Eksplantasyon Kültüründe Diş mikropların Geliştirme takiben için Dilim Kültür Yöntemi

Özet

Burada detay doku helikopter kullanarak mandibul dilimler kültür diş mikroplar için bir yöntemi biz. Bu yöntem, daha geleneksel kültürü yöntemleri kullanılarak mevcut manipülasyon ve soy izleme, değil mükemmel bir fırsat sağlayarak, gelişimi sırasında dişe eşsiz erişim sağlar.

Özet

Eksplant kültür belirli zaman noktalarında organ geliştirmeyi ve manipülasyon, bu nedenle gelişimsel biyolog için önemli bir yöntemdir sağlar. Birçok organ için bu ex vivo kültür sırasında izleme sağlamak için gelişmekte olan doku ulaşmak zordur. Dilim kültür yöntemi sağlar dokusu erişim böylece morfogenetik hareketleri takip edilebilir ve belirli bir hücre popülasyonları manipülasyon veya soy izleme için hedef olabilir.

Bu yazıda tür bir dizi diş mikrop kültürü için çok başarılı olmuştur dilim kültürü için bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, diğer çene dokular tarafından çevrili in vivo gözlenene benzer bir oranda, en geliştirmek diş mikrop, mükemmel erişim sağlar. Bu, diş ve çevreleyen doku arasında doku etkileşimleri takip edilmesine olanak sağlamaktadır. Bu kağıt mikropların diş üzerinde yoğunlaşmaktadır de, aynı protokolü bir dizi gelişme takip uygulanabilirBöyle tükürük bezleri, Meckel kıkırdağı, burun bezleri, dil ve kulak gibi diğer organlara,.

Giriş

Deneyler bir dizi için bu kültür dokusu ex vivo gelişimini takip edebilmek için önemlidir. Doku geliştirme Kültür gelişiminin tanımlanmış dönemlerinde erişim sağlayan ve kültür ortamına faktörlerin eklenmesiyle genlerin manipülasyon ya da yüklü boncuklar üzerine ve transfeksiyon ve elektroporasyon ¹ kullanılmasıyla sağlar. Birçok deneyleri için o büyüdükçe doku morfolojilerinden maruz soy olarak etiketlenmiş hücrelerin kaderini takip etmek, örneğin, doku görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Bu embriyo bir doku bloğu kültürlenir zaman açık değildir derin embriyo içinde geliştirmek dokular, özellikle sorunlu olabilir. Onlar mandibula, maksilla ve frontal burun süreç içinde geliştirmek gibi Dişler, bu iyi örneklerdir. Bütün çene kültive edildiğinde sabit doku kesit sonra dişin yüzeysel yapıları izlenebilir ancak morfolojisindeki değişiklikler sadece analiz edilebilir 2. Biz, bize diş mikrop gelişimini takip etmesine ve geliştirme sırasında dişin farklı bölgelerine erişim sağlayan canlı bir dilim kültür tekniği adapte var. Değiştirilmiş Trowell Yöntem ³ kullanılarak, gaz-sıvı arayüzünde teknik kültürler diş mikrop dilimleri,. Bu dilim kültürler doğrudan dişin morfolojilerinden ardından ve bu emaye düğüm ve diş papilla ve folikül ^1,4-7 gibi farklı bileşenleri, soy izleme sağlayan çok yararlı olmuştur. Bu teknik, fare embriyoları ile sınırlı değildir ve başarılı bir domuz kültür canlı dilimleri ve yılan dental doku ^8,9 etmek için kullanılmıştır. Diş gelişimi görselleştirmek olmanın yararına ilave olarak, dilim yöntemi de doku ince dilim inkübatörden orta ve havadan besin erişim artmıştır avantajına sahiptir. Bu in vivo gelişme neticesinde diş mikrop, ve gösteri invas geliştirilmiş büyümesiyle sonuçlanırpapilla ⁷ içine endotel hücre iyon. Buna karşılık, bütün alt çene kültürlerde diş mikrop vivo olarak daha yavaş geliştirmek ve kültürün orta uzun süreli kültürlerde nekrotik genellikle. Dilim kültüründe, diş çene bir dilim içinde gelişir ve çevresindeki gelişen kemik ve diğer dokuları ile etkileşimi izlenebilir. Bizim yöntemde doku düz bir destek ortamında ^10,11 gömmek için gerek ve kesme blok için doku eklemek için herhangi bir sistem için gerek diseksiyon sonra doğranır. Yöntem birçok altçeneler tek oturumda kesitli izin veren, bu nedenle noninvaziv ve hızlıdır.

