Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

DOI:

10.3791/50840

⸱

18 Aralık 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerin katlanması ve birleştirilmesi, protein fonksiyonu, hücrenin uzun vadeli sağlığı ve organizmanın uzun ömürlülüğü için gereklidir. Tarihsel olarak, protein katlanmasının işlevi ve düzenlenmesi in vitro, izole doku kültürü hücrelerinde ve tek hücreli organizmalarda incelenmiştir. Son çalışmalar, protein homeostazı (proteostaz), metabolizma, gelişim, yaşlanma ve sıcaklık algılama arasındaki bağlantıları ortaya çıkarmıştır. Bu bulgular, metazoan organizma Caenorhabditis elegans modelinde protein katlanmasını izlemek için yeni araçların geliştirilmesine yol açmıştır. Laboratuvarımızda, protein yanlış katlanmasını izlemek için katlanma ortamının sensörleri olarak sıcaklığa duyarlı veya doğal olarak oluşan yarı kararlı proteinleri kullanarak davranışsal analizleri, görüntülemeyi ve biyokimyasal yaklaşımları birleştiriyoruz. Spesifik bir proteinin yanlış katlanması ile ilişkili davranışsal tahliller, protein katlanması için basit ve güçlü bir okuma sağlayarak, katlanmayı modüle eden genlerin ve koşulların hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanır. Benzer şekilde, bu tür yanlış katlanma, hücrede protein yanlış lokalizasyonu ile ilişkilendirilebilir. Bu nedenle, protein lokalizasyonunun izlenmesi, farklı dokularda, gelişimin çeşitli aşamalarında ve değişen koşullar karşısında meydana gelen hücresel katlanma kapasitesindeki değişiklikleri vurgulayabilir. Son olarak, ex vivo biyokimyasal araçları kullanarak, protein stabilitesini ve konformasyonunu doğrudan izleyebiliriz. Böylece, davranışsal tahlilleri, görüntüleme ve biyokimyasal teknikleri birleştirerek, sırasıyla organizmanın, hücrenin ve proteinin çözünürlüğünde protein yanlış katlanmasını izleyebiliyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA transkripsiyonu, işleme ve translasyonun yanı sıra protein katlanması, translokasyonu ve montaj/demontaj gibi protein biyosentezinin çeşitli adımlarının etkileşimi, işlevleri için hücresel protein kalite kontrol makinelerine bağlı olan yarı kararlı proteinlerin yükünü belirler1. Bu nedenle, protein kalite kontrol makinelerinin yokluğu veya arızalanması, çeşitli hücresel makine türlerinin işlevsel olarak azalmasına ve protein yanlış katlanma hastalıklarının2-7 başlamasına neden olabilir. Protein katlama ve temizleme makinelerinin kapasitesi, yarı kararlı proteinlerin yükü ile dengelendiğinde, protein homeostazı (proteostaz) elde edilir, bu da sonuçta yanlış katlanmış proteinlerin birikmesini ve hücreler içinde toplanmayı önleyen bir durumdur6. Yanlış katlanmış proteinlerin birikiminin, ısı şoku faktörü (HSF-1) gibi strese bağlı transkripsiyon faktörlerini aktive eden ve sito-koruyucu stres tepkilerinin6,8 aktivasyonu ile sonuçlanan sinyal olduğu düşünülmektedir.

Metazoanlardaki proteostaz ağlarının işlevlerine ilişkin anlayışımız çoğunlukla in vitro sulandırma çalışmalarından ve doku kültürü hücreleri ve tek hücreli organizmalarla yapılan gözlemlerdentüretilmiştir 9. Örneğin, protein hasarını önleyen ve çözen moleküler şaperonlar üzerine yapılan araştırmalar, şaperon aracılı protein katlanması, ayrışması ve translokasyon10-13 mekanizmalarının biyokimyasal ve hücre biyolojik çalışmalarına odaklanmıştır. Buna karşılık, "normal" büyüme koşulları altında ve strese yanıt olarak metazoanların farklı hücre ve dokularındaki çeşitli proteostaz bileşenlerinin entegre işlevi hakkında yalnızca sınırlı bilgi mevcuttur11. C. elegans'ta, hücresel protein kalite kontrolünün, sıcaklığı algılayan iki nörondaki mutasyonların ısı şoku tepkisinin aktivasyonunu engelleyebileceğini ve termotoleransı azaltabileceğini gösteren deneylerde yansıtıldığı gibi, hücre özerk olmayan bir şekilde de düzenlenebileceğinin keşfi, çok hücreli organizmada proteostaz regülasyonunun incelenmesi ihtiyacını göstermiştir14-17. Bununla birlikte, eksik olan şey, çeşitli moleküler şaperon aileleri gibi proteostaz ağlarının sağlam bir metazoanın dokularında nasıl işlev gördüğüne ve bu ağların gelişim ve yaşlanma sırasında ne kadar dinamik olduğuna dair uyumlu bir resimdir. Bu amaca ulaşmak için, çok hücreli bir organizmadaki farklı hücrelerin gelişim ve yaşlanma sürecinde proteostatik kapasitesini belirlemek için canlı hayvanlarda proteom bakımını izlemek için güvenilir sensörlere ihtiyaç vardır.

