Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mukozal yüzeyler, çevreye nüfuz eden dış tehditlere karşı koruma sağlayan fiziksel ve immünolojik bariyerler görevi görer^1,2. Patojenik organizmalar istila ettiğinde bu koruyucu epitel bariyeri tehlikeye atılabilir². Bakteriyel bir patojen durumunda, bu karşılaşma genellikle doğuştan gelen bağışıklık sistemini aktive ederek ve nötrofiller^2-4olarak bilinen ilk müdahale granülositlerinin hızlı bir şekilde harekete geçirilmesine neden olarak enflamatuar bir süreci tetikler. Nötrofil alımını kolaylaştıran kemotaktik ajanlar kısmen, konukcu patojen^2-4'tenkurtulmak isteyen mukozal epitel hücreleri tarafından üretilir. Mukozal epitel yüzeyinin aşırı veya çözülmemiş nötrofil infiltonu önemli patolojiye neden olabilir^1,5. Bu, anti-bakteriyel nötrofil cephaneliğinin neden olduğu spesifik olmayan doku hasarının bir sonucudur^5-7. Bu gibi durumlarda, nötrofillerin bakteriyel boşluk kapasitesi, bulaşıcı bir hakaret sırasında konak dokusunun tahrip edilmesiyle gölgelenmiştir.  Koruyucu epitel bariyer fonksiyonunun bozulması, alttaki dokunun mikroorganizmalara ve/veya toksinlere daha fazla maruz kalmasına yol açarak hastalık patolojisini daha da kötüleştirebilir^8,9. Bu sonuçlar akciğer ve sindirim sistemi de dahil olmak üzere birden fazla organ sisteminde görülebilir^1,5. Ayrıca, şiddetli astım nöbetleri, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ve inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi noninferektif inflamatuar durumlar, mukozal epitel bariyerinin patolojik ihlali ile aşırı nötrofik yanıt^4,5,10-12ile işaretlenmiştir.

Mukozal enfeksiyonu takiben nötrofil işe alımının karmaşık süreci, birkaç bölümlere ayrılmış adım^1,5,13,14içerir. İlk olarak, nötrofiller trans-endotel göçini kolaylaştıran bir dizi hücreden hücreye etkileşim yoluyla dolaşımdan kalkmalıdır^1,13. Nötrofiller daha sonra hücre dışı matris^1,14içeren mevcut geçiş boşluğunda gezinir. Enfekte mukozanın lümenine ulaşmak için, nötrofillerin daha sonra epitel bariyeri^1,4,5boyunca göç etmesi gerekir. Bu karmaşık multistep fenomeni genellikle enfeksiyonun in vivo hayvan modelleri kullanılarak agregada araştırılır¹⁵. Bu tür modeller, kemokinler, yapışma molekülleri veya genel sürece katılan ancak her ayrı bölümlere ayrılmış adım¹⁶için kritik olan moleküler katkıları çözmek için büyük ölçüde yetersiz olan sinyal yolları gibi belirli faktörlerin gerekliliğini belirlemek için yararlıdır. Nötrofillerin trans-endotel, trans-matris veya trans-epitel göçünü modelleyen kokültüre in vitro sistemler bu konuda özellikle yararlı olmuştur^1,14,16,17.

Patojenik enfeksiyon^18-22'yeyanıt olarak nötrofil trans-epitel göçünden sorumlu mekanizmaların deşifre edilmesi amacıyla sağlam bir kokültür tahlil sistemi geliştirilmiştir. Bu model, polarize insan epitel hücre katmanlarının apikal yüzeyini bakteriyel bir patojenle enfekte etmeyi ve ardından yeni izole edilmiş insan nötrofillerinin bazolateral yüzeye uygulanmasını içerir^18-22. Nötrofiller, patojenik enfeksiyon^18,21-23'ünardından salgılanan epitel türevi kemotektik ürünlere yanıt olarak epitel bariyeri boyunca göç eder. Bu model sistemi, uygun doku spesifik bakteriyel patojenlere maruz kalan bağırsak ve akciğer epitel kültürleri kullanılarak kullanılmıştır ve mukozal enfeksiyon sırasında nötrofil işe alım süreci için önemli olan yeni moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmıştır^3,8,19,24-28. Bu in vitro kokültür modelinin gücü, indirgemeci bir yaklaşımın araştırmacının iyi kontrol edilen, oldukça tekrarlanabilir, oldukça ucuz bir sistemde patojeni, epitel bariyerini ve/ veya nötrofili deneysel olarak manipüle etmesini sağlar. Bu yaklaşımdan toplanan içgörü, in vivo enfeksiyon modelleri^22,29,30kullanarak nötrofil alımı sırasında bölümlere ayrılmış olayların odaklanmış analizini yapmak için etkili bir şekilde kullanılabilir.

Bu makalede, patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçini keşfetmek için bu tekrarlanabilir modelin başarılı bir şekilde kurulması için gerekli birden fazla adım göstermektedir.  Pseudomonas aeruginosa patojeni ile enfekte olan akciğer epitel bariyerleri bu makalede yer almaktadır; bununla birlikte, diğer doku epitelleri ve patojenleri küçük değişikliklerle değiştirilebilir. Ters kollajen kaplı geçirgen transwell filtrelerinde polarize akciğer epitel hücre katmanlarının tohumlaması ve kültleştirilmesi, patojenik P. aeruginosa'nın büyümesi ve nötrofillerin tam kandan izolasyonu gibi burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu bileşenlerin patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünü gözlemlemek için nasıl birleştirildiği, tekrarlanabilir bir test oluşturmak için uygun pozitif ve negatif kontrollerle birlikte sunulmaktadır. Patojen kaynaklı nötrofil trans-epitel göçünün çeşitli yönlerini incelemek için bu yaklaşımın çok yönlülüğü literatürdeki belirli çalışmalara atıfta bulunularak tartışılmaktadır.

