Yöntem makalesi

İn vivo Yamanaka Faktörlerinin Aşırı İfadesi ile Yetişkin Somatik Hücrelerin Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

15K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50837

⸱

17 Aralık 2013

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, somatik hücrelerin in vivo olarak teratom oluşumu olmadan pluripotentliğe doğru yeniden programlandığını göstermektedir. Yetişkin hepatositlerin artmış pluripotentliğe sahip hücrelere in vivo yeniden programlanmasını indüklemek için Yamanka faktörlerini kodlayan plazmid DNA'nın hidrodinamik kuyruk veni enjeksiyonunu kullandık.

Özet

Tanımlanmış faktörlerin zorla ekspresyonu ile somatik hücrelerin pluripotent bir duruma yeniden programlanması sonucu ortaya çıkan indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreler, rejeneratif tıp için yeni fırsatlar sunmaktadır. iPS hücrelerinin bu tür klinik uygulamaları, esas olarak mevcut yeniden programlama metodolojilerinin düşük verimliliği ve üretilen iPS hücrelerinin implantasyon üzerine tümör oluşturma riski nedeniyle şimdiye kadar sınırlı kalmıştır.

Somatik hücrelerin pluripotentliğe doğru yeniden programlanmasının, yeniden programlama faktörlerinin gen transferi ile in vivo olarak elde edilebileceğini varsaydık. Hücreleri in vivo olarak verimli bir şekilde yeniden programlamak için, hedef dokuda yüksek seviyelerde Yamanaka (OKSM) transkripsiyon faktörlerinin eksprese edilmesi gerekir. Bu, hedef dokuya bağlı olarak farklı viral veya viral olmayan gen vektörleri kullanılarak elde edilebilir. Bu özel çalışmada, OKSM faktörlerini fare hepatositlerine iletmek için plazmit DNA'sının hidrodinamik kuyruk damarı (HTV) enjeksiyonu kullanıldı. Bu, yetişkin, somatik hücrelerin yüksek verimlilik ve hızlı kinetik ile pluripotent bir duruma doğru in vivo olarak yeniden programlandığına dair kanıt kanıtı sağladı. Ayrıca in situ olarak herhangi bir tümör veya teratom oluşumu gözlenmedi.

Somatik hücrelerin in vivo olarak yeniden programlanmasının, in vitro gerçekleştirilen protokollere kıyasla hızlı, verimli ve güvenli bir şekilde artmış pluripotensi indüklemek için potansiyel bir yaklaşım sunabileceği ve gelecekte farklı doku tiplerine uygulanabileceği sonucuna varılabilir.

Giriş

Embriyonik kök hücrelerin kullanımıyla ilgili etik kaygılar, kök hücre araştırmalarının geliştirilmesindeki sınırlamalardan biri olmuştur. Bununla birlikte, Yamanaka ve meslektaşları tarafından dört transkripsiyon faktörünün (yani: Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) zorla ekspresyonunun, somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreler olarak adlandırılan pluripotent hücrelere in vitro olarak yeniden programlanmasına yol açabileceğini keşfetmesi, yeni fırsatlar yarattı. Viral1-5 ve viral olmayan6-10 gen transferi, protein sitoplazmik translokasyonu11,12 ve miRNA13-16 transfeksiyonu, günümüzde iPS hücreleri oluşturmak için kullanılan çeşitli yöntemler arasındadır. Yine de, bu tür yeniden programlama metodolojileri, kliniğe çevrilmelerini kısıtlayan çeşitli sorunlardan muzdariptir, örneğin: a) hücre yeniden programlamanın verimliliğinde ciddi sınırlamalar; b) viral vektörlerin baskın kullanımı; c) Kültür koşullarının uzun ve çok aşamalı protokolleri, ve d) in vitro olarak üretilen iPS hücrelerinin implantasyonu ile tümörjenite riski17-20.

Tanımlanmış transkripsiyon faktörleri3-5'in retrovirüsler tarafından gen transferi, somatik hücreleri yeniden programlamak için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bununla birlikte, insersiyonel mutajenez, stabil transdüksiyon ve uzun süreli proto-onkogen ekspresyonu olasılığından kaynaklanan riskleri içerir21,22. Lipozomlar veya elektroporasyon kullanılarak plazmid DNA6,7,23 veya RNA10 iletimi gibi viral olmayan gen transfer vektörleri de araştırılmıştır. Virüslere kıyasla daha güvenli olsa da, bu vektörler önemli ölçüde sınırlı iletim ve yeniden programlama verimliliği sunar24,25 .

