FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

Özet

FtsZ'nin polimerizasyonu bakteri hücre bölünmesi için gereklidir. Bu raporda, FtsZ polimerizasyon aktivitesini izlemek ve tampon bileşiminin etkisini tartışmak için basit protokolleri detaylandırıyoruz. Protokoller, FtsZ'nin FtsZ polimerizasyonunu etkileyen düzenleyici proteinler veya antibakteriyel ilaçlarla etkileşimini incelemek için kullanılabilir.

Özet

Bakteriyel hücre bölünmesi esnasında, esas teşkil eden protein FtsZ sözde Z-halka oluşturmak için hücre ortasında toplanır. FtsZ in vitro GTP varlığında, uzun lifler halinde polimerize ve polimerizasyon çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yaygın ışık saçılımı, sedimantasyon, GTP hidroliz deneyleri ve elektron mikroskopi dahil olmak üzere temel yöntemler kullanılarak in vitro incelenmiştir. Tampon koşullar etkisi de her iki FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinlerle etkileşime FtsZ yeteneği. Burada, biz FtsZ polimerizasyon çalışmalar için protokol tanımlamak ve model proteinler olarak Escherichia coli ve Bacillus subtilis FtsZ kullanarak koşulları ve denetimleri doğrulamak. Bir düşük hızlı çökelme tahlili FtsZ polimerleri paket ya tubulate proteinlerle FtsZ etkileşimi çalışma sağlayan sokulur. Geliştirilmiş bir GTPaz deney protokolü test edilmesine olanak tarif edilmektedirfosfat saptama tepki olarak renk gelişimi varyasyonu kaldırılması standart enkübasyon süreleri ile 96 oyuklu bir plaka kurulumu, çeşitli koşullar kullanılarak, zaman içinde GTP hidrolizinin. Işık saçılması çalışmaları ve elektron mikroskopisi için numunelerin hazırlanması tarif edilmektedir. Çeşitli tamponlar FtsZ polimerizasyon çalışmalar için uygun tampon ve pH, tuz konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. KCl yüksek bir konsantrasyonu, deneylerin büyük bir kısmında en iyisidir. Bizim yöntemleri E. değil sadece FtsZ in vitro karakterizasyonu için bir başlangıç ​​noktası sağlar coli ve B. subtilis ama başka bir bakteriden. Bu nedenle, bu buluşun metodları düzenleyici proteinler veya FtsZ polimerizasyonu etkileyen antibakteriyel ilaçların test ile FtsZ etkileşimi çalışmaları için kullanılabilir.

Giriş

Esansiyel bakteriyel protein FtsZ bakteriyel hücre bölünmesi makine en iyi karakterize edilmiş bir proteindir. FtsZ tubulin prokaryotik homolog olan ve bir GTP bağlı bir şekilde, in vitro olarak polimerize eder. FtsZ bakteri ^1,2 onun korunmuş doğası ve teklik nedeniyle yeni antibiyotik için çok cazip bir hedeftir. Hücre bölünmesi başında, FtsZ diğer hücre bölünmesi proteinlerin montajı için bir yapı iskelesi olarak hizmet midcell bir cytokinetic halka oluşturur. Z-halka oluşumu bölme düzlemi doğru lokalizasyonu için çok önemlidir. FtsZ montajı dinamikleri gibi Minc, SepF, Zapa, UgtP, ve Ezra ² (bakteri türlerine bağlı olarak) gibi çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yoğun in vitro ve protofilaments düz, kavisli protofilaments, filament levha, filaman demetleri ve filament tüpler dahil olmak üzere, pek çok farklı yapılarda incelenmiştir des olmuşturmontaj tampon, nükleotid ve deneyde ³ dahil ek protein bağlı cribed. Caulobacter crescentus elektron cryotomography deneyler Z-halkası geniş ⁴ donatılacak olmadan nispeten kısa, kesintili tek protofilaments monte edilir olduğunu göstermektedir rağmen in vivo FtsZ protofilaments mimarisi henüz tam olarak anlaşılmış değildir.