Adımlar (1-3) laminer akış davlumbaz altında steril bir ortamda yapılmalıdır.

1. Kollajen Kaplama Transwells

1. 30 μg/ml kollajen çözeltisi yapın. Seyreltin 3 mg/ml kollajen stoku 1:100% 60 etanol 0.2 μm filtre ünitesinden geçirildi.
2. Vortex seyreltilmiş 30 μg/ml çözelti. Not: Bu çözelti oldukça viskoz olduğundan ve hava kabarcıkları sokulabileceği için 3 mg / ml kollajen stok çözeltisini girdaplamak gerekli değildir, pipetleme sırasında potansiyel olarak doğruluğu azaltır.
3. 0,33 cm² büyüme alanı transwells ile gözenek boyutu 3 μm dış ambalajdan çıkarın ve 12 transwells içeren 24 kuyu plakasını kaputun içine baş aşağı yerleştirin.
4. Alt plakayı kaldırın ve kenara yerleştirin. Not: Transwells artık 24 kuyu plakasının kapağının üzerinde baş aşağı dinlenecek
5. Bunsen brülör'lüyi aç. Sterilite için alev hemostat ve soğumaya bırakın.
6. Steril hemostat ile transwells'i 150 mm x 25 mm Petri kabına aktarın ve ters konumda tutun. Not: Epitel hücreleri ile tohumlandıktan sonra transwellleri barındırmak için kullanılacak boş 24 kuyu plakası artı kapağın sterilitesini koruduğunuzdan emin olun.
7. 30 μg/ml kollajen çözeltisinin pipet 70 μl'si her ters transwell'in filtre zarına. Not: Yüzey gerilimi, alt yüzeye erişirken filtre zarının etrafında duvar olmadığından bu çözelti hacmini yerinde tutmalıdır. Kollajen çözeltisinin transwell'in yan tarafına damlamamasına dikkat edin ve kaplama prosedürü sırasında transwellleri hareket ettirmekten kaçının.
8. Etanol çözeltisinin buharlaşması için Petri kabının kapağını en az 4 saat kapalı bırakın. Bu işlem sırasında steriliteyi korumak için davlumbaz fanını ve ultraviyole ışığını açık tutun.
9. Transwells kuruduktan sonra, Petri kabı kapağının yerinde olması ve sterilitenin korunması koşuluyla hemen kullanılabilir veya oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklanabilir.

2. Transwelllerin Tohumlandırılması için Epitel Hücrelerinin Geçiş Şişesi

(Bu protokol özellikle transwells üzerinde yetişen epitel bariyerlerinin üretimi için akciğer epitel hücre hattı H292'nin işlenmesini açıklar. Diğer epitel hücre hatları hafif değişikliklerle kullanılabilir.)

1. RPMI 1640'a %10 ısı inaktive Fetal Sığır Serumu (HI-FBS) ve 1x Penisilin/Streptomisin ekleyerek kültür ortamını hazırlayın.
2. Sıcak ortam, trypsin-EDTA (T-EDTA) ve D-PBS 37 ºC su banyosunda.
3. Hücre içeren T-75 şişesini inkübatörden çıkarın ve ters mikroskopla birleştiği görsel olarak değerlendirin. Not: H292 hücrelerini kullanırken, şişeler yakın veya tamamen bir arada olmalıdır.
4. Mataradan ortam aspire edin. Kaputta kapak gevşetilmiş bir sonraki çözeltiye sahip olarak hücrelerin kuruduğu süreyi azaltın.
5. T-75 şişesine 5 ml D-PBS ekleyin ve döndürün. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. PBS'yi aspirasyonla kaldırın.
6. T-75 şişesine 3 ml T-EDTA ekleyin ve altını örtmek için döndürün.
7. T-EDTA'nın çoğunu çıkarın, T-75 şişesinde yaklaşık 0,3 ml bırakın.
8. Kalan küçük T-EDTA hacmini hücrelerin yüzey alanına dağıtın ve standart kültür koşullarında nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin (37 ºC, %5 CO_2).
9. Bir süre sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın. Not: Hücreler, yan tarafındaki şişeye hafifçe dokunarak şişenin yüzeyinden kolayca ayrılmalıdır. Hücreler artık mikroskop altında görselleştirildiğinde yuvarlanmalı ve yüzmelidir. Bunun H292 hücreleri için alacağı ortalama süre 5-10 dk'dır.
10. T-EDTA'yı nötralize etmek ve hücreleri yeniden çıkarmak için şişeye 10 ml kültür ortamı ekleyin. Hücre çözeltisini pipet ucuna çekin ve tüm hücreleri yeniden canlandırmak için yaklaşık beş kez hücre içeren şişenin yüzeyine dışarı fırlatın.
11. Yeniden depolanmış hücreleri transwelllerin tohumlama için 15 ml'lik bir tüpe aktarın. Not: Bu şekilde hazırlanan yeniden sulanan H292 hücrelerinin konsantrasyonu yaklaşık 1 x 10^{6 -1,8}x 10⁶ hücre/ml arasında değişmelidir.