Ortaya çıkan bu alanın merkezi dogmalarından biri, iPS hücrelerinin in vivo implantasyonunun kontrolsüz farklılaşmalarına ve üç farklı germ tabakasından çeşitli dokulardan oluşan tümör benzeri bir kütle (teratom) oluşumuna yol açacağıdır. Bu nedenle, pluripotentliğe yeniden programlama kavramı öncelikle primer ekstrakte edilmiş somatik hücrelerin (en yaygın olarak fibroblastlar) in vitro manipülasyonlarına odaklanmıştır. Bununla birlikte, yukarıda tarif edildiği gibi, bu ilke, hücrelerin implantasyonu üzerine teratom oluşumu veya diğer tümör oluşumu formları için riskleri artırabilen çoklu tedavi turları (gen transferi, büyüme faktörleri, antibiyotikler, antioksidanlar) dahil olmak üzere uzun ve karmaşık hücre kültürü protokollerinden muzdariptir24-28.

OKSM transkripsiyon faktörlerinin geçici aşırı ekspresyonu ile yetişkin somatik hücrelerin in vivo olarak yeniden programlanmasının, daha sonra teratom oluşumuna yol açmadığını öneriyoruz29. Bunu başarmanın yöntemi, hedef doku içinde mümkün olan en güvenli şekilde yüksek düzeyde transkripsiyon faktörü ekspresyonu elde etmeye bağlı olacaktır. Bu çalışmada, hücreleri in vivo olarak pluripotentliğe yeniden programlamak için karaciğeri verimli bir şekilde hedeflediği gösterilen, yerleşik bir virüssüz gen transfer teknolojisi seçtik. Bu teknoloji, plazmit DNA'nın büyük hacimli, hızlı hidrodinamik kuyruk damarı (HTV) enjeksiyonunu içerir30,31. Bu viral olmayan gen transfer yöntemini takiben yetişkin hepatositlerde transfekte edilmiş genlerin yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilebilir. Ayrıca, bu teknoloji viral vektörlerin kullanımından kaynaklanan potansiyel riskleri en aza indirir (örn. kalıcı genomik yerleştirme, yerleştirme mutajenezi).

Protokol

1. HTV ile Karaciğer Dokusunun İn vivo Yeniden Programlanması pDNA Uygulaması

  1. Herhangi bir işlem yapılmadan önce 6 haftalık dişi Balb / C farelerinin bir hafta boyunca hayvan tesisine alışmasına izin verin.
  2. Damıtılmış suda% 0.9 tuzlu su hazırlayın ve 0.22 μm mikrofiltreden süzün.
  3. Fare başına 1,5 ml %0,9 salin içinde 75 μg pCX-OKS-2A ve 75 μg pCX-cMyc plazmit DNA içeren bir çözelti hazırlayın. not: Toplam enjeksiyon hacmi toplam vücut ağırlığının %8-10'u arasında olmalıdır.
    Not: Enjeksiyondan önce, kuyruk damarları kolayca görüntülenene ve genişlemiş görünene kadar fareleri 37 ° C'de bir ısıtma odasında tutun.
  4. Enjeksiyondan önce (ısıtma odasında) ve enjeksiyon sırasında (anestezik maske ile) izofluran ile anestezi indükleyin.
  5. HTV enjeksiyonu ile pDNA çözeltisini veya salin kontrolünü 27 G'lik bir şırınga ile uygulayın. Not: Transfeksiyonun başarılı olması için toplam hacim en fazla 5-7 saniye içinde enjekte edilmelidir.
  6. Hayvanların enjeksiyondan düzgün bir şekilde iyileşip iyileşmediğini izleyin.

2. qRT-PCR Çalışmaları için Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepaktositlerin İzolasyonu

