Method Article

Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi

DOI:

10.3791/50825

⸱

December 15th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Stem Cell Research and Regenerative Medicine, Tulane University School of Medicine, 2Division of Regenerative Medicine, Tulane National Primate Research Center, 3Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine, 4Department of Pharmacology, Tulane University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm organ hücresizleştirme, rejeneratif tıp için kullanılabilecek doğal biyolojik iskeleler üretir. Tüm akciğerlerin hücrelerden arındırıldığı ve daha sonra vasküler dolaşımı ve sıvı ortam ventilasyonunu kolaylaştıran bir biyoreaktörde yetişkin kök hücreler ve endotel hücreleri ile tohumlandığı insan dışı bir primat akciğer rejenerasyonu modelinin tanımı sunulmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut ve gelecekteki organ nakli ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli sayıda akciğer bulunmamaktadır. Biyoyapay doku rejenerasyonu, klasik organ transplantasyonuna çekici bir alternatiftir. Bu teknoloji, bir organın doğal biyolojik hücre dışı matrisini (ECM), üzerine otolog veya kök/progenitör hücrelerin, orijinal dokunun yenilenmesini kolaylaştıracak şekilde tohumlanabileceği ve kültürlenebileceği bir iskele olarak kullanır. Doğal ECM, hücreden arındırma adı verilen bir süreçle izole edilir. Hücre giderme, ECM'yi olduğu gibi bırakırken hücresel materyalin etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamak için dokuların bir dizi deterjan, tuz ve enzim ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Kemirgen akciğerlerinin decellularizasyonu ve ardından reselüler hale getirilmesi kullanılarak yapılan çalışmalar, in vivo gaz alışverişi yapabilen pulmoner benzeri doku oluşturmada marjinal başarı göstermiştir. Temel kavram kanıtı sunarken, kemirgen modelleri doğrudan insan kullanımına çevrilemez. İnsan olmayan primatlar (NHP), nihai klinik kullanım için biyoyapay organ üretiminin kullanımını araştırmak için daha uygun bir model sunmaktadır.

NHP rhesus makakından elde edilen akciğerlerin tamamen hücreden arındırılmasını sağlamak için protokoller sunulmuştur. Elde edilen aselüler akciğerler, mezenkimal kök hücreler ve endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücrelerle tohumlanabilir. El yazması ayrıca, hücre tohumlu makak akciğerlerinin, negatif basınçlı ventilasyonun yanı sıra vaskülatür yoluyla pulsatil perfüzyon tarafından sağlanan mekanik gerilme ve gerilme koşulları altında kültürlenebildiği bir biyoreaktör sisteminin geliştirilmesini de açıklamaktadır; Bu kuvvetlerin sırasıyla pulmoner ve endotel soyları boyunca farklılaşmayı yönlendirdiği bilinmektedir. Hücresellikten arındırma ve hücre tohumlamanın temsili sonuçları sağlanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku ve organların biyomühendisliği, rejeneratif tıp alanına çekici bir katkıdır. Hastalıklı organların işlevselliğinin yerini almak için hastalara nakil için uygun olan "laboratuvarda yetiştirilen" organların oluşturulması, nakil ihtiyaçlarına yönelik mevcut ve gelecekteki talebi karşılamak için oldukça arzu edilir. Doku mühendisliğinin ilkeleri, istenen hücre tiplerinin veya bunların öncüllerinin, gelişimsel veya rejeneratif süreçleri taklit etmek için gerekli uygun büyüme faktörlerini ve kültür koşullarını sağlarken, tasarlanmış dokunun şeklini destekleyen bir iskeleye tohumlanması etrafında toplanır. Doku mühendisliği için sentetik iskeleler kullanılmış olsa da, d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tüm Organ Makak Akciğeri Hücresizleştirme