3. Epitel Hücreli Kollajen Kaplı Transwells Tohumlama

1. Her ters kollajen kaplı transwell'e 15 ml'lik tüpten 70 μl resüspended hücre çözeltisi ekleyin. Not: Konsantrasyon aralığı 1 x 10⁶-1.8 x 10⁶ hücre/ml arasında olan H292 hücre çözümleri yaklaşık 70.000-120.000 hücre/transwell verecektir.
2. Transwellleri tohumlarken hücrelerin 15 ml'lik tüpün dibine yerleşmesini önlemek için tüpü periyodik olarak nazikçe ters çevirerek hücre süspansiyonu karıştırın. Not: Hücreleri girdap etmeyin ve pipet ucunun kollajen kaplı membran filtresi ile doğrudan temas etmediğine dikkat edin.
3. Tüm ters transwell'ler epitel hücreleri ile tohumlandıktan sonra, Petri kabı kapağını değiştirin ve doku kültürü inkübatörüne dikkatlice yerleştirin, nemlendirilmiş, 37 ºC, % 5 CO₂. Kollajen kaplı filtre zarına eklenen hücre süspansiyonunu bozmamaya özen göster.
4. Doku kültürü inkübatöründe ters transwells, nemlendirilmiş, 37 ºC, 5% CO₂ gece boyunca koruyun. Not: Hücre içeren sıvı kabarcığı, gece kuluçka süresi boyunca transwell'in geçirgen filtre zarı ile ilişkili kalmalıdır. Filtre zarı sıvının buharlaşması veya sıvının transwells tarafından damlaması nedeniyle kurursa, epitel katmanları düzgün büyümeyebilir.
5. Ertesi gün, orijinal steril 24 kuyu plakasına 1 ml ortam ekleyin ve sterilize edilmiş bir hemostat kullanarak her ters transwell'i 1 ml ortam içeren her kuyuya çevirin.
6. Her transwell'in üst odasına 0,2 ml ortam ekleyin ve doku kültürü inkübatörüne, nemlendirilmiş, 37   ºC, % 5 CO_2'yedönün.
7. H292 ters transwells tohumlamadan sonra 8 günden 1 aya kadar kullanılabilir. Not: Epitel monolayerlerin tamamen oluştuğundan ve işlevsel bir bariyer gösterdiğinden emin olmak için transwelllerin tohumlanılmasından sonra en az 8 gün beklemeyi öneririz. Tek katmanlının, bazolateral yüzeye ek olarak protein at turpu peroksidazının (HRP) trans-epitel akısını kısıtlayıp kısıtlayamayacağı belirlenerek H292 epitel bariyerini test^{edebilirsiniz 18}.

4. Transwells Üzerinde Epitel Tabakalarının Enfeksiyonuna Karşı Bakterilerin Hazırlanması

1. Deneyden bir gün önce, Pseudomonas Isolation Agar plakasından bir P. aeruginosa PAO1 kolonisi ve Bir Luria-Bertani (LB) Agar plakasından bir K12 E. coli MC1000 kolonisi çıkarın ve 3 ml LB suyu içeren ayrı tüplere yerleştirin. DİkKAT: P. aeruginosa bir insan patojenidir, bu organizmayı kullanırken standart BSL2 güvenlik önlemleri alınmalıdır.
2. 37 ºC'lik bir ortamda 225 rpm'de bir gecede çalkalayın.
3. Ertesi gün, yoğun bakteri kültürlerinden 1 ml çıkarın ve 1,5 ml Eppendorf tüplerine yerleştirin.
4. 5 dakika boyunca 15.800 x g'da mikro yakıtta döndürün ve ardından süpernatantı çıkarın.
5. Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi'ne kalsiyum ve magnezyum (HBSS+) ile önceden hazırlayın. 9,5 L damıtılmış suya 23,8 g HEPES ve 97,5 g HBSS+ toz ekleyin. Çözeltiye küçük miktarlarda 10 M NaOH eklerken, pH'ı 7,4'lük kararlı bir pH'a ulaşılana kadar izlemek. Ses seviyesini 10 L'ye kadar getirin ve 4 ºC'de saklayın.
6. Her bakteri peletlerini 1 ml HBSS+ ile yeniden sürtün. Vortex, bakteriyel bir süspansiyon elde edildiğinden emin olmak için.
7. 5 dakika boyunca 15.800 x g'da tekrar döndürün ve süpernatant çıkarın.
8. PAO1 peletini 0,6 ml HBSS+ ve MC1000 peletini 0,5 ml HBSS+ ile yeniden satın. Bakteri süspansiyonlarını girdap.
9. PAO1 ve MC1000 resuspended peletleri HBSS+ içinde 1:100 daha fazla seyreltin. Örneğin, 0,6 ml PAO1 yeniden sulanmış peletten 50 μl'yi 5 ml HBSS+'a ekleyin. Not: Kültür yoğunluğunu belirlemek için optik yoğunluk (OD) ölçümlerinin yanı sıra standart koloni şekillendirme ünitesi (CFU) seyreltme kaplama metodolojisi, PAO1 ve BU şekilde hazırlanan MC1000 çözeltilerinin kullanılması, 3 x 10^{7 -6}x 10⁷ CFU/ml arasında tutarlı bir şekilde verim sağlar. Bakteri kültürünün yoğunluğu, kültürün 600 nm'deki OD ölçümü ile pozitif olarak ilişkilidir ve bu korelasyon bakteri hücre konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilir. Bakteri hücresi konsantrasyonu doğrulamak için, kültür çok düşük bir tahmini konsantrasyona seyreltilebilir ve tabakta 30-200 bakteri hücresinin bulunmasını bekleyecek şekilde bir agar plakasına kaplanabilir. Hücreler plakaya yayılır ve bir gecede 37 ºC'de inkübe edilir, böyle şekilde her hücre görünür olabilecek kadar büyük tek bir hücre kolonisi oluşturur ve koloniler daha sonra sayılabilir.