  1. HTV enjeksiyonundan 2, 4, 8, 12 ve 24 gün sonra olmak üzere farklı zaman noktalarında, izofluran ile derin anestezi indükleyin.
  2. Hayvanın karnına% 70 etanol püskürtün, cerrahi makasla ventral orta hattaki deriden bir kesi yapın ve iç organları ortaya çıkarmak için karın kas tabakasını inceleyin.
  3. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için diyaframı makasla kesin ve kava damarını kilitleme forsepsleriyle sıkıştırın.
  4. İç organları sağa ve karaciğer loblarına doğru kaydırın, böylece hem alt kava hem de portal ven kolayca erişilebilir.
  5. İnferior kava venini 22 G'lik bir kateter ile kanüle edin ve aşırı basıncı önlemek için portal veni kesin.
  6. Perfüzyonu 37 ° C'de önceden ısıtılmış 10 ml HBSS tamponu (Ca2 + ve Mg2 + serbest, bikarbonat ile) ile başlatın. Karaciğer beyazlaşana kadar (3 dakika) tamponu 10 ml'lik bir şırınga ile yavaşça perfüze edin.
  7. 37 ° C'de önceden ısıtılmış Karaciğer Sindirim Ortamı ile karaciğer şişip gevşeyene kadar 0.6 ml / dak akış hızında (15 dakika boyunca) perfüzyona devam edin. not: Aşırı sindirim ve perfüzyon hepatositlere veya yeniden programlanmış hücrelere zarar verebilir.
  8. Deneye 4 °C'de devam edin.
  9. Falsiform ve koroner ligamentleri kestikten sonra karaciğeri forseps ile çıkarın ve bir hücre süspansiyonu elde etmek için 100 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirirken Hepatosit Yıkama Ortamı ile yıkayın.
  10. Hücre süspansiyonunu 50 ml'lik tüplerde toplayın ve Hepatosit Yıkama Ortamı ile hacmi 15 ml'ye ayarlayın.
  11. Hücre süspansiyonunu 50 g'da 4 dakika santrifüjleyin. Sıcaklığı 4 °C'de tutun. Süpernatanı (Kupffer ve epitel hücreleri içeren) atın ve hücre peletini (hepatositleri içeren) 10 ml Hepatosit Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin. not: Hücre peleti çok dikkatli bir şekilde yeniden süspanse edilmelidir, hepatositler çok kırılgan hücrelerdir.
  12. Santrifüjleme prosedürünü toplam üç kez tekrarlayın ve son peleti 10 ml Hepatosit Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin.
  13. Optik mikroskop ve hemositometre kullanarak hücre sayısını tahmin edin.
  14. 2 x 106 hücreli alikotları hazırlayın, tüm hücreleri geri kazanmak ve süpernatanı atmak için 300 x g'da santrifüjleyin.
  15. Bu noktada, hücre peleti dondurulabilir ve daha sonraki işlemlere kadar -20 °C'de tutulabilir veya RNA ekstraksiyonu için hemen kullanılabilir.

3. Pluripotent Genlerin Upregülasyonu için İzole Hepatositlerin Gen Ekspresyon Çalışması

  1. Tedarikçinin talimatlarını izleyerek bir spin sütun kiti ile 2 x 106 hücreden RNA'yı çıkarın.
  2. Tedarikçinin talimatlarını izleyerek iki aşamalı qRT-PCR gerçekleştirmek için ekstrakte edilen RNA'nın 1 μg'ını kullanın.
  3. Salin enjekte edilen hayvanların hepatositlerini, yeniden programlama, pluripotentlik ve hepatosit belirteçlerinin nispi gen ekspresyonunu düzeltmek için bir kontrol olarak kullanın.

4. Protein Düzeyinde Gelişmiş Pluripotentliğin Akış Sitometrisi Analizi

  1. Enjeksiyondan sonraki 1. ve 4. günlerde, karaciğer perfüzyonu yapın ve yukarıda belirtildiği gibi primer hepatositleri izole edin.
  2. Hücre yoğunluğunu 1 x 107 hücre / ml olarak ayarlayın ve 100 μl alikot hazırlayın.
  3. Hücreleri BD Cytofix fiksasyon tamponu ile sabitleyin ve 1x BD Perma / Yıkama tamponu ile geçirgenleştirin.
  4. Hücreleri 30 dakika boyunca anti-fare OCT4-PerCP-Cy5.5 veya anti-fare Nanog-PE ile inkübe edin.
  5. Negatif ve izotip kontrollerini dahil edin.
  6. Lekeli hücreleri CyAn ADP Yüksek Performanslı Araştırma Akış Sitometresi ile analiz edin.