Belirli bir proteinin hücresel proteostaz sensörü olarak işlev görmesi için, hücredeki ilgisiz proteinlerin katlanmasına yalnızca minimum düzeyde müdahale ederken, hücresel katlanma ortamındaki değişikliklere yanıt vermesi gerekir. Canlı bir organizmada hücresel proteostazın sürdürülmesini ve geri kazanılmasını araştırmak için, katlanma sensörlerine bağlı iki tamamlayıcı yaklaşım benimsenebilir. Birincisi, ateşböceği lusiferaz18-20 veya bir degron21-24 ile etiketlenmiş GFP gibi proteostaz makinelerine bağlı olduğu bilinen deneysel olarak tanımlanmış yarı kararlı proteinlere dayanan tasarlanmış katlama sensörlerine dayanır. İkinci yaklaşımda, hücresel ortamdaki artımlı değişikliklere yanıt veren sıcaklığa duyarlı (ts) veya yaşa bağlı agregasyon proteinleri gibi endojen yarı kararlı proteinler izlenir25-27. Tasarlanmış katlama sensörleri temel bir biyolojik işleve hizmet etmez, ancak GFP etiketli proteinler gibi güçlü raporlama tahlilleri ile tespit edilebilir olma avantajını sunar ve birçok farklı hücresel ve hayvan modelinde kullanılabilir18. Bununla birlikte, tek bir yabancı proteinin eklenmesi katlanma ortamını27 etkileyebileceğinden, bu tür polipeptitler hücresel proteostaz mekanizmasını aşırı yükleyebilir. Alternatif olarak, rapor verdikleri hücreye özgü olmayan tasarlanmış katlama sensörleri, hücrenin proteostaz kapasitesindeki değişikliklerden etkilenmeyebilir. Örneğin, bir GFP etiketli proteazom raportör substratı, bir fenotip tespit edilmeden önce proteazomun ~%90'ının inhibe edilmesini gerektiriyordu23. Buna karşılık, hücrenin proteostaz makinelerine dayanan endojen yarı kararlı proteinler, hücresel duyarlılık aralığında olma avantajını sunar. Bununla birlikte, bu tür proteinlerin yanlış katlanmasıyla ilişkili fonksiyon kaybı, hücresel fonksiyonu ve organizma canlılığını da etkileyebilir. Burada, endojen C. elegans katlama sensörlerinin kullanımına odaklanacağız.

C. elegans, hem gelişim hem de yaşlanma çalışmaları için birçok korunmuş biyolojik yolu kullanan ve hücre biyolojisi, biyokimyasal ve genetik yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanarak hücredeki protein katlanmasını takip etmek için kullanılabilen iyi kurulmuş bir metazoan modelidir. Yarı kararlı proteinleri, fenotiplerindeki, lokalizasyonlarındaki ve stabilitelerindeki değişiklikleri izleyerek proteostatik kapasite probları olarak kullandık. Ayrıca, çeşitli protein fonksiyonları, basit davranışsal analizlerle incelenebilir. Benzer şekilde, proteinlerin önemli ölçüde yanlış lokalizasyonu, hücresel protein kalite kontrol ağları hücresel taleplere uyum sağlayamadığında ortaya çıkar. Proteinler, floresan etiketli proteinler kullanılarak veya immün boyama yoluyla canlı hayvanların hücrelerinde kolayca görselleştirilebilir. Son olarak, ex vivo yöntemler kullanılarak, protein ekspresyonunu ve stabilitesini izlemek mümkündür. Bu, davranışsal ve fizyolojik değişikliklerin hızlı ve basit bir şekilde taranmasına izin verirken, protein lokalizasyonu ve stabilitesinin derinlemesine analizi ile birleştiğinde proteostaz değiştiricilerinin izlenmesine olanak tanır. Bu farklı yöntemleri birleştirerek, bir hücrenin protein katlama ortamının geniş bir görünümü elde edilebilir. Gerçekten de, bu strateji C. elegans, maya, doku kültürü ve bakterilerde proteostaz bozulmasını izlemek için başarıyla kullanılmıştır15,25-35.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı bir organizmada protein katlanmasını izlemek için davranışsal tahliller kullanma