5. Nötrofillerin Tam Kandan İzolasyonu

1. Asit sitrat dekstroz çözeltisi (ACD) antikoagülan olarak kullanılır ve 6.9 g sitrik asit, 12.5 g sodyum sitrat ve 500 ml damıtılmış suya 10 g dekstroz eklenerek hazırlanır. Tüm bileşenler çözüldükten sonra, ACD çözeltisi 0,2 μm filtre ünitesinden geçirilerek sterilize edilir. ACD çözümünü 4 ºC'de saklayın.
2. Kan çekmeden önce, 50 ml şırıngaya 5 ml ACD ekleyin ve 12 tüplü 21 x 3/4 G kelebek iğnesi takın.
3. Turnike uygulayın, damarı alkolle silin ve iğneyi yerleştirin. Not: İnsan deneklerle ilgili her türlü araştırma protokolü kurumsal bir inceleme kurulu tarafından onaylanmalı ve her kan bağışçısından yazılı bilgilendirilmiş onay verilmelidir. Örneğin, bu protokol kullanılarak yapılan deneyler Massachusetts General Hospital Institutional Review Board tarafından onaylandı ve #1999-P-007782 protokolü atandı.
4. Kanın şırınnada bir kez ACD ile karışmasını sağlamak için yavaşça 45 ml kan alın.
5. 45 ml çekildiğinde (toplam hacim 50 ml), iğneyi çıkarmadan önce turnikeyi çözün. İğne çıkarıldığında steril gazlı bezle yaraya hemen basınç uygulayın.
6. Kanı yaklaşık 5-10 saniye boyunca 50 ml'lik bir tüpün kenarından yavaşça aktarın.
7. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca fren devre dışı bırakılarak 1.000 x g'da santrifüjde döndürün. Not: PBS'de tam kanın seyreltilmesini içeren ek bir adım- ve santrifüjlemeden önce seyreltilmiş kanın Ficoll-Paque'ye dikkatli bir şekilde kaplanması, buffy coat'u granülositlerden daha verimli bir şekilde ayırarak biraz daha yüksek bir nötrofil saflığı elde etmek için kullanılabilir⁸. Bu adımı atlamak, bu tahlil amaçları için verimi veya saflığı büyük ölçüde etkilemeden zaman kazanmak için hizmet eder ve bu nedenle kan kaplamasını Ficoll-Paque adımına dahil etmemeyi tercih ederiz.
8. Kan dönerken, % 2 jelatin çözeltisi hazırlamak için 50 ml ısıtılmış Hanks'in Kalsiyum ve magnezyum (HBSS(-)) olmadan Dengeli Tuz Çözeltisine çok yavaş bir şekilde 1 g jelatin ekleyin. Çözeltiyi 37 ºC'de tutun.
9. Sigmacote ile tedavi edilmiş bir cam pipet ucu kullanarak 50 ml'lik kan tüpünden plazmayı aspire edin ve atın.
10. Lenfositler de dahil olmak üzere beyaz kan hücreleri içeren buffy coat'u çıkarmak için çok dikkatli bir şekilde aspirasyon yapmaya devam edin.
11. Buffy kat yavaşça çıkarıldığından, kırmızı kan hücresi (RBC) tabakasının üzerindeki beyazımsı sarı bulutlu malzeme kaybolacaktır. Buffy coat çıkarıldıktan sonra aspirasyonu durdurun ve TÜPÜn üstünden görüntülerken RBC tabakası net bir şekilde görselleştirilebilir.
12. Çoğunlukla nötrofiller olan granülositler RBC katmanının yüzeyine yakın olduğu, ancak görünmediği için RBC katmanını rahatsız etmemeye çalışın.
13. 15 ml RBC katmanı hacmine 30 ml sıcak% 2 jelatin çözeltisi (RBC katmanının 2x hacmi) ekleyin.
14. Kabarcık oluşumunu en aza indirmeye dikkat ederek tüpü karıştırmak için hafifçe ters çevirin.
15.  25 dakika boyunca 37 ºC'de kuluçkaya yatın. Not: RBC'ler toplanmalı ve dibe yerleşmelidir. Jelatin alternatif olarak, RBC'leri yatıştırmak için büyük moleküler ağırlıklı dekstrans kullanılabilir⁸.
16. İnkübasyondan sonra, granülosit içeren üst katman açık kırmızımsı çözeltiyi pipetli yeni bir 50 ml'lik bir tüpe aktarın, transfer sırasında yerleşik koyu RBC tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin. Ayrıldıktan sonra koyu RBC katmanlarını atın.
17. Spin, granülositler ve bazı RBC'leri santrifüjde 1.000 x g'da içeren hafif kırmızımsı çözeltiyi aktardı ve hücre peletlemek için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fren etkinleştirildi.
18. Santrifüjlemeden sonra oluşacak kırmızımsı hücre peletı genellikle gevşek olduğundan, süpernatantı dikkatlice dökün veya aspire edin.
19. RBC lizis tamponunu önceden hazırlayın ve bir beherde 1 L damıtılmış suya 8,29 g amonyum klorür (NH₄Cl), 1 g sodyum bikarbonat (NaHCO₃₎ve 0,038 g EDTA ekleyerek 4 ºC'de saklayın. RBC lizis tamponu 4 ºC'de saklayın.
20. Kırmızımsı hücre peletini küçük hacimli soğuk RBC liziz tamponu ile yeniden depolayıp parçala. Hücre pelezi çözeltiye girdikten sonra, tüpü RBC liziz tamponu ile 50 ml'ye doldurun. Not: Bu noktada ve ileriye doğru, hücreleri buzda veya 4 ºC'de tutun.
21. 4 ºC'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjde   döndürün ve ardından üsttantı dökün veya aspire edin. Not: Süpernatant, lised RBC'ler içeren biraz kırmızımsı olacaktır. Pelet bu noktada sarımsı beyaz olmalıdır. Kırmızımsı bir peletle belirtildiği gibi pelette önemli RBC'ler kalırsa, 5.20-5.21 adımı tekrarlanabilir. 5.20. adımdaki kırmızımsı pelet yeterince parçalmazsa, önemli RBI'lar hücre peletinde kalır.
22. Az miktarda HBSS(-) ile beyazımsı peletin yeniden sunultup parçalanması ve ardından tüpü HBSS(-) ile 50 ml'ye doldurması. Not: Beyazımsı hücre peletini yeniden çıkarmak için HBSS(-) değil HBSS+ kullanılmalıdır. HBSS(-) kalsiyum ve magnezyumdan yoksundur.
23. 4 ºC'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjde tekrar   döndürün.
24. Süpernatant dökün ve peletin son hacmi olan 1 ml HBSS(-) seviyesine yeniden yansıtın.
25. 1,5 ml Eppendorf tüpüne 250 μl HBSS(-) için 1 ml hücre süspansiyonunun 5 μl'lik kısmını ekleyin ve pipetle hafifçe yukarı ve aşağı karıştırın.
26. 25 μl μl%0,4 Trypan mavisine 25 μl seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.
27. Standart hemositometrenin her iki tarafına 12 μl karışım ekleyin.
28. Trypan mavi boyasını dışlayan ve hemositometrenin her iki tarafının orta karesinde bulunan canlı hücrelerin sayısını sayın.
29. Hücre konsantrasyonunu hesaplamak için, 2 karenin ortalamasını 100 (seyreltici faktör) ile çarpın ve ardından hücre / ml sayısını vermek için^{10 4} ile çarpın.
30. Son konsantrasyonu 5 x 10⁷ hücre/ml'ye ayarlayın. 5 x 10⁷ hücre/ml'den büyükse HBSS(-) ekleyerek ayarlayın. Daha azsa, hücreleri peletin ve uygun hacme yeniden biriktirin.
31. Göç teste hazır olana kadar hücreleri buzda tutun. Not: Bu hücreler beyaz kan hücrelerinin granülosit popülasyonu temsil eder. Tüm insan kanından izole edilen granülositlerin çoğu nötrofillerdir. Hücreler, hücreleri sessiz bir durumda tutmak için geçiş testine ek olarak HBSS(-) içinde asılı buz üzerinde tutulur.

