Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Summary

Biz canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon gerçekleştirin ve bazı yararlı ipuçları sağlamak için nasıl burada açıklamak. Biz bu kağıt nedeniyle fonksiyonel gap junction hücresel bağlantı derecesini değerlendirmek için herkese yardımcı olacağını bekliyoruz. Burada tarif edilen her şey 1,000 Dalton altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar için uyarlanmış, ilke olarak, olabilir.

Abstract

Boşluk bağlantıları, komşu hücrelerin iletişimini sağlayan hücreler arası kanallardır. Bu iletişim, boşluk bağlantısını oluşturmak için her komşu hücre tarafından bir yarım kanalın katkısına bağlıdır. Memeli hücrelerinde, yarım kanal altı konneksin, dört transmembran alanına sahip monomerler ve sitoplazma içinde bir C ve N terminali tarafından oluşturulur. Boşluk bağlantıları, iyonların, ikinci habercilerin ve küçük metabolitlerin değişimine izin verir. Ayrıca sinaptik iletim, kalp kasılması, hücre büyümesi ve farklılaşması gibi fizyolojik süreçler içinde birçok hücresel iletişim biçiminde önemli rollere sahiptirler. Canlı hücrelerdeki boşluk bağlantıları yoluyla hücresel iletişimi görselleştirmek için Lucifer Yellow'un tek hücreli bir mikroenjeksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini detaylandırıyoruz. Fonksiyonel boşluk bağlantılarında, boyanın yüklü hücreden bağlı hücrelere yayılması beklenir. Floresanın difüzyonunu gerçek zamanlı olarak değerlendirebildiğiniz için boşluk bağlantılarını incelemek için çok kullanışlı bir tekniktir. Hücrelerin ve mikropipetin nasıl hazırlanacağını, bir mikromanipülatörün nasıl kullanılacağını ve bir epitel hücre hattına düşük moleküler ağırlıklı bir floresan boyanın nasıl enjekte edileceğini tartışıyoruz.

Introduction

Gap junction komşu hücrelerden ¹ arasında bağ kurar izin hücrelerarası kanallardır. Bu iletişim, her biri içi kanal oluşturmak üzere bir connexon ya hemichannel katkıda bulunur, iki ya da daha fazla komşu hücreler, bağlanır. Memeli hücrelerinde, connexon sitoplazma ² içinde dört transmembran ve bir C ve N terminal ile altı connexins monomer oluşturulmuştur. Ara ^{bağlantılar,} yalnızca iyonlar, ikinci haberciler ve küçük metabolitlerin akışına izin vermek, ama aynı zamanda sinaptik iletim kalp kasılması, hücre büyümesi ve ^{farklılaşması, 3,}

Protocol

Hücrelerin hazırlanması 1.

1. Bir timüs epitelyal hücre hattı (IT76M1) ya da hücrenin bir kültür muhafaza bir kuluçka makinesi içinde, test edilecek (37 ° C /% 5 _CO2).
2. PBS 1x hücreleri yıkayın (bu öğeyi 3x tekrarlayın).
3. 5 dakika için bir hücre için tripsin ekleyin.
4. tripsin ve santrifüj (5 dakika boyunca 800 x g) ile hücrelerin% 10 FBS (fetal inek serumu) ile (Madde 1.3 ilave tripsin hacminin iki kez) orta ekleyin.
5. Bir hemasitometre hücreleri saymak.
6. Hücreler kavrama sağlamak için birbirleri ile yakın temas içinde olması gibi hücre tipine göre hücre yoğunluğunu ayarlayın. Not: Bizim durumumuzda....

Results

Bu hücreler 43 ²¹ konneksin oluşan fonksiyonel gap junction ifade etmek açıklandığı gibi timik epitel hücre çizgisi IT-76MI gap junction ile boya kaplin değerlendirmek için kullanıldı. pipet ucu altındaki bir hücreye uygulandığında Şekil 1, Lucifer Yellow enjeksiyonunu göstermektedir. Birkaç dakika sonra, bağlanmış hücreler boşluk bağlantıları ile floresan boya difüzyonu gösteren floresan (yıldız) haline gelir. hücre ve zaman şekilde flüoresan hale gelen kadar say.......

Discussion

Hücrelerarası kanallar tarafından geçirgen ¹⁶ gerekmesine rağmen, fonksiyonel hücrelerarası boşluk kavşak varlığını, membran geçirmeyen izleyiciler, kullanımını doğrulamak için. Fluoresein, ilk fluoresan boya hücre-hücre bağlama ^22, sigara kavşak zarlar ³ ila geçirgendir ve bu nedenle, Lucifer sarı boya ¹⁵ ile ikame edilmiş gözlemlemek. Şu anda, florasan izleyiciler birçok farklı türleri arasında en iyi seçim kapsam ve deney .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifer sarı	Sigma	L0259
Lityum Klorür	Sigma	L4408
PBS tabletleri	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Sığır fetal serumu	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
titreşim yalıtımlı masa	Newport	VH3036W-OPT	Deneyleri titreşimden korumak ve hücre hasarını önlemek için titreşim yalıtımlı bir masaya ihtiyaç vardır
Mikromanipülatör	Narishige	MMO-203	Bu ekipman, hücre mikro enjeksiyonu için gerekli olan mikropipetin hassas bir şekilde ayarlanmasını sağlar.
Akım Jeneratörü	Digitimer	DS2	Mikropipetten boya akışını üretmek için, mikropipetin içinde bir elektrot bulunan bir akım jeneratörü veya bir kapasitans kompanzasyon devresine (eski elektrometre) sahip bir amplifikatör veya yeni yama kelepçeli amplifikatörlerin akım enjeksiyon fonksiyonlarına sahip bir amplifikatör kullanılarak bir nano amperin altında bir akım verildi ve topraklama kablosu plaka çanağına daldırıldı. Alternatif olarak, boya fabrika tavsiyelerine uygun olarak pnömatik bir mikroenjektör ile enjekte edilebilir.