İn vitro olarak, FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinleri ile FtsZ etkileşimi reaksiyon tampon bileşimine duyarlıdır. Örneğin, son zamanlarda FtsZ C-terminüsünde SepF için etkileşim sitesi tarif edilen ve bir FtsZ Δ16 _arasında C-terminal kesik artık SepF ⁵ bağlandığını göstermiştir. SepF-FtsZ _{İşletmeleri} etkileşim önceki bir çalışmada, benzer bir FtsZ _{İşletmeleri} Δ16 hala SepF FtsZ üzerinde ikincil bir siteye bağlanan önerdi SepF ile cosedimented kesilmesinden ^{6. Bu çalışmalar arasındaki fark, pH 6.5 'te cosedimentation yoktu, oysa FtsZ kesik ile SepF hiçbir cosedimentation vardı, tepkime tampon-at pH 7.5 terkibiydi. Gündoğdu et al. SepF fonksiyonel değildir ve pH 6.5 'de görülen cosedimentation FtsZ Δ16 _arasında C-terminal kesik ile SepF çökelmesi yerine etkileşimin neden olması muhtemel olduğunu gösteren, pH 6.5 7 çökeltilerini kaydetti. FtsZ polimerizasyonu pH ve KCl konsantrasyonunun etkisi daha önce incelenmiştir. E. polimerleri pH 6.5 coli FtsZ (FtsZ _Ec) daha uzun ve daha bol nötr pH 8,9 oluşmuş daha vardır. Tadros et al. K + bağlayıcı FtsZ _Ec polimerizasyonu ile bağlantılı ve FtsZ aktivitesi 10 için çok önemli olduğunu belirterek tek değerli katyonların mevcudiyetinde FtsZ _Ec polimerizasyonunu inceledik. PH daha critica olduğuSepF önceki örnek ve FtsZ 11 MINC inhibitör etkisinin pH bağımlılığı ile gösterildiği gibi diğer proteinler ile FtsZ etkileşimi, incelenmiştir l. PH ve tuz konsantrasyonu hem de diğer proteinler ile FtsZ etkileşimini etkileyebilir gibi, bu FtsZ polimerizasyon çalışmaları için doğru koşulları ve kontrolleri seçmek önemlidir.}

Burada ışık saçılması, elektron mikroskobu, sedimantasyon ve GTPaz deneyleri ile FtsZ polimerizasyonu ve GTPaz aktivitesini incelemek için protokolleri açıklanmıştır. Sağ açılı ışık dağılımı gerçek zamanlı ¹² FtsZ polimerizasyon okumak için standart bir yöntemdir. Biz sedimantasyon ve GTPaz tahlil için birkaç iyileştirmeler tanıttı. Biz ışık saçılması ve elektron mikroskobu için numune hazırlamak için nasıl ayrıntılı olarak mevcut. FtsZ polimerizasyonu çalışma literatürde kullanılan çeşitli tamponlar test ve her deney için en iyi şartları tarif edilmiştir. Biz de olmalıdır kontrol eden göstermeken iyi veri elde etmek tanıttı.

Bu yöntemler FtsZ polimerizasyon aktivitesi ve basit bir yöntem ve en laboratuvarlarda mevcuttur ekipman kullanılarak başka proteinlerle etkileşim hızlı bir çalışma sağlar. FtsZ polimerizasyonu incelemek için daha sofistike yöntemler var ama genellikle floresan etiketleri ^8,13,14 ile daha özel ekipmana erişim ve / veya FtsZ değiştirilmesini gerektirir. Bu yazıda anlatılan basit yöntemler B. FtsZ kullanılarak gösterilmektedir subtilis ve E. coli, en yaygın Gram + ve Gram-model organizmalar. Protokoller başka FtsZ proteine ​​uyarlanabilir. Bu yeni FtsZs, zaman ile ilgili olarak küçük değişiklikler, tampon veya inkübasyon sıcaklığı ile ön deneylere dayalı olarak bir optimum bir sonuç için gerekli olabilir. Burada açıklanan deneyler bu en uygun koşulları bulmakta yardımcı olmalıdır.