5. Pluripotentlik belirteçleri için karaciğer bölümlerinin immün boyanması

  1. Enjeksiyondan dört gün sonra, karaciğeri yukarıda belirtildiği gibi perfüze edin, ancak kanı karaciğer dokusundan çıkarmak için sadece HBSS tamponu ile perfüze edin.
  2. Kriyoseksiyona devam etmek için bir parça karaciğer dokusu kesin ve 2-metilbütan (sıvı nitrojen içinde önceden soğutulmuş) içine daldırın.
  3. Donmuş dokular -80 °C'de tutulabilir veya bir kriyostat kullanılarak doğrudan 14 μm kalınlığında kesitler halinde kesilebilir.
  4. Doku bölümlerini oda sıcaklığında 1 saat havayla kurutun ve -20 ° C'de 10 dakika önceden soğutulmuş metanol ile son olarak kurutun, 15 dakika havayla kurutun ve ardından bölümleri PBS ile iki kez yıkayın (her biri 5 dakika).
  5. Bölümleri bloke edici tamponda (PBS pH 7.3'te %5 keçi serumu-%0.1 Triton) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, ardından yıkama tamponu ile iki yıkama aşaması uygulayın (PBS'de %1 BSA-%0.1 Triton, pH 7.3).
  6. Doku kesitlerini gece boyunca 4 ° C'de anti-OCT4, anti-SOX2 ve anti-Nanog primer antikorları ile inkübe edin.
  7. Ertesi gün, bölümleri 3x (her biri 5 dakika) yıkama tamponu ile yıkayın ve ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin.
  8. Karaciğer bölümlerini PBS ile yıkayın (her biri 3x, 5 dakika) ve bunları DAPI ve antifade içeren ortama monte edin.
  9. Slaytları bir epifloresan mikroskobu altında görselleştirin.

6. Karaciğer Dokusu Bölümlerinin Alkalen Fosfataz (ALP) Boyaması

  1. Daha önce tarif edildiği gibi karaciğer dokusu kesitleri elde edin.
  2. Boyamayı gerçekleştirmeden önce doku bölümlerini oda sıcaklığında 15 dakika ısıtın.
  3. % 4 paraformaldehit ile 2 dakika sabitleyin. Not: aşırı fiksasyon süresi ALP aktivitesini azaltabilir.
  4. Bölümleri 30 dakika havayla kurutun ve ardından BCIP/NBT sıvı substrat ile 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Slaytları damıtılmış suyla yıkayın ve sulu montaj ortamı ile monte edin.
  6. Işık mikroskobu ile rastgele görüntüler yakalayın.

7. Karaciğer Toksisitesini Değerlendirmek için Serumdaki Albümin ve Karaciğer Enzim Düzeylerinin Miktar Tayini

  1. Transfeksiyondan sonraki 4, 8, 12 ve 120. günlerde, doğrudan kalp ventrikülünden 300 μl kan toplayın.
  2. Pıhtılaşmayı önlemek için farklı örnekler toplanırken kanı buz üzerinde tutun.
  3. Tüm numuneler hazır olduğunda, kan pıhtılaşana kadar 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  4. Numuneleri 2.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Serumu (süpernatanatta) dikkatlice yeni bir Eppendorf tüpüne pipetleyin ve numuneler işlenene kadar -80 °C'de dondurun.
  6. Albümin, ALT, AST, ALP ve GLDH için serum seviyelerini analiz edin.

8. Karaciğer Toksisitesini Değerlendirmek için Karaciğer Bölümlerinin Hematoksilen ve Eozin (H&E) ve Periyodik Asit-Schiff (PAS) Boyaması

  1. HTV enjeksiyonundan 2, 4, 8, 12, 24, 50 ve 120 gün sonra olmak üzere farklı zaman noktalarında; sadece daha önce tarif edildiği gibi HBSS tamponu ile karaciğer perfüzyonu gerçekleştirin.
  2. Bir parça karaciğer dokusu kesin ve% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
  3. Karaciğer dokusunu parafin bloklarına gömün, H & E veya PAS boyama ile bölün ve boyayın.
  4. Işık mikroskobu ile rastgele görüntüler yakalayın.

Sonuçlar

Şekil 1, OKSM kodlayan plazmidlerin fare karaciğerine gen transferini ve in vivo hücre yeniden programlamasını gözlemlemek için uygulanan farklı teknikleri içeren prosedürün genel görünümünü göstermektedir. Plazmidlerin HTV enjeksiyonunu takiben, enjeksiyondan 2 gün sonra transfekte edilen yeniden programlama faktörlerinin (Oct3/4, Sox2, Klf4 ve cMyc) mRNA düzeyindeki gen ekspresyonunda belirgin bir artış gözlemlenmiştir. Şekil 2a'da gösterildiği gibi, bu faktörlerin ekspresyonu enjeksiyondan sonra zamanla azalmaktadır. Endojen pluripotens markerlarının (Nanog, Ecat1 ve Rex1) ekspresyonuna gelince; düzeyleri, enjeksiyondan 2 ve 4 gün sonra, salin enjekte edilen hayvanların hepatositlerindekilere kıyasla anlamlı derecede yükselmiş ve 8. günden itibaren tekrar bazal seviyelere dönmüştür (Şekil 2b). Aynı zamanda, hepatosit popülasyonunun dediferansiyasyonu, 4. günde istatistiksel olarak anlamlı olan ve 8. günden itibaren bazal seviyelere ulaşan hepatosit spesifik genlerin (Alb, Aat ve Trf) aşağı regülasyonu ile doğrulanmıştır (Şekil 2d).