6. Göç Tahliline Epitel Hücre Katmanlarının Hazırlanması

(Bu adımların steril bir başlık içinde yapılması gerekmez.)

1. En az sekiz gün boyunca transwell filtre membranlarının alt tarafında kültürlenmiş epitel katmanlarını destekleyen inkübatör 24 kuyu plakasından çıkarın.
2. Her transwell'in kenarını bir hemostatla kavrayın, 24 kuyu plakasından çıkarın ve transwell'in iç odasından kültür medyasını atmak için transwell'i bir atık kovasının üzerine ters çevirin. Transwell'in iç haznesini HBSS+ ile doldurmak için her transwell'i HBSS+ içeren bir yıkama kabına batırın. sıvıyı iç odadan bir atık kovasına atın.
3. HBSS+'da ikinci bir yıkama için 6.2 adımlarını yineleyin. İki yıkamadan sonra, transwells'i her kuyuya 1 ml HBSS+ içeren yeni bir 24 kuyu plakasına yerleştirin. Not: Tüm yıkamalar 37 ºC'ye ısıtılan HBSS+ ile yapılmalıdır.
4. Epitel hücre tabakası bütünlüğünü değerlendirmek için her transwell'in üst odasını gözlemleyin. Not: HBSS+, 1 ml HBSS+ içeren 24 kuyulu bir plakanın kuyusuna yerleştirildiğinde transwell'in üst odasına sızmamalı ve doldurmamalıdır.
5. Her transwell'i dikkatlice gözlemledikten sonra, üst odaya 0,2 ml HBSS + ekleyin.
6.  Epitel hücre katmanlarını aşındırmak için 30-60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odaya 37 ºC,% 5 CO_2'de inkübatöre yerleştirin.