Protokol

Etiketlenmemiş FtsZ proteinleri daha önce tarif edildiği gibi^{saflaştırıldı 11,15, 20} mM Tris/ HCl (pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2.5 mM MgAc ve %10 gliserole karşı diyalize edildi ve -80 °C'de saklandı. Bu koşullar altında, protein önemli bir aktivite kaybı olmadan 2 yıldan fazla bir süre saklanabilir. Protein, numunenin çözülmesini ve donmasını önlemek için 100 μl'lik alikotlarda saklanmalıdır. Çözüldükten sonra numune en fazla bir hafta boyunca 4 °C'de tutulabilir. FtsZ yüksek konsantrasyonlarda çözünür ve 7-10 mg / ml'de saklanabilir. Daha sonraki deneylerde depolama tamponu bileşenlerinin istenmeyen etkilerinden kaçınmak için protein konsantrasyonunu yüksek tutmak önemlidir. Bu nedenle, depolama konsantrasyonu, gliserol konsantrasyonunu% 1'in altına getirmek ve reaksiyon karışımındaki diyaliz tamponunun diğer bileşenlerinin konsantrasyonunu en aza indirmek için en az 10x'lik bir FtsZ seyreltmesine izin vermelidir. FtsZ polimerizasyonu, yüksek sodyum⁹ veya imidazol konsantrasyonlarının varlığından da etkilenebilir, bu nedenle bu bileşenlerin polimerizasyon tamponundan çıkarılması gerekir. SepF, tarif^{edildiği gibi 7} saflaştırıldı ve -80 ° C'de elüsyon tamponunda saklandı. FtsZ'nin E. coli ve B. subtilis'ten saflaştırılması için alternatif yayınlanmış prosedürlerin yanı sıra farklı kaynaklardan FtsZ'nin saflaştırılması için prosedürlere yapılan atıflar Tablo 1'de özetlenmiştir (temsili sonuçlar bölümüne bakınız).

1. Numune Hazırlama

1. Polimerizasyon tamponları hazırlayın: 1 50 mM Hepes / NaOH, pH 7.5 2 25 mM BORULAR/ NaOH, pH 6.8 3 50 mM MES/ NaOH, pH 6.5 4 50 mM Hepes / NaOH, pH 7.5; 50 mM KCl 5 25 mM BORULAR/ NaOH, pH 6.8; 50 mM KCl 6 50 mM MES / NaOH, pH 6.5; 50 mM KCl 7 50 mM Hepes / NaOH, pH 7.5; 300 mM KCl 8 25 mM BORULAR/ NaOH, pH 6.8; 300 mM KCl 9 50 mM MES/ NaOH, pH 6.5; 300 mM KCl
2. Filtre: 22 μm'lik bir membran filtre kullanarak tüm tamponları sterilize edin.
3. (100)'den her polimerizasyon tamponunda 2 mM GTP, GDP ve_{MgCl 1} stok çözeltileri hazırlayın.
4. Tüm deneyler için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 100.000 x g'da döndürerek proteinleri önceden temizleyin.