Protokol

1.. Kurma

1. (Mineral yağ ile yağlanmış bir bileme taşı kullanarak) diseksiyon aletleri keskinleştirmek ve% 70 etanol sprey ve kuru ısı sterilizasyonu organ kültürü kullanmadan önce sterilize edin. 12 V kaynağı kullanarak 2 M sodyum hidroksit elektroliz kullanarak diseksiyon iğneler keskinleştirmek.
2. Glutamax,% 1 ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Advanced Modified Eagle Medium F12 (F12 DMEM) 'den oluşan, embriyonik organların diseksiyon ve kültür için kullanılan kültür ortamı hazırlayın.

2. Embriyo Diseksiyon

1. Home Office ya da diğer yönetim kurulu tarafından onaylanan bir program bir yöntem kullanarak bir zamanlanmış evlendirdi hamile kadın itlaf. Alt karın çevresinde cilt uzak teşrih ve makas kullanılarak karın açmak kesti. Alt orta hatta birbirine bağlamak, iki rahim boynuzları, bulun.
2. Buz üzerinde orta ile dolu bir tüp içinde rahim ve yerde parçalara ayır. When, buz üzerinde, doku birkaç saat bırakılabilir.
3. Mikroskop altında ortam içinde bir Petri tabağına rahim ve yer çıkarın. Mümkün embriyo kontaminasyonu en aza indirmek için diseksiyon bir laminar akış başlığı içinde yapılmalıdır yerde.
4. Rahim embriyolar inceleyin ve onların Extraembryonic dokulardan onları serbest.
5. Bir tungsten iğne kullanılarak embriyolar başını kesmek ve ortam taze bir çanak içine kafaları aktarın.
6. Ağız boşluğu içine bir iğne koyarak kafaları çenenin izole ve başın arkasında (Şekil 1A ve 1B) doğru kesilmiştir. Doğrama için beklerken İzole çeneler geçici olarak buz üzerinde ortamda saklanabilir.
7. Bütün mandibula dilimleri için E11.5-E15.5 diş mikrop kültürü için idealdir aşamaları. E15.5 sonra mandibulada gelişen kemik doğrama için çok zor. Diş dilimleri hala yapılabilir, ancak kemik (dentary ve şekillendirme alveol kemiği) ilk olarak çıkarılması gerekir⁹ doğrama önce diseksiyonu. Tungsten iğneler ve forseps kullanılarak dikkatlice kemiği kaldırmak.