7. Nötrofil Trans-epitel Göç Tahlil

1. HBSS+ ile dengelenen 24 kuyulu yıkanmış transwells inkübatörden çıkarın.
2. Her transwell'i bir hemostatla kavrayin ve üstteki sıvıyı bir atık kovasına atın.
3. Her bir transwell'i 150 mm x 25 mm Petri kabına baş aşağı yerleştirin.
4. Ters Transwell'lerin altısına 25 μl HBSS+ ekleyin. Ters transwells üç, adım 4 açıklandığı gibi hazırlanan HBSS + seyreltilmiş 25 μl P. aeruginosa (PAO1) ile enfekte. Son üç ters transwells için, adım 4'te açıklandığı gibi hazırlanan HBSS+ ile seyreltilmiş 25 μl E. coli K12 (MC1000) ile enfekte edin. Bu, her bakteri türü için yaklaşık 0,8 x^{10 6}-1,5 x^{10 6} CTU/epitel tabakasıdır, çünkü 4. adımda hazırlanan bakteriyel çözeltilerin konsantrasyonu yaklaşık 3 x 10⁷-6 x 10 7 CFU/ml'dir.
5. 37 ºC'de kuluçkaya   yatır, 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada% 5 CO_2.
6. 5 ml HBSS+'a 5 μl 10 mM fMLP stok ekleyerek 10 μM çözelti vererek fMLP'yi nötrofil geçişi için pozitif bir kontrol olarak hazırlayın.
7. Bir hemostatla kavrayarak ve alt odalarda 1 ml HBSS+ içeren 24 kuyulu bir yıkama plakasına geri dönerek transwells yıkayın. Üst bölmelere 0,2 ml HBSS+ ekleyin.
8. Transwell'i bir hemostatla kavrayın ve ilk yıkama plakasından çıkarın. Transwellleri 1 ml HBSS+ içeren ikinci bir 24 kuyu yıkama plakasına yerleştirmeden önce, sıvıyı üst hazneden bir atık kovasına atın. Üst odaya 0,2 ml HBSS+ ekleyin.
9. Toplam 3 yıkama için 7.8 adımlarını bir kez daha tekrarlayın. Not: Test edilen tüm transwelllerin aynı şekilde manipüle edildiğinden emin olmak için, bakterilerle enfekte olup olmadıklarına bakılmak bakılmakla birlikte, tüm transwelller aynı elleçleme ve yıkama rejimine tabi tutulmalıdır. PAO1 veya MC1000 ile 60 dakikalık bir enfeksiyon, sırasıyla^18,22olan laktat dehidrogenaz bazlı toksikoloji test ve HRP akı tahlilleri tarafından değerlendirilen H292 monolayerinin bariyer özelliklerini azaltmaz veya değiştirmez.
10. 24 kuyu plakasının 12 kuyusuna 1 ml HBSS+ ekleyerek 24 kuyulu göç plakası hazırlayın. Not: Bu plaka önceden hazırlanabilir.
11. Üçüncü yıkamadan sonra, transwells üst odalarından sıvıyı bir hemostat kullanarak bir atık kovasına atın ve enfekte olmayan transwelllerden üçünü, negatif kontrolü temsil eden 1 ml HBSS+ içeren 24 kuyulu göç plakasının üç kuyusuna yerleştirin.
12. Pipet 1 ml HBSS+ (100 nM) içeren 24 kuyulu göç plakasının üç kuyusunun her birine 10 μM fMLP çözeltisi.
13. Enfekte olmayan transwelllerden üçünü, izole nötrofillerin göç etme yeteneği için olumlu bir kontrolü temsil eden 100 nM fMLP içeren 24 kuyulu göç plakasının üç kuyusuna yerleştirin.
14. PAO1 ile enfekte olmuş üç transwell ve MC1000 ile enfekte olmuş üç transwell'i, 1 ml HBSS+ içeren 24 kuyulu göç plakasının her biri sırasıyla üç kuyuya yerleştirin. Her transwell'in üst odasına 0,1 ml HBSS+ ekleyin.
15. Her transwelldeki 0,1 ml HBSS+'ın üzerine, 5. Not: Bu yaklaşık 1 x 10⁶ nötrofil/transwell'i temsil eder.
16. Nötrofillerin trans-epitel geçişine izin vermek için₂ saat boyunca nemlendirilmiş bir odada 37 ºC,% 5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
17. 2 saat sonra göç eden nötrofil sayısını belirlemek için standart bir eğri hazırlayın. 2 ml HBSS(+) içine 40 μl nötrofil süspansiyonu⁽⁵ x 10 7 hücre/ml) ekleyin ve 1 ml'yi 1 ml HBSS(+)'a aktarın ve yaklaşık 2.000 hücre/ml ila 1 x 10⁶ hücre/ml arasında değişen toplam 10 standart için sekiz kez seri 2 kat seyreltme gerçekleştirin. Boş için 1 ml HBSS(+) ekleyin.
18. 2 saatlik göçten sonra, bir hemostat ile kavrayarak transwellleri kaldırın ve 24 kuyu göç plakasının iç duvarlarına hafifçe dokunun. Transwells atın.
19. 10X hedefini kullanarak ters bir mikroskop altında 24 kuyu göç plakasının kuyularını görüntüleyerek kuyulardaki nötrofillerin göçünü büyük ölçüde değerlendirin (her koşulda göç eden nötrofillerin görüntüleri için Bkz. Şekil 1).
20. 24 kuyulu geçiş plakasında iyi kullanılan her birine, her standartta ve boşta 50 μl% 10 triton X-100 ekleyin.
21. 24 kuyu geçiş plakasını, standartlarını ve boşlarını düşük hızda 4 ºC'de 20 dakika   döndürün.
22. Önceden 1 M sitrat tampon hazırlayın. Bir behere 400 ml damıtılmış suya 52,5 g sitrik asit ve 73,5 g sodyum sitrat ekleyin. pH'ı 4.2'ye getirin. 500 ml'lik nihai çözelti için damıtılmış su ekleyin. Çözeltiyi 4 ºC'de saklayın.
23. ABTS substrat çözeltisi o gün taze hazırlayın. 45 ml damıtılmış suya 3 ABTS tablet (her biri 10 mg) ve 5 ml 1 M sitrat tampon ekleyin. Tabletlerin çözelti içinde tamamen çözülmesine izin verin. ABTS substrat çözeltisi ihtiyaç duyulana kadar 50 μl%30 hidrojen peroksit ilavesi (bkz. adım 7.27).
24. 24 kuyu geçiş plakasında iyi kullanılan her birine, her standartta ve boşta 50 μl sitrat tamponu ekleyin.
25. Her numunenin 100 μl'lik kısmını 96 kuyu plakasına kopya olarak aktarın. Not: 96 kuyu plakasına geçmeden önce her numunedeki içeriği iyice karıştırmak çok önemlidir. Pipet çözeltisi transferden önce en az beş kez yukarı ve aşağı.
26. Her standartın 100 μl'sini ve karıştırmadan sonra boşluğu 96 kuyu plakasına aktarın (yinelenende boş).
27. ABTS çözeltisine ve girdabına 50 μl% 30 hidrojen peroksit ekleyin.
28. 96 kuyu plakasındaki her numuneye 100 μl ABTS substrat çözeltisi ekleyin.
29. Plakanın karanlıkta 5-10 dakika gelişmesine izin verin. Not: Belirli kuyularda, her kuyuda bulunan nötrofil sayısıyla ilişkili yeşil bir renk gelişmelidir.
30. Mikro plaka okuyucu kullanarak 405 nm dalga boyunda okuyun.
31. Standart olarak hazırlanan bilinen nötrofil sayıları ile 405 nm'de optik yoğunlukla ölçülen peroksidaz aktivitesi miktarı arasında doğrusal pozitif korelasyonun bulunduğu standartları kullanarak epitel tabakası boyunca göç eden nötrofillerin sayısını hesaplayın (Bkz. Temsili veriler için Şekil 2 ve 3). Not: Bu nötrofil nicelleştirme yöntemi, miyeoperoksidaz ekspresyosu nedeniyle nötrofiller tarafından sergilenen çok miktarda peroksidaz aktivitesinden yararlanır. Nötrofilleri ölçmek için radyoaktivite veya floresan bileşikleri ile ön etiketleme nötrofillerini içeren yöntemler gibi alternatif yaklaşımlar düşünülebilir.