2. FtsZ Sedimantasyon Testi

1. Yüksek hızlı santrifüjleme ile uyumlu tüplerde polimerizasyon tamponlarından birine (numune hazırlama noktası 1'e bakınız) MgCl₂ ve FtsZ ekleyerek reaksiyon karışımını hazırlayın. Toplam hacim 49 μl, MgCl₂ 10 mM'de ve FtsZ 12 μM'de 50 μl nihai hacimde olmalıdır.
2. Tüpü çalkalama işlevine sahip bir inkübatöre yerleştirin, 30 ° C'de 300 rpm'de 2 dakika inkübe edin (alternatif olarak numune hafifçe vurulabilir ve kısa bir süre mikrofüje edilebilir, ardından 30 ° C'de ön ısıtma yapılabilir).
3. Deneyde kullanılanla aynı tampona 1 μl GTP veya GDP stok çözeltisi ekleyerek polimerizasyona başlayın (nihai konsantrasyon 2 mM). 30 °C'de 300 rpm'de (veya çalkalama fonksiyonlu bir inkübatörde) 10 veya 2 dakika (sırasıyla 50 mM KCl ve 300 mM KCl'lik tamponlar için) inkübe edin.
4. Tüpleri bir ultrasantrifüj rotoruna aktarın ve 25 ° C'de 350.000 x g'da (TLA 120.1 rotor için 89.700 rpm) 10 dakika döndürün.
5. Döndürdükten sonra, tüpleri rotordan dikkatlice çıkarın ve süpernatanı hemen temiz bir tüpe aktarın. 20 μl 2x numune tamponuna 20 μl süpernatan ekleyerek numuneleri SDS-PAGE için hazırlayın. 98 °C'de 10 dakika kaynatın.
6. FtsZ polimerleri içeren pelet fraksiyonuna 50 μl 2x numune tamponu ekleyin. Ultrasantrifüj tüpünü 2 ml'lik bir tüpe yerleştirin. Peleti 98 °C'de 10 dakika kaynatarak yeniden süspanse edin, ardından numuneyi süpernatan numune ile aynı 2x seyreltme yapmak için 50 μl demineralize H_2Oekleyin.
7. Ultrasantrifüj tüpünü 2 ml'lik tüpte ters çevirin ve 18.000 x g'da bir Eppendorf santrifüjünde 5 dakika aşağı çevirin. Ultrasantrifüj tüpünü 2 ml'lik tüpten çıkarın.
8. Her bir süpernatan ve pelet numunesinden 10 μl'yi %10'luk bir SDS-PAGE jel üzerine yan yana yükleyin. Jeli 150 V'ta çalıştırın.
9. Jeli Coomassie Brilliant Blue G-250 ile boyayın ve miktar tayini için saklayın.

3. Yavaş Dönüşte FtsZ Sedimantasyon Testi

1. Adım 2'deki gibi polimerizasyon çözeltisini hazırlayın, SepF ve/veya FtsZ (nihai konsantrasyon 12 μM) ekleyin. Bu deneyler, bir TLA-55 rotoru ile birlikte Beckman tek kullanımlık 1,5 ml'lik tüplerde gerçekleştirilebilir.
2. Tüpü çalkalama işlevine sahip bir inkübatöre yerleştirin ve 30 ° C'de 300 rpm'de 2 dakika inkübe edin.
3. Bir stok çözeltisinden (nihai konsantrasyon 2 mM) 1 μl GTP veya GDP ekleyerek polimerizasyona başlayın, 300 rpm'de 30 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
4. 25 °C'de 24.600 x g'da (TLA 55 rotor için 20.000 rpm) 15 dakika döndürün.
5. Süpernatanı çıkarın ve temiz bir tüpe aktarın, 20 μl alın ve 20 μl 2x numune tamponuna aktarın. 98 °C'de 10 dakika kaynatın.
6. Polimerler içeren pelet fraksiyonuna 50 μl 2x numune tamponu ekleyin ve 98 °C'de 10 dakika kaynatarak tekrar süspanse edin, 50 μl demineralize H₂O ekleyin.
7. Her bir süpernatan ve pelet numunesinden 10 μl'yi %10'luk bir SDS-PAGE jel üzerine yan yana yükleyin. Jeli 150 V'ta çalıştırın.
8. Jeli Coomassie Brilliant Blue G-250 ile boyayın ve miktar tayini için saklayın.