1. Davranışsal Tahliller için Hayvanları Senkronize Etme

  1. C. elegans36'nın bakımı için ortam ve tabak hazırlama, yiyecek hazırlama ve hayvan büyüme koşulları dahil olmak üzere standart yöntemleri izleyin. Sıcaklık (15-25 °C), popülasyon büyüklüğü ve gıda mevcudiyeti dahil olmak üzere yetiştirme koşullarını dikkatlice kontrol edin. Bakteri veya mantar kontaminasyonu gösteren herhangi bir plakayı atın.
  2. 15-30 embriyo toplayın, bunları yeni plakalara aktarın ve deney süresince istenen sıcaklıkta (15-25 ° C) büyütün. Alternatif olarak, 10-20 gravid yetişkini bir tabağa koyun, 30-60 dakika yumurta bırakmalarına izin verin ve ardından tabaktan çıkarın. Hem embriyoların doğrudan toplanması hem de gravid yetişkinlerin ayarlanması yaşlarda bir miktar değişkenlik sağlayacaktır (±6 saat). Bu değişkenliği azaltmak için, embriyoları ya belirli bir aşamada, örneğin virgül aşamasında toplayın ya da yumurtlamaya yeni başlayan 10-20 yetişkin ayarlayın (yetişkinliğin 2. günü). Bu tedavinin stresli olduğu ve proteostazı etkileyebileceği göz önüne alındığında, mümkün olduğunca ağartma ile senkronizasyondan kaçının.
  3. Senkronize hayvanları seçin, puanlama için bir tahlil plakasına aktarın ve ardından atın.

2. Hareket Deneyi

Senkronize hayvanları seçin ve hareket puanlaması için istenen sıcaklıkta (15-25 °C) temiz bir plakaya aktarın. Her biyolojik kopya için >20 hayvan puanlayın ve deney koşulu başına en az 3 kez testi tekrarlayın. İki bağımsız deneysel koşulu karşılaştırmak için Wilcoxon Mann-Whitney sıra toplamı testini kullanın.

  1. Hafif hareket bozukluğunu test etmek için, 5-7 hayvanı temiz bir bakteri çiminin ortasına yerleştirin ve hayvanların plaka üzerinde 2 dakika hareket etmesine izin verin. Bu zaman aralığı, vahşi tip hayvanların %90'ının 1 cm'lik bir daireyi temizlemek için geçen süreye göre belirlendi.
  2. 1 cm'lik bir daireyi temizlemeyen (örneğin, yerleştirildikleri noktadan itibaren 1 cm'lik bir yarıçap içinde kalan) hayvanların sayısını 2 dakika içinde koordinesiz olarak sayın.
  3. Ciddi hareket bozukluğunu test etmek için hayvanları temiz bir bakteri çimine koyun.
  4. Sıfır zamanında birkaç hayvanı fotoğraflayın (t = 0) ve 5 dakika sonra tekrar (t = 5). 5 dakika sonra bir vücut uzunluğunu hareket ettirmeyen hayvanları felçli olarak puanlayın.

3. Termo direnç

  1. >20 senkronize hayvanı seçin ve 450 μl Isı Şoku (HS) tamponu içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın (Tablo 1). Her biyolojik kopya için >20 hayvan puanlayın ve deney koşulu başına en az 4 kez testi tekrarlayın.
  2. 24 oyuklu plakayı ısıtılmış bir banyoya aktarın. HS sıcaklığı ve süresi, büyüme koşullarına, özellikle de yetiştirme sıcaklığına büyük ölçüde bağlıdır.
  3. HS tamponunu 9 μl SYTOX orange ile destekleyin.
  4. TXR filtreli bir floresan stereoskop kullanarak boya alımını izleyerek hayvanların hayatta kalmasını puanlayın. Boyayı alan hayvanlar öldü. İki bağımsız deneysel koşulu karşılaştırmak için Wilcoxon Mann-Whitney sıra toplamı testini kullanın.