Çeşitli çalışmalar patojenle enfekte epitel katmanlarının nötrofil trans-epitel göçlerini kolaylaştırdığını göstermiştir3,8,19,24-28,31,32. Bu, epitel hücre türevi nötrofil kemotektik gradyanın patojene özgü indüksiyonu ile meydana gelir3,23. Örneğin, akciğer epitel hücrelerinin apikal yüzeyi ile etkileşime giren patojenik P. aeruginosa, epitel tabakası boyunca önemli sayıda nötrofilin göç etmesine neden olur18,22,25,26,33,34. Bu klinik olarak ilgili tahlil sistemi, uygun kontrollerle eşleştirildiğinde anahtar patojeni ortaya çıkarmak ve moleküler katkıda bulunanları barındırmak için çeşitli şekillerde manipüle edilebilir.

Önceden enfekte edilmemiş polarize epitel hücre katmanlarına eklenen nötrofiller, kayda değer sayılarda geçiş yapamadı. Bununla birlikte, enfekte olmayan bir epitel tabakası boyunca kemoterapi çekici bir gradyanın uygulanması, önemli sayıda nötrofili karşıya sürükleyecektir. Patojen bulaşmış epitel katmanları arasında nötrofil göçü araştırılırken her testte sırasıyla bu negatif ve pozitif kontrolleri dahil etmek önemlidir. Negatif kontrol, sinyalin yokluğunda epitel tabakasını geçen nötrofillerin arka plan numarasını oluşturur. Kültürlü epitel hücreleri fonksiyonel bir bariyer oluşturduğunda bu sayı çok düşük olmalıdır. Yüksek arka plan göçü patojen ile enfekte epitel ile elde edilen sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Pozitif kontrol, epitel tabakası boyunca fMLP gibi bir nötrofil kemoterapi çekicisinin gradyanının uygulanmasını içerir ve izole edilmiş nötrofillerin işlevsel olduğunu doğrulamaya yarar. Ayrıca, epitel katmanlarının patojen kaynaklı trans-epitel göçü üzerindeki etkilerini değerlendirmek için belirli reaktiflerle ön işlemden geçirildiği durumlarda, fMLP gradyanı, reaktifin patojen aracılı etkilerden bağımsız olarak epitel tabakasında gezinme yeteneği üzerinde sahip olabileceği etkileri kontrol etmeye yarar. Bu tahlil sisteminde sıklıkla kullanılan ek bir kontrol, epitel tabakalarının patojene paralel olarak nonpathojenik bakterilerle enfeksiyonunu içerir. Bu kontrol, bakterilerle etkileşimi takiben ilgili epitel yanıtlarını ayırt etmek ve nötrofil trans-epitel göçünü uyarmak için gerekli patojenik faktörlerin tanımlanmasına yardımcı olmak için kullanılabilir.