4. FtsZ Sedimantasyon Testlerinin Miktar Tayini

1. Bir jel dokümantasyon sistemi (ör. LAS-4000, Fujifilm) kullanarak Coomassie lekeli jelin fotoğrafını çekin.
2. Jel görüntüsünü, jellerin densitometrik analizi için uygun bir programda (örneğin AIDA görüntü analizörü programı (Raytest)) açın ve bu programdaki analizi aşağıda açıklayın.
3. Araç çubuğundaki "Değerlendirme" düğmesini tıklayın.
4. Listeden "2D Dansitometri"yi seçin ve Tamam'a tıklayın.
5. Ana menüde "Değerlendirme" ye tıklayın ve "Bölge Belirleme" girişini seçin.
6. Jel üzerinde bir bölge oluşturmak için, Bölge Belirleme araç kutusundaki Otomatik kontur aracının sembolüne tıklayın.
7. Jel üzerindeki protein bandının sol üst köşesine tıklayın, fare düğmesini basılı tutun ve bandın istediğiniz sağ alt ucuna sürükleyin ve fare düğmesini bırakın.
8. Her FtsZ/SepF bandını aynı şekilde işaretleyin.
9. Atanan bölgelerin değerlendirilmesi ile ilgili tüm bilgiler Bölge Raporu'nda bulunabilir. Bölge Raporu'nu almak için Bölge Belirleme araç kutusundaki "Bölge Raporunu Göster" butonuna tıklayın.
10. Raporu dışa aktarmak için, ana menüde Dosya'ya tıklayın ve "Dışa Aktar à 2B Bölge Raporu" girişini seçin.
11. Bölge raporunda, oluşturulan her bölgenin yoğunluğu bulunmalıdır. Rapordaki yoğunluk değerlerini kullanarak peletteki protein yüzdesini (FtsZ, düzenleyici protein) hesaplayın.

5. 90° Işık Saçılımı

1. Bir floresan spektrometresini (örneğin AMINCO-Bowman Seri 2) açın, termal dalgalanmaları önlemek için lambanın birkaç dakika ısınmasına izin verin ve küvet odası sıcaklığını 30 °C'de tutmak için sirkülasyonlu bir su banyosunu açın.
2. Spektrometrenin çalışma parametrelerini tanımlayın: dedektör yüksek voltajı 300 V, emisyon ve uyarma dalga boyu: 350 nm, yarık genişliği: 4 nm. Birçok spektrometrenin, bir deneyin başlangıcındaki sinyali otomatik olarak maksimumun belirli bir yüzdesine (örneğin% 60) ayarladığını unutmayın. Bu, FtsZ'yi polimerize etmek için GTP eklenir eklenmez bir saçılma sinyalinin aralık dışına çıkmasına neden olur. Bir dizi deneye başlamadan önce maksimum polimerizasyon için doğru sinyal amplifikasyonunu - dedektör yüksek voltajını - kurmak akıllıca olacaktır.
3. Bir veri toplama protokolü programlayın. 3.600 saniye süren zamana dayalı alımı seçin.
4. Bir floresan küveti su ve etanol ile dikkatlice temizleyin, gerekirse oda sıcaklığında su banyosunda 5 dakika sonikat. Bu protokolde 1 cm tabaka uzunluğuna ve 200 μl hacme sahip küvetler kullanılmış ve depolama solüsyonunda (%0,5-1 Hellmanex) saklanmıştır. Alternatif olarak tek kullanımlık UV uyumlu plastik küvetler (UVette, Eppendorf) kullanılabilir.
5. 300 μl için hesaplanan nihai konsantrasyon olarak 10 mM MgCl₂ ve 12 μM FtsZ ile polimerizasyon tamponunun 294 μl'lik bir ana karışımını (numune hazırlama noktası 1'e bakınız) ve girdap hazırlayın.
6. 196 μl polimerizasyon tamponunu küvete aktarın ve spektrometreye yerleştirin. 30 °C'de 2 dakika inkübe edin.
7. Veri alımını başlatın ve sinyalin kararlı olduğunu doğrulamak için 90 saniye bekleyin.
8. 200 μl'lik bir son reaksiyon hacmi elde etmek için 4 μl 100 mM GTP veya GDP (nihai konsantrasyon: 2 mM) ekleyin, karıştırmak ve alıma devam etmek için daha büyük hacimli bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.

6. Transmisyon Elektron Mikroskobu

1. FtsZ sedimantasyon testi için numuneleri hazırlayın (malzemeden tasarruf etmek için hacim 10 μl nihai hacme düşürülebilir).
2. İnkübasyon süresinden sonra, numunenin 2 μl'sini kızdırarak boşaltılan 400 gözenekli karbon kaplı bakır ızgaraya uygulayın, 15 saniye inkübe edin.
3. Izgaraya hafifçe dokunarak veya ızgarayı bir filtre kağıdına paralel veya dik olarak sürükleyerek kurulayın.
4. Izgarayı 4 μl% 2 uranil-asetat çözeltisi kullanarak boyayın. Izgarayı adım 6.3'te açıklandığı gibi kurulayın.
5. Izgarayı 120 kV'da 39.200X büyütmede çalışan bir Philips CM120 elektron mikroskobunda görüntüleyin.