3. Embriyo Dilimleme

1. Standart bir tablo doku kıyıcı (Şekil 1C) kullanarak mandibul doku dilimleri hazırlayın. Yaklaşık 200 mandibulalarındaki sonra taze bir bıçak kullanın ve düştüğünde o montaj diski ile aynı hizada emin olun.
2. Montaj Diski temizleyin ve kullanımdan önce% 70 etanol ile bıçak. Makineyi kullanırken bıçak çok keskin olduğu gibi bakım, alınmalıdır.
3. Numunenin yaşına göre um 200-400 arasında bir kesme mesafede helikopteri ayarlayın ve bütün diş mikrop gerekli olup olmadığına bağlı. Maksimumda bıçak kuvvet ayarlayın.
4. Bir pipet veya forseps kullanarak plastik montaj diske bir çene aktarın. Yönelim hala net olduğundan emin diskin yapımı üzerine mandibulayı düzenleyin. Gelişmekte olan dil yönünü belirlemek için yararlı bir dönüm noktası olarak kullanılabilir. Molarlar kullanım af içinkesici dişler için bunlar (Şekil 2A'da doğrama uçak bakınız) büyüdükçe, bu dişlerin farklı yönüne göre çenenin üzerinden bir sajital dilim kullanırken Rontal / enine yönlendirme, (Şekil 1B doğrama uçak bakınız).
5. Biraz montaj diskte mandibulayı kurutmak için filtre kağıdı kullanılarak doku etrafında aşırı ortamı çıkarın.
6. Hemen kurutulduktan sonra, helikoptere dairesel paslanmaz çelik bir levha üzerine disk yerleştirin. Makineyi açın ve basın başlangıç. Bu tablo, aynı zamanda bıçak taşıyan kol doğrama yükseltilir ve / dk kadar 200 vuruş da düşmüştür soldan sağa doğru otomatik olarak geçmektedir.
7. Doku tamamen dilimlenmiş edildikten sonra makineyi kapatın. Bıçak kolu yükseltilmiş konumda olduğundan emin olun ve diski çıkarın. Bıçak kolunun altında parmaklarınızı yerleştirin veya doğrama zaman gözetimsiz makineyi bırakmayın.
8. Montaj diskini alın ve hemen orta t eklemeko sırayla disk üzerinde dilimler aşırı kurumasını önlemek için. Dikkatlice orta küçük bir Petri kabı (Şekil 2A) bir tungsten iğne ve daha sonra bir pipet kullanarak diskin altındaki doku dilimlenmiş çıkarmak.
9. Bir iğne kullanılarak dilim ayrı ve daha sonra bir stereo (Şekil 1D, 1E ve 2B) altında, ilgi konusu doku içeren doku dilimleri seçin. Ortam ile taze kültür tabaklarında seçilen dilimleri yerleştirin.

4. Dilim Kültür

1. , Su kaybını önlemek için, dış oyuğuna otoklavlanmış suyun yaklaşık 2 ml ilave etmek suretiyle ve çanak merkezinin bir metal ızgara konumlandırılmasıyla kültürü için hazır orta-gözenekli organ kültür kapları hazırlayın (Şekil 3A ve 3B).
2. Yaklaşık 4 cm paslanmaz çelik hasır levhalar 1,5 cm x şeritler keserek metal ızgaralar hazırlayın. Merkezinde bir delik yapmak ve bükmek için bir delik yumruk kullanınzikzaklı uç oluşturmak için taraf. Izgara çanak (Şekil 3A ve 3B) dibine paralel olarak uzanan merkezi oyuk boyunca düz oturmalıdır. Kullanmadan önce sterilize etmek ızgaraları otoklavlayın.
3. Saydam polietilen tereftalat bir parça ızgara deliği kaplayacak kadar geniş (PET) zan (gözenek boyutu 0.4 um) kesin. Seçilen dilim ile çanak içine kesilmiş membran yerleştirin.
4. Zarın üzerine dilim yerleştirin ve daha sonra dikkatli bir şekilde merkezinde yassı dilim ile ortam dışında membran kaldırın.
5. Merkezindeki dairesel delik boyunca ızgara üzerinde filtre yerleştirin ve zarın seviyesine kadar, iyi kültür ortamı, yaklaşık 1 ml.
6. Manipülasyonlar (örneğin, ⁸⁾ orta proteinler ya da küçük molekül inhibitörleri eklemek için.
7. Kültür 0. günde morfolojisinin bir rekor için dilim fotoğrafını.
8. % 5 CO nemli bir atmosferde bulaşıkları yerleştirin 2 ub.
9. Ortalama 7 gün boyunca düzenli aralıklarla kültürleri Fotoğraf. Kültür ortamı, her 48-72 saat değiştirin. Fotoğrafçılık için altında (Şekil 2C-E) bir ışık kaynağı ile dilimleri görmek.