Belirli hücrelerde protein katlanmasını izlemek için immünoboyama ve etiketli proteinlerin kullanılması

4. İmmün boyama ile proteinlerin lokalizasyonunu izleyin

  1. Gerekli aşamada, en az 30 hayvanı M9 tamponu36 içeren bir Eppendorf tüpüne aktarın.
  2. Kısa, düşük hızlı bir santrifüj adımı (3.000 rpm / 900 x g, 2 dakika) gerçekleştirerek ve yeniden askıya alarak hayvanları M9 tamponu ile birkaç kez yıkayın.
  3. Tüpleri soğuması için birkaç dakika buzun üzerine koyun.
  4. Fazla sıvıyı çıkarın ve 500 μl buz gibi %4 paraformaldehit solüsyonu ile inkübe edin (Tablo 2). Kuluçka süresi, incelenen her protein için kalibre edilmeli ve oda sıcaklığında yaklaşık 5-30 dakika olmalıdır. 4 °C'de uzun süreli inkübasyon da yapılabilir, ancak bu numune geçirgenliğini bozabilir.
  5. Sabit hayvanları santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile PBS-Tween (pH 7.2) tamponu ile 3 kez yıkayın. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.
  6. Hayvanları santrifüjleme ile toplayın (3.000 rpm, 1-2 dakika).
  7. Davlumbazda, süpernatantın çoğunu çıkarın ve peleti 1 ml β-merkaptoetanol (β-ME) çözeltisi içinde yeniden süspanse edin (Tablo 2).
    8. Gece
  8. boyunca 37 °C'de bir nutatör üzerinde hafifçe sallayarak inkübe edin.
  9. Davlumbazda hayvanları 3 kez PBS-Tween (pH 7.2) tamponu ile yıkayın.
  10. Hayvanları 50-100 μl PBS-Tween (pH 7.2) içinde tekrar süspanse edin. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.
  11. Hayvanları santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile toplayın ve PBS-Tween tamponunun çoğunu çıkarın.
  12. Her tüpe 100-150 μl kollajenaz çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de güçlü çalkalama ile inkübe edin (bir Termo-karıştırıcı veya çalkalama inkübatörü kullanarak).
  13. Hayvanları sık sık stereomikroskop altında, 5 dakikalık kuluçka süresinden sonra başlayarak inceleyin. Hayvanların% 20'si kırıldığında, tüpü buzun üzerine yerleştirerek reaksiyonu durdurun. Bu adım son derece hassastır! Tedavi süresi fiksasyon koşullarına bağlıdır ve suşlar arasında büyük farklılıklar gösterebilir. Uzun süreli bir kuluçka, hayvanların tamamen bozulmasına neden olabilir. Kullanılan her enzim partisi için koşullar kalibre edilmeli ve bozunma dikkatle izlenmelidir.
  14. Hayvanları PBS-Tween'de (pH 7.2) iki kez yıkayın ve ardından santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile toplayın ve PBS-Tween tamponunun çoğunu çıkarın.
  15. 1 ml AbA çözeltisi ekleyin (Tablo 2) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edin. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.
  16. Hayvanları santrifüjleme (3.000 rpm, 1-2 dakika) ile toplayın ve 200 μl AbA'da yeniden süspanse edin.
  17. AbA çözeltisinde 1: 100-1: 1.000'e seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin ve hafif sallanma ile inkübe edin. İnkübasyonun sıcaklığı ve süresi antikorlar arasında değişebilir ve incelenen her protein için kalibre edilmelidir. Oda sıcaklığında bir gece inkübasyon ile başlıyoruz.
  18. Hayvanları santrifüjleme ile yıkayın (3.000 rpm, 1-2 dakika).
  19. AbA tamponu (1 ml) ekleyin ve oda sıcaklığında 15-60 dakika hafifçe karıştırarak inkübe edin. Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.
  20. İsteğe bağlı: Numune ayrıca floresan boyalarla da boyanabilir. Bunu yapmak için, boyayı (ör. DAPI (2 mg / ml) veya Phalloidin (1:100)) 200 μl AbA'ya ekleyin ve 1 saate kadar hafifçe sallayarak inkübe edin. Bu adım, ikincil antikorun yıkanması için adımlardan biri sırasında gerçekleştirilebilir.
  21. 4.18-4.19 adımlarını tekrarlayarak hayvanları 3 kez yıkayın.
  22. 1:100 oranında seyreltilmiş uygun floresan etiketli ikincil antikor ile 100 μl AbA ekleyin.
  23. Numuneleri kapalı tutun (veya karanlık bir tüpte) ve oda sıcaklığında birkaç saat sallanarak inkübe edin.
  24. Hayvanları AbA tamponunda (1 ml) oda sıcaklığında 15-60 dakika hafifçe karıştırarak inkübe ederek 3 kez yıkayın ve ardından santrifüjleyin (3.000 rpm, 1-2 dakika). Hayvanlar bu aşamada 4 °C'de birkaç hafta saklanabilir.
  25. Hayvanları slaytlara monte etmek için, tüm sıvıyı çıkarın ve aynı tamponun 10 μl'sinde yeniden süspanse edin.
  26. Hayvanların sırıklaşmasını önlemek için pipet ucunun ucunu kesin ve numunenin 1-2 μl'sini bir lam üzerine aktarın.
  27. Montaj ortamını 1:1 oranında ekleyin.
  28. Slaytı bir lamel ile nazikçe kapatın ve oje ile kapatın. Slayt hemen izlenmezse, slaytlar -20 °C'de uzun süre saklanabilir.