7. GTP Hidroliz Testi

Deneyin kurulumu, FtsZ'nin GTP hidrolizi, reaksiyonun malakit yeşili ile karıştırılmasıyla çeşitli reaksiyon sürelerinden sonra durdurulacak şekilde tasarlanmıştır. Bu sayede malakit yeşilinin renk gelişim süresi her numune için aynıdır.

1. Polimerizasyon tamponlarından birinde 1,5 ml 2 mM GTP hazırlayın (bkz. numune hazırlama, madde 1).
   Bir polimerizasyon tamponunda 0-40 μM fosfat standart seyreltmesi hazırlayın ve POMG-25H (Biyo tahliller) kitinde açıklandığı gibi malakit yeşili çalışma reaktifi hazırlayın. Alternatif olarak, çalışma reaktifleri Lanzetta ve ark. tarafından açıklanan protokollere göre kurum içinde hazırlanabilir.¹⁶
2. Ana karışımları toplam 360 μl hacimde hazırlayın: ben 24 μM FtsZ_Bs, 20 mM MgCl₂, polimerizasyon tamponu ıı 12 μM FtsZ_Ec, 20 mM MgCl₂, polimerizasyon tamponu III (kontrol 1) 24 μM FtsZ_Bs, 2 mM EDTA, polimerizasyon tamponu IV (kontrol 2) 12 μM FtsZ_Ec, 2 mM EDTA, polimerizasyon tamponu
3. Ana karışımların 20 μl'lik alikotlarını, 100 μl fosfat standartlarını ve 180 μl 2 mM GTP'yi bir qPCR 96 oyuklu plakaya aşağıdaki sırayla pipetleyin: Bir B Ç D E F G H 1 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 2 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 3 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 4 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 5 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 6 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 7 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 8 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 9 Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps 10 Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps 11 12 GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası
   PS - fosfat standardı
4. qPCR plakasını, program 30 °C'de 40 dakikalık döngüye ayarlanmış bir PCR makinesine yerleştirin.
5. 96 oyuklu bir plakada 20 μl malakit yeşili çalışma reaktifi hazırlayın. Deneyden 60 μl polimerizasyon tamponunu 1'-8' şeritlerine ekleyin. Numune, fosfat standardına kıyasla 4 kat seyreltilecektir, lütfen son hesaplamalar sırasında bu gerçeği göz önünde bulundurun.

   	Bir	B	Ç	D	E	F	G	H
   1'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   2'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   3'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   4'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   5'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   6'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   7'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   8'	ııı	ııı	ben	ben	ıv	ıv	ıı	ıı
   9'	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps
   10'	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps	Ps