  1. Çözeltilerin Hazırlanması
    1. 1-2 L'lik şişelerde 10-15 L deiyonize su (dH2O) otoklavlayın.
    2. Manyetik bir karıştırıcı üzerinde karıştırırken 1 ml Triton X-100'ü 999 ml dH2O içinde karıştırarak "Triton çözeltisi" (dH2O'da% 0.1 Triton X-100) hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtre aparatından süzün. Oda sıcaklığında saklayın.
    3. Karıştırırken ~ 900 ml dH 2 O'ya yavaşça 20 g sodyum deoksikolat (SDC) ekleyerek "SDC çözeltisi" (dH2O'da% 2 SDC) hazırlayın. SDC çözündükten sonra, çözeltiyi dereceli bir silindire aktarın ve ha....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda gösterilen sonuçlar, hava yolu veya vasküler bölmelerin, daha önce tarif edildiği gibi izole edilmiş ve karakterize edilmiş, sırasıyla rhesus makak kemik iliği türevi mezenkimal kök hücreler veya rhesus akciğer kaynaklı mikrovasküler endotel hücreleri ile tohumlandığı ayrı deneyleri temsil etmektedir16-18.

Hücreden arındırma süreci boyunca, makak akciğerleri, sürecin sonunda yarı saydam bir görünümle sonuçlanan ilerleyici bir beyazlama gösterdi; bununla birlikte, akciğerler .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokular, fiziksel, kimyasal ve enzimatik ajanlar12,20 kullanan bir dizi yöntemle verimli ve etkili bir şekilde hücresizleştirilebilir. Büyük organlardan 3 boyutlu biyolojik matrisler üretmenin zorlukları arasında büyük hacimlerde hücresizleştirme çözümlerine, pahalı ticari ekipmanlara (yani biyoreaktörlere) ve nihai doku türevli ürünü elde etmek için gereken baş döndürücü miktarda metodolojik bozulmaya duyulan gereksinim yer alır. Yöntemimiz, fiziksel manipülasyonu, reaktif hacmini ve maliyeti en aza .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, önceki bir yayından görüntülerin bu raporda kullanılmasına izin verdikleri için Tissue Engineering editörlerine teşekkür etmek isterler.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sodyum nitroprussidSigma-Aldrich71778-25G
Heparin sodyum tuzuFisherBP2425
Triton X-100FisherBP151-100
Sodyum deoksikolatFisherBP349-100
Sodyum klorürFisher7647-14-5
Sığır pankreas DNazSigma-AldrichDN25Stok hazırlayın, alikot yapın ve dondurun
Magnezyum sülfatFisher10034-99-8
Kalsiyum klorürFisherC614-500
PBS (Ca/Mg yok)Gibco, Yaşam Teknolojileri10010-031
Antibiyotik-AntimikotikGibco Yaşam Teknolojileri15240062
Hücre Kültürü Ortamı
Alpha MEMGibco Yaşam Teknolojileri12561-072
Orta 199Gibco Yaşam Teknolojileri11150067
Premium Fetal Sığır SerumuAtlanta BiologicalsS11150
L-Glutamin 100xGibco Yaşam Teknolojileri25030-081
Endotel Hücre Büyüme Takviyesi (EKGS)ScienCell1052
Antibiyotik-AntimikotikGibco Life Technologies15240062
Hücre Tohumlama ve Biyoreaktör Kültürü
Çek valfleriCole-ParmerEW-98553-20
Y-konektörlerCole-ParmerED-30614-08
3 musluklarHarvard Aparatı721664
MasterFlex L/S 14 boruCole-Parmer96420-14
MasterFlex L/S 16 boruCole-Parmer96420-16
Erkek kilit Luer 1/8 inCole-ParmerEW-45505-04
Dişi Luer 1/8 inCole-ParmerSI-45502-04
Erkek Luer kilit fişiCole-ParmerEW-45505-56
Enjeksiyon portlarıMedi-Dose EPSIV2004
Lateks boruSt. Louis Medical SuppyHN10910
Hortum kelepçesiCole-ParmerEW-06832-02
2 L Geniş ağızlı kavanozFisher05-719-276
60 ml ŞırıngaFisherNC9035364

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  2. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nonhuman Primate LungLung DecellularizationBioreactor SystemExtracellular MatrixStem Cell SeedingEndothelial Cell CultureMechanical StretchPulsatile PerfusionTissue EngineeringOrgan Regeneration

Related Articles