5. Lineage İzleme

Soy izleme gerekli ise, bu tür DII veya dio gibi lipofilik boyalar aşama 4, dilim kültür önce diş mikrop içine enjekte edilebilir.

1. Bir iğne çektirmenin kullanarak cam kılcal iğneler çekin.
2. Forseps kullanılarak iğne ucu kırmak ve aşağı boya çözeltisi içine ucu ile. Boya kılcal hareket ile ucuna doldurur süre birkaç dakika bekletin.
3. Bir tutucu içine doldurulur iğne yerleştirin ve bir enjektör ya da ağız aspiratörüne boru yoluyla eklemek.
4. Etiketlenecek nedeniyle dilimin dokunmaktan kültür ortamı içinde iğne ucu yerleştirin. Iğne, bir dışarı boya küçük bir miktar yerinden hava basıncı uygulayındoku üzerine d.
5. İğneyi çıkarın ve floresan altında etiketleme için kontrol edin.
6. Başarıyla etiketli dilimleri filtrelerine aktarılmış ve aşama 4'te tarif edildiği gibi kültüre edilebilir.

Sonuçlar

İlk molar diş kökü hareketini takip etmek amacıyla, 250 um frontal kesitler, yukarıda tarif edilen yöntemi kullanılarak alt çeneye ile alınmıştır. Diş kökü, gelişmekte olan dişin dış emaye epitel (OEE) çevreleyen mezenşimin tabakası olan ve daha önce periodonsiyum ⁶ dokusu oluşumuna katılmak için gösterilmiştir. Altçeneler E14.5, diş gelişimi kapak aşamasında disseke edildi. Dilim ise diş epitelyumun anahat açıktı ve yoğuşmalı dental mezenşimin diş epitel (Şekil 4A) etrafında bir halka koyu o...

Tartışma

Diş kültürün Bu yöntem diş mikrop erişim avantajı doğru soy epiteli veya mezenşimin içinde izleme ve boncuk yerleştirme sağlayan, mükemmel vardır. Gelişmekte diş mikrop Tanımlı bölgeler dolayısıyla özellikle hedef alınabilir. Kültür sırasında diş mikrop değişen morfoloji takip edilebilir, ve manipülasyonlar etkisi hızlı bir şekilde değerlendirilmiştir.

Bu doğru kıyılmış olamaz gibi bir yöntem olup, bununla birlikte, bu tür dentin ve emaye gibi sert dokular, oluşmadan önce genç dişi mikroplar...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Etanol	VWR	101077Y	%100 etanol, damıtılmış H2O içinde %70'e seyreltildi.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Gelişmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penisilin-streptomisin	Sigma	P0781
DiI (Moleküler problar)	Vybrant	V-22885	Hücre etiketleme çözümü
	Invitrojen		Hücre izleyici CM-DiI, C-7000
DiO ( Moleküler problar)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Kuru ısı sterilizasyonu
McIlwain doku kıyıcı	Ted Pella, Inc.	10180	Standart tablo
Organ kültürü kabı (Merkez-Kuyu Organ Kültürü Çanağı)	Falcon	353037
Membranları (Hücre Kültürü Ekleri, 0.4 & mu; m gözenek boyutu)	BD Falcon	353090	PET rayla oyulmuş membran, 6 kuyucuklu format
Metal ızgaralar (Paslanmaz Çelik - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Doğrudan Isı CO2 İnkübatör	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Tek kanallı picospritzer III
Filamentli cam kılcal damar 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten tel 0,1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten tel 0,38 mm	Goodfellow	W005155
Aspiratör tüpleri	Sigma	A5177	Ağız aspirasyonu soy izleyicileri için kullanılır