5. Etiketli proteinlerin lokalizasyonunu izleyin

  1. Gerekli aşamada, en az 15 hayvanı bir slayt üzerinde 10 ml'lik bir M9 tamponuna toplayın.
  2. Bir "solucan penası" kullanarak, hayvanları 10 ml'lik bir damla paraformaldehit çözeltisine (% 4) taşıyın (Tablo 2) ve tüm hayvanlar hareket etmeyi bırakana kadar bekleyin (yaklaşık 5 dakika).
  3. Bir "solucan penası" kullanarak, hayvanları 2 ml'lik bir damla M9 tamponuna ve montaj ortamına (1: 1) taşıyın (Tablo 2).
  4. Hayvanları nazikçe bir lamel ile örtün ve oje ile kapatın.

Protein katlanmasını ve stabilitesini izlemek için ex vivo tahlillerin kullanılması

6. Kısmi Sindirim

  1. Hayvanları bir mikrofüj tüpünde 1-2 ml M9 tamponu kullanarak 15 plakadan (60 mm) yıkayın. Hayvanların kalabalık olmaması ve deney süresince yeterli yiyeceğin bulunması gerektiğini lütfen unutmayın.
  2. Hayvanları santrifüjleyerek (3.000 rpm, 2 dakika) M9 tamponu ile birkaç kez yıkayın ve hayvanları yeniden süspanse edin.
  3. Son dönüşten sonra, hayvanları 100 μl M9 tamponunda yeniden süspanse edin.
  4. Sıvı N2 içinde flaş dondurma. Numuneler -80 °C'de saklanabilir.
  5. Soğutulmuş bir havaneli ve motorlu matkap (elde tutulan bir doku kültürü matkabı da kullanılabilir) kullanarak numuneyi öğütün. Numuneyi buz üzerinde tutun ve aşırı ısınmayı önleyin.
  6. Öğütmenin tamamlanıp tamamlanmadığını belirlemek için hayvanları sık sık stereomikroskop altında inceleyin. Sağlam hayvanlar kalırsa, işlemi tekrarlayın.
  7. Solucan ekstraktını pipetleyerek hacmi tahmin edin.
  8. 1: 1 oranında (2x) solucan lizis çözeltisi ekleyin (Tablo 3). Herhangi bir proteaz inhibitörü kullanmayın.
  9. 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  10. Önceden soğutulmuş bir santrifüjde (4 °C) santrifüjleme (2 dakika boyunca 1.000 x g) ile kalıntıları temizleyin.
  11. Süpernatanı temiz bir mikrofüj tüpüne aktarın. Numuneler doğrudan kullanılabilir veya -80 °C'de saklanabilir.
  12. Kimotripsin çözeltisini hazırlayın (Tablo 3) ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
  13. Bradford testini kullanarak toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.
  14. Gerekirse numuneyi, toplam protein konsantrasyonu 3-3.5 mg / ml olacak şekilde seyreltin.
  15. Toplam protein lizatına (1: 1.200) kimotripsin çözeltisi ekleyin.
  16. İnkübasyon süresini belirlemek için, numuneyi 60 dakika boyunca kimotripsin ile inkübe edin. Farklı zaman noktalarında (örn. 0, 5, 20, 40 ve 60 dakika) numuneden 20 μl alikot çıkarın, hemen SDS numune tamponu ile karıştırın ve 96 ° C'de 5 dakika kaynatın. * Alternatif olarak, numuneyi farklı konsantrasyonlarda kimotripsin ile inkübe edin ve SDS numune tamponu ekleyerek ve 5 dakika kaynatarak belirli bir süre sonra reaksiyonu durdurun 96 °C'de.
  17. Numuneleri bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın.
  18. Proteinin nispi stabilitesini belirlemek için uygun antikorlar kullanarak western blot analizi yapın.
  19. Numuneler arasında önemli değişiklik gösteren en uygun koşulları (kimotripsin konsantrasyonu ve sindirim süresi) belirleyin ve bu koşulları gelecekteki deneyler için kullanın.
  20. NIH görüntü jel modülü gibi dansitometri yazılımını kullanarak farklı sindirim ürünlerinin (daha düşük moleküler ağırlıklı fragmanlar) yoğunluğunu belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güvenliği ihlal edilmiş bir katlama ortamı, proteinlerin yanlış katlanmasına ve toplanmasına neden olabilir. Protein yanlış katlanması, değişmiş konformasyon ile ilişkilidir ve protein fonksiyonunun kaybına neden olur. Bozulmamış hayvanlarda, spesifik hücrelerde ve protein ekstraktlarında protein katlanmasını ve işlevini izlemek için tamamlayıcı yaklaşımlar kullanıyoruz. Bilinen bir kararsızlaştırıcı mutasyonla ilişkili güçlü davranışsal ve hücresel fenotiplere dayanan akıllı bir katlama sensörü seçimi, daha sonra protei...