Oct3/4 ve Nanog'un protein düzeyindeki ekspresyonu akış sitometrisi ile incelenmiştir. Şekil 2c'de gösterildiği gibi, HTV enjeksiyonundan sonraki 1. günde sadece Oct3/4 eksprese edilirken, endojen pluripotentlik belirteci Nanog'un ekspresyonu için 4. güne kadar beklemek gerekmiştir.

in vivo hücre yeniden programlamanın gerçekleştiği, karaciğer dokularının anti-OCT4, anti-SOX2 ve anti-Nanog antikorları ile immünohistokimyasal analizi ve ALP aktivitesi için yapılan spesifik boyama ile daha da doğrulanmıştır. Tüm markörler ve enzimatik aktivite için pozitif hücreler, OKSM enjekte edilen hayvanların karaciğer dokularında tekrarlanabilir şekilde bulunurken, salin enjekte edilen kontrollerde bulunmamıştır (Şekil 3).

pDNA'nın HTV enjeksiyonu yoluyla in vivo hücre yeniden programlamasından kaynaklanabilecek olası toksik yan etkiler ve teratom oluşumu, 120 günlük bir süre boyunca serumdaki karaciğer enzim seviyelerinin nicelleştirilmesinin yanı sıra karaciğer doku kesitlerinin H&E ve PAS boyamaları ile incelenerek araştırılmıştır. 2. güne kadar geçici ve şiddetli olmayan doku hasarı belirtileri gözlemlenmiş, ancak bu durum daha uzun sürmemiştir. Çalışma süresi boyunca teratom oluşumuna veya herhangi bir displazi ya da morfolojik değişikliğe rastlanmamıştır (Şekil 4). Albumin ve karaciğer enzim seviyeleri ile doku kesitlerinin glikojen boyamasıyla doğrulandığı üzere, çalışma süreci boyunca hiçbir hayvanda hepatik yapısal veya fonksiyonel anormallik görülmemiştir (Şekil 4b ve c).

In vivo yeniden programlama faktörlerinin enjeksiyonu, fare diyagramı, plazmit, doku analizi, PCR, sitometri.
Şekil 1. in vivo yeniden programlama prosedürünün ve analizinin şematik genel görünümü. Protokol iki ana aşamadan oluşur: (i) yeniden programlama faktörlerinin in vivo uygulanması ve (ii) doku ekstraksiyonu ve örnek analizi. Daha büyük şekli görüntülemek için buraya tıklayın.

Gen ekspresyon analizi; günlere göre göreli ekspresyon verilerini içeren sütun grafikleri; şekiller a-d; bilimsel sonuçlar.
Şekil 2. Erişkin fare karaciğerinde Yamanaka transkripsiyon faktörlerinin in vivo aşırı ekspresyonu. Balb/C farelerine yalnızca %0,9'luk salin, %0,9'luk salin içinde 75 μg pCX-OKS-2A ve 75 μg pCX-cMyc HTV yoluyla enjekte edilmiş ve 2, 4, 8, 12, 24. günlerde hepatositlerin şu değerlerinin göreli gen ekspresyonunu belirlemek için RT-qPCR analizi gerçekleştirilmiştir: (a) transfekte edilen transkripsiyon faktörleri (OKSM) ve (b) endojen pluripotens belirteçleri; (c) OCT3/4 pozitif ve Nanog pozitif hücrelerin akış sitometrisi analizi; (d) RT-qPCR ile belirlenen hepatosit belirteçlerinin göreli gen ekspresyonu. Tüm gen ekspresyon seviyeleri, salin HTV enjekte edilen gruba göre normalize edilmiştir. (* p<0.05, varyans analizi ve Tukey'nin ikili karşılaştırması ile elde edilen, salin HTV enjekte edilen gruplara kıyasla istatistiksel olarak anlamlı farkı belirtir). Şekil, Yilmazer et al'dan uyarlanmıştır.29 Şeklin daha büyüğünü görüntülemek için buraya tıklayın.

