Method Article

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

DOI:

10.3791/50836

⸱

February 26th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute Oswaldo Cruz, Laboratory of Cellular Communication, Oswaldo Cruz Foundation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon gerçekleştirin ve bazı yararlı ipuçları sağlamak için nasıl burada açıklamak. Biz bu kağıt nedeniyle fonksiyonel gap junction hücresel bağlantı derecesini değerlendirmek için herkese yardımcı olacağını bekliyoruz. Burada tarif edilen her şey 1,000 Dalton altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar için uyarlanmış, ilke olarak, olabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boşluk bağlantıları, komşu hücrelerin iletişimini sağlayan hücreler arası kanallardır. Bu iletişim, boşluk bağlantısını oluşturmak için her komşu hücre tarafından bir yarım kanalın katkısına bağlıdır. Memeli hücrelerinde, yarım kanal altı konneksin, dört transmembran alanına sahip monomerler ve sitoplazma içinde bir C ve N terminali tarafından oluşturulur. Boşluk bağlantıları, iyonların, ikinci habercilerin ve küçük metabolitlerin değişimine izin verir. Ayrıca sinaptik iletim, kalp kasılması, hücre büyümesi ve farklılaşması gibi fizyolojik süreçler içinde birçok hücresel iletişim biçiminde önemli rollere sahiptirler. Canlı hücrelerdeki boşluk bağlantıları yoluyla hücresel iletişimi görselleştirmek için Lucifer Yellow'un tek hücreli bir mikroenjeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini detaylandırıyoruz. Fonksiyonel boşluk bağlantılarında, boyanın yüklü hücreden bağlı hücrelere yayılması beklenir. Floresanın difüzyonunu gerçek zamanlı olarak değerlendirebildiğiniz için boşluk bağlantılarını incelemek için çok kullanışlı bir tekniktir. Hücrelerin ve mikropipetin nasıl hazırlanacağını, bir mikromanipülatörün nasıl kullanılacağını ve bir epitel hücre hattına düşük moleküler ağırlıklı bir floresan boyanın nasıl enjekte edileceğini tartışıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gap junction komşu hücrelerden 1 arasında bağ kurar izin hücrelerarası kanallardır. Bu iletişim, her biri içi kanal oluşturmak üzere bir connexon ya hemichannel katkıda bulunur, iki ya da daha fazla komşu hücreler, bağlanır. Memeli hücrelerinde, connexon sitoplazma 2 içinde dört transmembran ve bir C ve N terminal ile altı connexins monomer oluşturulmuştur. Ara bağlantılar, yalnızca iyonlar, ikinci haberciler ve küçük metabolitlerin akışına izin vermek, ama aynı zamanda sinaptik iletim kalp kasılması, hücre büyümesi ve farklılaşması, 3, 4, 5, 6 gibi birçok fizyolojik işlemlerde, hücresel haberleşme birçok şekilde katkıda 7, 8. Buna ek olarak ara bağlantılar ile ilişkilendirilmiştirkanser 9, 10, müsküler atrofi 11, bazı genetik hastalıklar ve hastalıkların 12 demiyelinizan dahil olmak üzere birçok hastalık.

Arası karışma Bu tür çeşitli yöntemlerle 13, 14, 15, 16 ile değerlendirilebilir. Bu yazıda canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon nasıl gerçekleştirileceğini gösterir. Bu hücreler ve mikropipet, mikromanipülatör kullanımını ve timik epitelial hücre çizgisinde Lucifer sarı boyadan enjeksiyonun hazırlanması için nasıl ele. Genellikle, bu deney prosedürü, boyası yüklendi hücreye bağlanan hücrelerin ortalama analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem, boşluk altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar ile birlikte kullanılabiliryaklaşık 1000 dalton olan kavşak kesme.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin hazırlanması 1.

  1. Bir timüs epitelyal hücre hattı (IT76M1) ya da hücrenin bir kültür muhafaza bir kuluçka makinesi içinde, test edilecek (37 ° C /% 5 CO2).
  2. PBS 1x hücreleri yıkayın (bu öğeyi 3x tekrarlayın).
  3. 5 dakika için bir hücre için tripsin ekleyin.
  4. tripsin ve santrifüj (5 dakika boyunca 800 x g) ile hücrelerin% 10 FBS (fetal inek serumu) ile (Madde 1.3 ilave tripsin hacminin iki kez) orta ekleyin.
  5. Bir hemasitometre hücreleri saymak.
  6. Hücreler kavrama sağlamak için birbirleri ile yakın temas içinde olması gibi hücre tipine göre hücre yoğunluğunu ayarlayın. Not: Bizim durumumuzda, biz 35 mm petri başına 3 x 10 5 hücreler kullanılmaktadır.

2. Mikropipet Hazırlık

  1. çapında bir son 0.2 um bir cam kılcal mikropipet (1.5 mm çap) için belirtildiği gibi yaklaşık 30 M? nihai direnci elde edecek şekilde mikropipet çekinf "> 17, 18.
    NOT: Alternatif olarak, enjeksiyon pipetler satın alınabilir. Dirençli hücre boyutuna bağlıdır, örneğin, daha yüksek bir direnç mikroelektrot örneğin (100-150 MQ) 19 için, pankreas asinar hücreleri için gerekli olacaktır. oluşabilecek yaygın bir sorun daha sonra mikropipet engelleyebilir ve önceki filtrasyon veya santrifüj gerektirebilir Lucifer Sarı çözümün yağış olduğunu. Enjeksiyon öncesinde, mikropipet bir engel veya bozulması 13 her türlü varsa tespit etmek için mikroskop altında analiz edilmelidir. Mikropipet, tuzlu çözelti içinde mikro pipet ile LY enjekte edilmesiyle test edilebilir.