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel proteostaz kapasitesinin probları, katlama ortamındaki değişikliklere karşı oldukça hassas olmalı ve protein katlama kalite kontrol yeteneklerinin gerçek zamanlı değerlendirmesini sağlamak için kolayca izlenebilmelidir. Proteostaz kapasitesinin probları olarak yarı kararlı proteinleri kullanarak fenotip, hücre altı protein lokalizasyonu ve protein konformasyonundaki değişiklikleri izledik. Burada sunulan protokoller, hareketlilik, kas filamenti organizasyonu ve miyozin stabilitesi dahil olmak üzere kas proteini ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan tüm nematod suşları, NIH Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. H.F. Epstein tarafından geliştirilen monoklonal antikorlar, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi Biyoloji Bölümü tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan elde edildi. N. Shemesh, Fay ve Bert Harbour ödülü ile desteklendi. A.B.-Z. İsrail Yüksek Öğrenim Konseyi Alon Bursu, Marie Curie Uluslararası Yeniden Entegrasyon hibesi ve İki Uluslu Bilim Vakfı ve İsrail Bilim Vakfı'ndan (Hibe No. 91/11) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antikor staning ve fiakstionparaformaldehitMerc8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
KollajenazSigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa AesarA16046
ve beta; -MESigma8057400250
BSADi Cam000-40-100
  Kısmi sindirim ChymotrypsinSigmaC4129-250MG
Termo-dirençSYTOX TuruncuInvitrogenS11368
KolesterolAmaresco0433-250G
EKİPMAN
M165 FC floresan stereoskopLeicaTXR filtresi
EXi Mavi Floresan Mikroskopi KamerasıQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META konfokal mikroskopZeiss
Pelet tokmaklarıSigmaZ359947-100EA
Pelet Havaneli Akülü MotorKontesK749540-0000
MicroCL 17 Mikrosantrifüj SerisiTermo75002455Soğutmalı, , 230 V 50/60 Hz, ClickSeal Biyomuhafaza Kapaklı 24x 1.5/2.0 ml rotor içerir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. Arias, E., Cuervo, A. M. Chaperone-mediated autophagy in protein quality control. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 184-189 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 777-788 (2010).
  4. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  5. Finley, D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78, 477-513 (2009).
  6. Gidalevitz, T., Prahlad, V., Morimoto, R. I. The stress of protein misfolding: from single cells to multicellular organisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  7. Haynes, C. M., Ron, D. The mitochondrial UPR - protecting organelle protein homeostasis. J. Cell. Sci. 123, 3849-3855 (2010).
  8. Akerfelt, M., Morimoto, R. I., Sistonen, L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.. 11, 545-555 (2010).
  9. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Integrating the stress response: lessons for neurodegenerative diseases from C. elegans. Trends Cell. Biol. 19, 52-61 (2009).
  10. Li, J., Soroka, J., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery: conformational dynamics and regulation by co-chaperones. Biochim. Biophys. Acta. 1823, 624-635 (2012).
  11. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  12. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J. Struct. Biol. 179, 152-160 (2012).
  13. Mayer, M. P. Gymnastics of molecular chaperones. Mol. Cell. 39, 321-331 (2010).
  14. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144, 79-91 (2011).
  15. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes Dev. 21, 3006-3016 (2007).
  16. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  17. Bar-Lavan, Y., Kosolapov, L., Frumkin, A., Ben-Zvi, A. Regulation of cellular protein quality control networks in a multicellular organism. FEBS J. 279, 526-531 (2012).
  18. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat. Methods. 8, 879-884 (2011).
  19. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, 4221-4235 (2012).