6. Şerit 1'e 20 μl GTP ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, zamanlayıcıyı başlatın (bu, 30 dakikalık reaksiyonun başlangıç zaman noktasıdır).
7. 10 dakika 30 saniye sonra GTP'yi şerit 2'ye ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (20 dakika reaksiyon).
8. 16 dakika sonra GTP'yi şerit 3'e ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (15 dakika reaksiyon).
9. 21 dakika, 30 saniye sonra GTP'yi şerit 4'e ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (10 dakika reaksiyon).
10. 25 dakika sonra GTP'yi şerit 5'e ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (7 dakika reaksiyon).
11. 27 dakika, 30 saniye sonra GTP'yi şerit 6'ya ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (5 dakika reaksiyon).
12. 29 dakika sonra GTP'yi şerit 7'ye ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (4 dakika reaksiyon)..
13. 30 dakika sonra 20 μl'yi şerit 1'den şerit 1'e aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (30 dakikalık reaksiyon için malakit yeşili renk gelişiminin başlangıç noktası).
14. 30 dakika sonra, 30 saniye sonra 20 μl'yi şerit 2'den 2'ye aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (20 dakikalık reaksiyon için malakit yeşil renk gelişiminin başlangıç noktası).
15. Her 30 saniyede bir 3-7 şeritleri için adımı tekrarlayın.
16. 33 dakika, 30 saniye sonra şerit 8'e 20 μl GTP ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve 20 μl'yi şerit 8'e aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (0 dakika reaksiyon ve reaksiyon için malakit yeşil renk gelişimi için başlangıç zaman noktası).
17. 34 dakika sonra şerit 9'dan 9'a 80 μl ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (fosfat standardı 1 için malakit yeşili renk gelişimi için başlangıç zaman noktası).
18. 34 dakika 30 saniye sonra 80 μl'yi şeritten 10' ila 10' aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (fosfat standardı 2 için malakit yeşili renk gelişimi için başlangıç zaman noktası).
19. Numunelerdeki tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve plakayı oda sıcaklığında 25 dakika 30 saniye daha inkübe edin.
20. Plakayı 96 oyuklu plaka okuyucuya yerleştirin.
21. 60 dakika sonra, plakayı her 30 saniyede bir 10x olarak 630 nm dalga boyunda ölçün (malakit yeşili renk gelişimi ilk reaksiyon için şimdi 30 dakikadır). Her ölçüm, 7.6-7.12 ve 7.16 adımlarındaki her zaman noktasına karşılık gelir ve veri analizi sırasında ayrı olarak hesaplanmalıdır.
22. Fosfat standart kalibrasyon eğrisini kullanarak her numunedeki serbest fosfatı hesaplayın.
23. Verileri zaman içinde Fosfat salınımı olarak çizin ve eğrinin doğrusal aralığından FtsZ GTP hidroliz aktivitesini hesaplayın.

Sonuçlar

FtsZ'nin farklı bakteri kaynaklarından saflaştırılması literatürde tanımlanmış ve Tablo 1'de özetlenmiştir.

kaynak yöntem değişiklik Elde edilen verim [mg / L kültür]> Başvuru B. subtilis 1) Amonyum sülfat çökeltme / iyon değişim kromatografisi Hayır 40 Bu eser, 11,15 2) Afinite kromatografisi Onun etiketi Nd 17 E. coli 1) Amonyum sülfat çökeltme / iyon değişim kromatografisi Hayır 35 Bu eser, 11,15 2) Kalsiyum çökeltme, iyon değişim kromatografisi Hayır 40 18 Methanococcus jannaschii 1) Denatüre etme koşulları altında afinite kromatografisi / yeniden katlama / amonyum sülfat çökeltme / jel filtrasyonu Onun etiketi 1.3 19 2) Afinite kromatografisi / jel filtrasyonu Onun etiketi Nd 20 Thermotoga maritima İyon değişim kromatografisi/jel filtrasyonu Hayır 6,7 19 Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) Afinite kromatografisi/jel filtrasyonu Strep-tag, His-tag Nd 21 Mikobakteri tüberkülozu 1) Afinite / iyon değişim kromatografisi Hayır Nd 22 2) Afinite kromatografisi / jel filtrasyonu Hayır 30 23 Aquifex aeolicus Afinite kromatografisi/jel filtrasyonu His-etiketi, C-terminali kesme (331-367) Nd 24 Caulobacter crescentus (Caulobacter hilesi) İyon değişim kromatografisi / amonyum sülfat çökeltme / jel filtrasyonu Hayır Nd 25

Tablo 1. FtsZ saflaştırma protokolleri açıklanmıştır. ND: Belirlenmedi.

FtsZ polimerlerinin çökeltilmesi

Başlangıçta, FtsZ polimerlerini döndürmek için iki farklı hız kullandık. Sadece 350.000 x g'lık bir hızda FtsZ_Ec'in tek polimerlerinin döndürüldüğünü (Şekil 1), 190.000 x g'da ise pelet fraksiyonunda sadece FtsZ B demetlerinin bulunduğunu bulduk (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, daha sonraki deneylerimizde 350.000 x g kullanıldı. Polimerize FtsZ_Ec ve FtsZ_B'lerin yüzdesi, ışık saçılma deneyleri FtsZ_B'ler için çok daha yüksek bir saçılma sinyali ortaya çıkarmasına rağmen, 50 mM KCl'de benzerdir. Bunun nedeni, FtsZ_Ec'in tek polimerlerinden daha fazla ışık saçan FtsZ_B'ler tarafından oluşturulan demetlerdir. Hem FtsZ_Ec hem de FtsZ_Bs için 300 mM KCl ile yapılan deneyde pelet fraksiyonunda yüksek miktarda FtsZ polimeri elde etmek mümkün olmamıştır (Şekil 1). Bunu, FtsZ yapılarının hızlı bir şekilde sökülmesi ve filamentlerin demetlenmesinin azalmasının bir kombinasyonuna bağlıyoruz.