3. Test Mikropipet

  1. 150 mg / L Lici içinde Lucifer Sarı solüsyonu (% 5) hazırlayın ve bir şırınga kullanılarak mikropipet yüklemek veya dolgu ile (o LY Çözüm koymak).
  2. micropipe yerleştirinmikroenjeksiyon iş istasyonunda IT76M1 hücreleri ile 35 mm Petri kabı içinde TTE hücre ortama cam mikropipet ucu daldırın. Mikropipet odaklanın ve bir darbe uygulayarak bir boya akan testi uygulayın.

4. Tek hücreli Lucifer Sarı Mikroenjeksiyon

  1. sonra yavaş yavaş Mikromanipülatör kullanarak hücrelere pipet düşürmek, sağ yüksek Magni fi katyon (40X) kullanılarak hücre katmanının üstüne mikroskop odaklanın.
  2. ucu hücre zarını dokunmak yeterli yakınken hedef hücreyi delinme ve hücre içine LY tanıtmak için küçük bir hiperpolarizan darbe uygulamak. boyanın net yük bağlıdır uygulanan voltaj enjekte edilecek. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, alternatif olarak, bazı diğer boyalar ile birlikte, bu teknik kullanılabilir.
    Not: Prensip olarak MW ile herhangi bir hidrofil boya daha az 1KDa kullanılabilir daha. Bununla birlikte, devir hızı ağırlığı ve hidrofilisite göre değişebilir. Buna ek olarak, ukullanılan boyanın nspecific transferi değerlendirilmelidir.
  3. Hücre görüntüleri boya enjekte edildikten sonra 3 dakika Yakalama veya zaman atlamalı mikroskobu (30 fps) ile küçük bir film yapmak.
    NOT: Benzer bir yaklaşım (2015) 20 Hitomi ve ark görülebilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, hücreler arası köprü ile iletişimi (eksik mitoz), ara bağlantılar üzerinden geçmesi, ancak önerilir arası köprü ve nanotubules bazı türleri geçer etmez Rodamin dekstran (2 ila 10 KDa), bir ko-enjeksiyon önlemek için .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hücreler 43 21 konneksin oluşan fonksiyonel gap junction ifade etmek açıklandığı gibi timik epitel hücre çizgisi IT-76MI gap junction ile boya kaplin değerlendirmek için kullanıldı. pipet ucu altındaki bir hücreye uygulandığında Şekil 1, Lucifer Yellow enjeksiyonunu göstermektedir. Birkaç dakika sonra, bağlanmış hücreler boşluk bağlantıları ile floresan boya difüzyonu gösteren floresan (yıldız) haline gelir. hücre ve zaman şekilde flüoresan hale gelen kadar say...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerarası kanallar tarafından geçirgen 16 gerekmesine rağmen, fonksiyonel hücrelerarası boşluk kavşak varlığını, membran geçirmeyen izleyiciler, kullanımını doğrulamak için. Fluoresein, ilk fluoresan boya hücre-hücre bağlama 22, sigara kavşak zarlar 3 ila geçirgendir ve bu nedenle, Lucifer sarı boya 15 ile ikame edilmiş gözlemlemek. Şu anda, florasan izleyiciler birçok farklı türleri arasında en iyi seçim kapsam ve deney ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu makaleyi, Brezilya'da boşluk kavşakları yoluyla hücreler arası iletişim araştırmalarını başlatan Prof. Gilberto Oliveira-Castro'nun onuruna ithaf ediyorlar. Bu çalışma Capes, CNPQ ve Faperj tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lucifer sarıSigmaL0259
Lityum KlorürSigmaL4408
PBS tabletleriSigma P4417
RPMISigmaR4130
Sığır fetal serumuCultilab
TrypsinSigmaT4799
titreşim yalıtımlı masa NewportVH3036W-OPTDeneyleri titreşimden korumak ve hücre hasarını önlemek için titreşim yalıtımlı bir masaya ihtiyaç vardır
MikromanipülatörNarishigeMMO-203Bu ekipman, hücre mikro enjeksiyonu için gerekli olan mikropipetin hassas bir şekilde ayarlanmasını sağlar.
Akım Jeneratörü DigitimerDS2Mikropipetten boya akışını üretmek için, mikropipetin içinde bir elektrot bulunan bir akım jeneratörü veya bir kapasitans kompanzasyon devresine (eski elektrometre) sahip bir amplifikatör veya yeni yama kelepçeli amplifikatörlerin akım enjeksiyon fonksiyonlarına sahip bir amplifikatör kullanılarak bir nano amperin altında bir akım verildi ve topraklama kablosu plaka çanağına daldırıldı. Alternatif olarak, boya fabrika tavsiyelerine uygun olarak pnömatik bir mikroenjektör ile enjekte edilebilir.    

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
  2. Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
  3. Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
  4. Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
  5. Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
  6. Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
  7. Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
  8. Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3(2010).
  9. Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
  10. El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
  11. Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
  12. Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
  13. Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
  14. Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
  15. Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
  16. Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
  17. Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
  18. Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
  19. Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
  20. Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
  21. Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
  22. Kanno, Y., Loewenstein, W. R. Intercellular Diffusion. Science. 143 (3609), 959-960 (1964).
  23. Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single cell MicroinjectionGap Junction AnalysisLucifer Yellow DyeFluorescence MicroscopyMicromanipulator TechniqueCellular Communication StudyEpithelial Cell LineGap Junction FunctionDye Diffusion AssayThymic Epithelial Cells

Related Articles