  20. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Hsp70 targets Hsp100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. J. Cell. Biol. 198, 387-404 (2012).
  21. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell. 5, 639-648 (2000).
  22. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nat. Methods. 7, 473-478 (2010).
  23. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  24. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  25. Brown, C. R., Hong-Brown, L. Q., Welch, W. J. Correcting temperature-sensitive protein folding defects. J. Clin. Invest. 99, 1432-1444 (1997).
  26. Van Dyk, T. K., Gatenby, A. A., LaRossa, R. A. Demonstration by genetic suppression of interaction of GroE products with many proteins. Nature. 342, 451-453 (1989).
  27. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, 1471-1474 (2006).
  28. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 14914-14919 (2009).
  29. Burkewitz, K., Choe, K., Strange, K. Hypertonic stress induces rapid and widespread protein damage in. C. elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 301, 566-576 (2011).
  30. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, 226-229 (2011).
  31. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biol. 8, (2010).
  32. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. In press, (2013).
  33. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (2009).
  34. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genet.. 7, (2011).
  35. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14204-14209 (2011).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Gengyo-Ando, K., Kagawa, H. Single charge change on the helical surface of the paramyosin rod dramatically disrupts thick filament assembly in Caenorhabditis elegans. J. Mol. Biol. 219, 429-441 (1991).
  38. Clark, S. G., Shurland, D. L., Meyerowitz, E. M., Bargmann, C. I., vander Bliek, A. M. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 94, 10438-10443 (1997).
  39. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
  40. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol. Biol. Cell. 15, 657-664 (2004).
  41. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes Dev. 22, 1427-1438 (2008).
  42. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.. 3, (2011).
  43. Tissenbaum, H. A. Genetics, Life Span, Health Span, and the Aging Process in Caenorhabditis elegans. J. Gerontol. A. Biological Sci. Med. Sci. 67, 503-510 (2012).
  44. Hosono, R., Mitsui, Y., Sato, Y., Aizawa, S., Miwa, J. Life span of the wild and mutant nematode Caenorhabditis elegans. Effects of sex, sterilization, and temperature. Exp. Gerontol. 17, 163-172 (1982).
  45. Madi, A., et al. Mass spectrometric proteome analysis for profiling temperature-dependent changes of protein expression in wild-type Caenorhabditis elegans. Proteomics. 3, 1526-1534 (2003).
  46. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  47. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295, 669-671 (2002).
  48. Melkani, G. C., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. The UNC-45 chaperone is critical for establishing myosin-based myofibrillar organization and cardiac contractility in the Drosophila heart model. PLoS One. 6, (2011).
  49. Gosai, S. J., et al. Automated high-content live animal drug screening using C. elegans expressing the aggregation prone serpin alpha1-antitrypsin Z. PLoS One. 5, (2010).
  50. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. (313), 1604-1610 (2006).
  51. Cohen, E., et al. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  52. Shemesh, N., Shai, N. Ben-Zvi A (2013) Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (2013), 814-822 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Behavioral AssaysImmunofluorescence MicroscopyWestern Blot AnalysisTemperature Sensitivity AssayProtein MisfoldingProteostasis MonitoringAnimal SynchronizationCollagenase Digestion

İlgili makaleler