Nötrofil trans-epitel göçü hem nitel hem de nicel olarak değerlendirilebilir. Nötrofillerin bazolateral yüzeye eklenmesinin ardından 2 saatlik inkübasyonun tamamlanmasıyla transwells çıkarılır ve epitel tabakası boyunca tamamen apikal odaya göç etmiş nötrofiller 24 kuyulu göç plakasının alt kuyusunda görülebilir. Her koşulun temsili bir görüntüsü Şekil 1'de görüntülenir, ters ışık mikroskobu kullanılarak görselleştirilir. Çok az sayıda nötrofilin, empoze edilmiş bir kemotektik gradyan (HBSS+) olmadan enfekte olmayan bir epitel tabakası boyunca göç ettiği ve testte arka plan seviyelerini temsil ettiği gözlenmiştir (Şekil 1A). Buna karşılık, bir fMLP gradyani sağlandığında transmigrated nötrofillerin bolluğu belirgindi (Şekil 1B). Epitelyumun nonpathojenik E. coli MC1000 ile enfeksiyonu, birkaç görünür transmigrated nötrofil ile sonuçlanırken, epitel katmanları akciğer patojenik P. aeruginosa (PAO1) ile enfekte olduğunda birçok transmigrated nötrofil gözlenebilirdi (Şekil 1C ve 1D).

Deneyde göç eden nötrofiller miyeoperoksidaz aktiviteleri ölçülerek ölçülür. Transmigrated nötrofil sayısının tahmin edilmesini sağlamak için standart bir eğri kullanılır. Nötrofillerin sayısı, standart eğri için seçilen nötrofil sayıları aralığında doğrusal bir ilişki sergileyen değerlerle nötrofillerin lizizini takiben ölçülen peroksidaz aktivitesi miktarı ile pozitif olarak ilişkilidir (2 x 103-1 x 106 hücre/ml) (Şekil 2). Nötrofillerin önemli bir kısmı, sağlanan bir fMLP gradyanine yanıt olarak veya PAO1 ile enfekte olmuş bir epitel tabakasına yanıt olarak epitel katmanları boyunca göç eder (Şekil 3). Uyaranların yokluğunda (HBSS+) veya nonpathogenic E. coli MC1000 ile apikal epitel enfeksiyonunu takiben göç eden nötrofillerin sayısı test için tespit sınırının altındadır (Şekil 3). Şekil 3'te sunulan veriler, üç bağımsız kuyunun / koşulun standart sapmasıyla ortalama transmigranlı nötrofil sayısını temsil eder. Şekil 3'te gösterilen nicel veriler Şekil 1'degörüntülenen temsili kuyu görüntüleriyle tutarlıdır.

Şekil 1. Trans-epitel göçünden sonra nötrofillerin görüntüsü. Görüntüler, üst kuyuya eklenen nötrofillerle (bazolateral oda) 2 saatlik inkübasyon dönemini takiben 24 kuyulu göç plakasının alt kuyusunun (apikal oda) 10X büyütmesinde ters ışık mikroskobu ile izlendi. (A) Negatif kontrol HBSS+. (B) Pozitif kontrol uygulanan fMLP kemotaktik gradyan. (C) Nonpathogenic E. coli K12 (MC1000) ile enfekte epitel hücre katmanları. (D) Patojenik P. aeruginosa (PAO1) ile enfekte epitel hücre katmanları. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 2. 1 x 106 başlangıç konsantrasyonudaki nötrofiller dokuz 2 kat seyreltmeye maruz kaldı. Lizis sonrasında peroksidaz aktivitesi miktarı belirlendi ve nötrofil sayısı x ekseninde peroksidaz aktivitesi ile y ekseninde grafiklendi. Tasvir edilen denklem, her kuyuda ölçülen peroksidaz aktivitesi miktarına bağlı olarak transmidrasyondan sonraki her kuyuda bulunan nötrofil sayısını belirlemek için kullanılabilir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 3. Transmigrated nötrofillerin nicelemesi. Transmigrated nötrofillerin sayısı, bilinen nötrofil sayılarının doğrusal standart eğrisine göreli miyeoperoksidaz aktivitesi ile ölçülür. Patojenik P. aeruginosa (PAO1) ile epitel hücre enfeksiyonu veya nötrofil kemo-çekici fMLP'nin bazolateral gradyanının apikal olarak kurulmasını takiben önemli sayıda transmigrated nötrofil gözlendi. Nonpathojenik E. coli K12 (MC1000) tedavisi veya sadece negatif kontrol tamponu (HBSS+) ile epitel hücre enfeksiyonu sonrasında saptanamayan sayıda transmigrated nötrofil gözlendi. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.