Tuzlu su ile OKSM ile işlem görmüş hücrelerde OCT4, SOX2, NANOG'un immünofloresan mikroskopi karşılaştırması.
Şekil 3. İmmünohistokimya ile yetişkin fare karaciğer dokusunda in vivo hücre yeniden programlama. Balb/C farelerine HTV yoluyla sadece %0.9'luk tuzlu su, %0.9'luk tuzlu su içinde 75 μg pCX-OKS-2A ve 75 μg pCX-cMyc enjekte edilmiştir. 4. günde karaciğerler toplanmış ve dondurulmuş doku kesitleri, immünoreaktiviteyi değerlendirmek için anti-OCT4, anti-SOX2 veya anti-Nanog antikorları ile veya dokudaki ALP aktivitesini belirlemek için BCIP/NBT ile boyanmıştır (40X). Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil etmektedir. Şekil Yilmazer et al.'dan uyarlanmıştır.29 Şeklin daha büyük halini görüntülemek için buraya tıklayın.

Salin karşıtı OKSM tedavisinde karaciğer histolojisi, enzim seviyeleri ve albümin, deney sonuçları.
Şekil 4. in vivo hücre yeniden programlamanın karaciğer fonksiyonelliği ve histopatolojisi üzerindeki etkisi. %0,9 salin içinde 75 μg pCX-OKS-2A ve 75 μg pCX-cMyc veya sadece %0,9 salin şeklinde HTV enjekte edilen Balb/C fareler. 2, 4, 8, 12, 50 ve 120. günlerde karaciğer dokuları ve serumlar izole edilmiş ve şunlar için işlenmiştir: (a) H&E boyama; (b) karaciğer enzim seviyeleri; (c) albümin seviyeleri; (d) PAS boyama. Temsili görüntüler ışık mikroskobu (10X) ile yakalanmıştır. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Şekil Yilmazer et al.29 Daha büyük şekli görüntülemek için buraya tıklayın'dan uyarlanmıştır.

Tartışma

Bu çalışma, OKSM faktörlerinin yetişkin fare karaciğerine verimli bir şekilde aktarılmasını ve aşırı ekspresyonunu takiben in vivo hücrenin pluripotense doğru yeniden programlandığına dair prensip kanıtı sağlar. qRT-PCR, flow sitometri, IHC veya serum analizi gibi farklı teknikler yardımıyla hedef doku araştırılarak in vivo hücre yeniden programlaması gözlemlendi. Dokuda OKSM faktörü aşırı ekspresyonunun indüklenmesinden çok hızlı bir şekilde, pluripotens belirteçleri mRNA ve protein seviyelerinde (48 saat içinde) yukarı regüle edildi. Bu deneyler boyunca, dokudan ekstrakte edilen hücrelerin %5-15'inin Nanog ve Oct3/4 pozitif olduğu gösterildi. Ayrıca 120 gün boyunca karaciğerde herhangi bir yapısal veya fonksiyonel anormallik gözlenmedi. Karaciğer dışındaki dokularda (akciğer, dalak, böbrek ve kalp) plazmit DNA'nın HTV enjeksiyonu ile transgenlerin ekspresyonu daha önce bildirilmişti, ancak gen ekspresyonu seviyeleri hepatositlerdekilerden en az 3 kat daha düşüktü30. Bu çalışmadaki veriler, somatik hücrelerin in vivo pluripotent bir duruma doğru yeniden programlanmasının güvenli, hızlı ve verimli olduğunu göstermektedir. Genellikle 3 hafta içinde pluripotent (iPS) hücre üretimini %1'den daha az verimlilikle elde eden mevcut in vitro hücre yeniden programlama metodolojilerinin çoğunluğu göz önüne alındığında32, in vivo pluripotens'e yeniden programlama çok ilginç alternatifler sunabilir. Pluripotens'e in vivo yeniden programlama kavramının, yüksek verimlilikle (kullanılan vektöre bağlı olarak) çeşitli somatik hücre tiplerine uygulanabileceğini varsayıyoruz, ancak in vivo yeniden programlanmış hücrelerde elde edilen fonksiyonel pluripotens seviyesinin belirlenmesi gerekecektir. Dahası, gelişmiş protokollerin ve teknolojilerin geliştirilmesiyle, in vivo yeniden programlanmış hücreler potansiyel olarak ekstrakte edilebilir ve rejeneratif tıp amaçları için kullanılabilir.

