5 dakika santrifüj.
10. Fazla sıvıyı çıkarın. Çökelticiyi oda sıcaklığında 10-30 dakika kurutun.
11. Peletin 20 μl hibridizasyon tampon stoğunda çözün. Peletin çözülmesi genellikle zor olduğundan, pipet tekrar tekrar. Alternatif bir seçenek olarak, peleti verimli bir şekilde çözmek için bir girdap karıştırıcısı da kullanılabilir. Problar kullanıma kadar -20 °C'de tutulabilir.

3. Karyola-1 RNA BALIK

1. Aşağıda listelenen bileşenleri bir PCR tüpüne ekleyin. Bir PCR makinesi kullanarak, 80 ° C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın, ardından 42 ° C'de yaklaşık 10-30 dakikalık bir preannealing adımı. Melezleme işlemine kadar 42 °C'de tutun. Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi isteğe bağlıdır; su ile değiştirilebilir.

   parça	Reaksiyon başına miktar (μl)	son
   Karyola-1 DNA probu (50 ng/μl)	2	100 ng
   Ribonucleoside Vanadyl Kompleksi (200 mM)	2	20 mM
   Karmalaştırma arabelleği	20'ye eklendi

2. 2 dakika boyunca% 80 etanol içeren bir Coplin kavanozunda dehidrat kayar, ardından 2 dakika boyunca% 100 etanol içeren bir Coplin kavanozu. Oda sıcaklığında tamamen laboratuvar tezgahında kuru kaydıraklar.
3. Bir uç kutu haznesi (2-3 cm su ile doldurulmuş) önceden 42 °C inkübatörde ısıtın. Slaydı uç kutusu haznesine yerleştirin. Önceden tasarlanmış probları ve pipeti doğrudan susuz slaytlara kısaca santrifüjleyin. Kabarcık yapmaktan kaçının. Slaydı bir kapak kayması ile hafifçe örtün.
4. 42 °C'de 6 saat ila bir gecede (14-15 saat) melezlen.
5. Coplin kavanozlarında yıkama çözeltileri hazırlayın (hem 2x SSC hem de% 50 formamid içeren iki kavanoz ve 2x SSC'li iki kavanoz). 42 °C'de bir su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın.
6. Kapak fişini slaydın kenarından çıkarmak için jilet kullanın. Örnekleri çizmekten kaçının. Slaytları 2x SSC ve% 50 formamid içeren bir Coplin kavanozunda 45 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı bir kez yineleyin.
7. Slaytları 2x SSC içeren bir Coplin kavanozunda 45 °C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı bir kez yineleyin.
8. Slaytlara 20 μl DAPI montaj ortamı ekleyin ve kapak kayması ile örtün. Ekstra montaj medyasını çıkarmak için kapak camına hafifçe basın. Temizleme dokusu ile ekstra montaj ortamı leke. Slaytlar mikroskopi değerlendirmesi için hazır.

Sonuçlar

3D slaydın temsili bir sonucu Şekil 2'de gösterilir. Bu deneyde Cot-1 RNA FISH, anti CBX1 ve φH2AX antikorları kullanılarak immünostaining ile birlikte nascent transkripsiyonunu tespit etmek için gerçekleştirildi. RNA FISH ve immünostaining'i birleştirmek için önce immünostaining yapıldı, ardından^3'teaçıklandığı gibi RNA FISH . CBX1, XY vücudu (veya seks vücudu) adı verilen meiosisteki perisantronerik heterokromatin ve sessiz cinsiyet kromozomlarına lokalize olan bir heterokromatin proteinidir...

Tartışma

3D slayt hazırlamada, permeabilizasyon adımı sabitleme adımından önce gelir. Bu adımlar doğrudan seminifer tübüller üzerinde gerçekleştirilir, böylece üç boyutlu kromatin yapısı korunur. RNA/DNA FISH için kromatin yapısını korumak için alternatif bir seçenek, permeabilizasyon adımını ve fiksasyon adımını aynı anda gerçekleştirmektir. Bu alternatif teknik keseli mikrop hücrelerinde ve fare preimplantasyon embriyolarında^7,8. Ancak, sabitleme adımı permeabilizasyon adımından önce gelirse, yüksek sitoplazmik arka ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cot-1 DNA'sı	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Fluor Floresan Etiketleme Kiti	Agilent	300380
Ringa balığı sperm DNA Çözeltisi	Invitrogen	15634-017
Etanol. 200 kanıt (mutlak)	Pharmco-aaper	111000200
Sodyum asetat	Sigma-Aldrich	S2889
Formamid deiyonize	Amerikan Biyoanalitik	AB00600-00500
Sodyum sitrat tribazik dihidrat	Sigma-Aldrich	C8532
Sığır serum albümini	Lifeblood Medical	77110-100
Leuconostoc spp.'den dekstran sülfat sodyum tuzu.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sükroz	Sigma-Aldrich	S0389
BORULAR	Sigma-Aldrich	P6757
Magnezyum klorür hekzahidrat	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	76240
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	221465
Fosfat tamponlu salin	Sigma-Aldrich	P4417
DAPI Vektör Laboratuvarları H1200
Ribonükleozit-vanadil kompleksi	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Sütunlar	GE Healthcare	27-5330-01
Mikrosantrifüj	Eppendorf	5424
Forseps	VWR	300-050
Mikrosantrifüj tüpleri	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Kavanoz	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Mikroskop Slaytları	Fisher	12-550-15
4 kuyulu çanak	Fisher	12-566-301
Kapak camı	Fisher	12-544-G
Hava inkübatörü	Devrim Niteliğinde Bilim	RS-IF-203