Yetişkin, somatik hücreleri in vivo olarak yüksek verimlilikle yeniden programlamak için izlenmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. Hedef dokuda yüksek düzeyde gen ekspresyonu elde etmek bir ön koşuldur. Bu çalışmada bu, HTV enjeksiyonu kullanılarak plazmit DNA'nın hepatositlere verimli transferi ve ekspresyonu kullanılarak gösterilmiştir. HTV enjeksiyonu için en önemli faktörler, hayvanın toplam vücut ağırlığının %8-10'u arasında olması gereken hacim ve 5-7 saniye içinde yapılması gereken enjeksiyon hızıdır. HTV enjeksiyonu karaciğerde daha fazla doku hasarına neden olabileceğinden ve bu da hücresel yeniden programlamanın etkinliğini etkileyebileceğinden 6 haftalıktan küçük fareler kullanılmamalıdır. Hayvanların genetik arka planının, in vivo yeniden programlamanın etkinliğini belirlemede hiçbir etkisi olmamıştır, çünkü daha önce hem Balb/C hem de TNG-A farelerinde benzer seviyelerde yeniden programlama bildirmiştik, ikincisi Nanog lokusuna yerleştirilen eGFP raportörünü taşıyan ve Sv129 arka planı29'da yetiştirilen transgenik bir suştur.

OKSM faktörlerinin hedef hücrelere verimli bir şekilde iletilmesi ve yüksek düzeyde gen ekspresyonuna izin verilmesi koşuluyla, pluripotent bir duruma (belirlenmesi gerekecek) in vivo hücre yeniden programlamasının diğer doku tiplerine uygulanabileceğini düşünüyoruz. Farklı hücre ve doku tiplerini hedeflemek için klinik öncesi ve klinik çalışmalarda çeşitli viral olmayan ve viral gen dağıtım vektörleri incelenmiştir33. Örneğin, nöral veya oküler dokular için adeno-ilişkili virüsler, verimli in vivo gen transferi34-37 için tercih edilen vektör seçimi olurken, kas dokusunda çıplak plazmit DNA enjeksiyonlarının nispeten yüksek seviyelerde gen ekspresyonu ile sonuçlandığı gösterilmiştir38,39. Bu nedenle, pluripotent bir duruma doğru verimli ve hızlı in vivo hücre yeniden programlaması elde etmek için gen transfer vektörü yöntemi doku tipine bağlı olarak dikkatlice seçilmelidir.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EPSRC, Swindon, Birleşik Krallık) ve Avrupa Komisyonu FP-7 Programları NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) ve ANTICARB (HEALTH-2008-20157) tarafından kısmen desteklenmiştir. AY, Milli Eğitim Bakanlığı (Türkiye) tarafından tam zamanlı bir doktora bursu ile desteklenmiştir ve IL, British Council ve CAIXA Vakfı'ndan (İspanya) kısmi destek almaktadır. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771Addgene'den bakteri bıçağı olarak elde edildi, Plazmid Fabrikasında (Almanya) gerçekleştirilen plazmit üretimi
pCX-cMycAddgene19772Addgene'den bakteri bıçağı olarak elde edildi, Plazmid Fabrikasında (Almanya) gerçekleştirilen plazmit üretimi
)0.22 μ m filtreMillioporeSLGP033RS
IsofluranAbbottB505
HBSS tamponuSigma-AldrichH6648Ca < sup>2 + < / sup> ve Mg < sup> 2 + < / sup> içermez, bikarbonatlı
Karaciğer Sindirim OrtamıGibco17703-034
Hepatosit Yıkama OrtamıGibco17704-024
100 & mu; m hücre süzgeciBD Biosciences352360
Nucleospin RNA II kitiMacherey-Nagel740955.25Hücrelerden ve dokulardan RNA izolasyonu için kit
iScript cDNA sentez kitiBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 ileri primerSigmadizisi yorumlardaverilmiştirTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 ters primerYorumlarda verilen SigmadizisiCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC
Sox2 ileri primerYorumlarda verilen SigmadizisiGGTTACCTCTTCCTCACTCCAG
Sox2 ters primerYorumlarda verilen SigmadizisiTCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc ileri primerYorumlarda verilen SigmadizisiCAGAGGAGGAACGAACGCTGAAGCGC
C-myc ters primerYorumlarda verilen SigmadizisiTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
Nanog ileri primerYorumlarda verilen SigmadizisiCAGAAAAACCAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog ters astarYorumlarda verilen SigmadizisiGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 ileri primerSigmadizisi yorumlarda verilenTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 ters astarYorumlarda verilen SigmadizisiATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 ileri primerYorumlarda verilen SigmadizisiACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
Rex1 ters astarYorumlarda verilen SigmadizisiTATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb ileri astarSigmayorumlarda verilen sıraGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb ters primerYorumlarda verilen SigmadizisiCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat ileri primerYorumlarda verilen SigmadizisiCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat ters primerYorumlarda verilen SigmadizisiATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf ileri primerSigmayorumlarda verilen sıraACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf ters primerYorumlarda verilen sigmadizisiACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B aktin ileri primerYorumlarda verilen sigmadizisiGACCTCTATGCCAACACACAGT
B aktin ters primerYorumlarda verilen sigmadizisiAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Cytofix fiksasyon tamponuBD Biosciences
1x BD Perma / Yıkama tamponuBD Biosciences560585
anti-fare OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
anti-fare Nanog-PEBD Biosciences560585
2-MetilbütanSigma-AldrichM32631
X100-TritonSigma-AldrichX100-500ML
Keçi serumuSigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
tavşan pAb anti-OCT4Abcamab198573 & mu konsantrasyonda kullanın; g/ml
tavşan pAb anti-SOX2Abcamab979591 & mu konsantrasyonda kullanın; g/ml
tavşan pAb anti-NanogAbcamab808921 & mu konsantrasyonda kullanın; g/ml
fare mAb anti-SSEA1Abcamab1628520 & mu konsantrasyonda kullanın; g/ml
keçi pAb anti-tavşan IgG, Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.111-165-003-JIRCy3
Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.keçi pAb anti-fare IgG115-165-003-JIR
Vector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT sıvı substrat sistemiSigmaB1911
Sulu montaj ortamıSigma
%16 ParaformaldehitFisherAA433689MStok çözeltisi %16'dır, %4
Hematoksilen ve eosinSigmaGH53/HT110216
PAS boyamaSigma395B
) 560585 ile etiketlenmiştir. ile etiketlenmiş 1/250 konsantrasyonunda kullanın.DAPI B1911 ile 1/250 VECTASHIELD montaj ortamı konsantrasyonunda kullanın Sigma

Kaynaklar

  1. Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection. Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).
  2. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  3. Takahashi, K., et al. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  6. Gonzalez, F., et al. Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).
  7. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  8. Woltjen, K., et al. Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  9. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon. Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).
  10. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  11. Kim, D., et al. Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  12. Zhou, H., et al. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).
  13. Anokye-Danso, F., et al. Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency. Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).
  14. Lin, S. -L., et al. Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression. Nucleic Acids Res. , (2011).
  15. Miyoshi, N., et al. Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas. Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).
  16. Subramanyam, D., et al. Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).
  17. Dolgin, E. Flaw In Induced-Stem-Cell Model. Nature. 470, 13 (2011).
  18. Miura, K., et al. Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines. Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).
  19. Pera, M. The Dark Side Of Pluripotency. Nature. 471, 46-47 (2011).
  20. Saha, K., Jaenisch, R. Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease. Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).
  21. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  22. Varas, F., et al. Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions. Stem Cells. 27, 300-306 (2009).
  23. Jia, F., et al. A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells. Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).
  24. Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La. Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).
  25. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).
  26. Gore, A., et al. Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  27. Hussein, S. M., et al. Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency. Nature. 471, 58-62 (2011).
  28. Lister, R., et al. Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 68-73 (2011).
  29. Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. Plos One. 8, (2013).
  30. Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna. Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  32. Yamanaka, S. Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  33. Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).
  34. Colella, P., Auricchio, A. Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases. Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).
  35. Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).
  36. Mccown, T. J. Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns. Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).
  37. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy. Gene Ther. 19, 162-168 (2012).
  38. Herweijer, H., Wolff, J. A. Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy. Gene Ther. 10, 453-458 (2003).
  39. Wolff, J. A., Budker, V. The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression. Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Pluripotens İndüksiyonuHidrodinamik Kuyruk Ven EnjeksiyonuPrimer Hepatosit İzolasyonuAkış Sitometrisi AnaliziQ-RT-PCR Gen Ekspresyonuİmmünohistokimyasal BoyamaKaraciğer Dokusu Kesit almaTeratom Oluşumu Değerlendirmesi
İn vivo Yamanaka Faktörlerinin Aşırı İfadesi ile Yetişkin Somatik Hücrelerin Pluripotentliğe Yeniden Programlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.