FtsZ-SepF tübüllerinin sedimantasyonu

FtsZ'nin belirli aktivatörlerle etkileşimini analiz etmek için sedimantasyon testleri daha düşük santrifüjleme hızlarında gerçekleştirilebilir. Bu hızda sadece büyük FtsZ yapıları peletlenebilir, örneğin SepF halkaları ve FtsZ_Bs filamentleri⁵ tarafından oluşturulan büyük tübüller veya FtsZ ve ZapA tarafından oluşturulan demetler. FtsZ ve SepF tarafından oluşturulan tübüller için bu yaklaşımın fizibilitesini göstermek için daha düşük santrifüjleme (24.600 x g) kullandık. FtsZ, yalnızca numunede hem SepF hem de GTP mevcut olduğunda (Şekil 2) arka plan seviyelerinin üzerindeki pelette geri kazanıldı ve SepF'nin varlığı, FtsZ GTPase aktivitesi^7'yi etkilemez, bu da FtsZ'nin SepF varlığında tamamen aktif olduğunu gösterir. SepF ve FtsZ'nin spesifik sedimantasyonu, toplam SepF'nin kabaca E'i ve toplam FtsZ'nin 'idir (GSYİH eklendiğinde malzeme sedimantasyonuna kıyasla). Bu, SepF-FtsZ tübüllerinin FtsZ'den daha fazla SepF içerdiğini gösterir. Bunun nedeni, birçok SepF halkasının FtsZ-SepF tübüllerini^5,7 düzenlemesi olabilir. Bu tübüllerde SepF-FtsZ'nin kesin stokiyometrisi bilinmemektedir, ancak sonuçlarımız FtsZ'den daha fazla SepF bulunduğunu göstermektedir.

FtsZ_Ec ve FtsZ_Bs polimerizasyon ve demetleme özellikleri

Farklı tamponlarda FtsZ_{, Bs} ve FtsZ_Ec'in polimerizasyon verimliliğini karakterize etmek için her iki proteini de 90° açılı ışık saçılımı ile analiz ettik. 50 mM KCl'de FtsZ Bs, tampon_pH'ına bağlı olarak FtsZ_Ec'den 20-40 kat daha yüksek bir ışık saçılma sinyali verir (Şekil 3A ve B) Buske ve ark.'nın sonuçlarını doğrular. ²⁶ Tampondaki KCl konsantrasyonunun arttırılması, FtsZ_Ec'in ışık saçılma sinyalini önemli ölçüde etkilemedi (Şekil 3D), ancak FtsZ_B'lerin sinyali, 50 mM KCl'li tamponlara kıyasla pH 7.5'te ~80 kat, pH 6.8'de ~30 kat ve pH 6.5'te ~45 kat azaldı (Şekil 3C) (Şekil 3A). FtsZ polimerlerinin sökülmesi, her iki protein için daha yüksek KCl konsantrasyonunda daha hızlıdır (Şekil 3C ve D). Pacheco-Gómez ve ark. E. coli FtsZ polimerizasyonunun ve demetlenmesinin pH'a bağlı olduğunu gösterin. Bu yazarlar, 50 mM KCl'lik bir tamponda FtsZ polimerizasyonunun ışık saçılma sinyalinin daha yüksek olduğunu ve FtsZ'nin sökülmesinin pH 6.0'da pH 7.0 ^8'e kıyasla daha uzun sürdüğünü bulmuşlardır. Bu sonuçlar, FtsZ_Ec'in 50 mM KCl'de polimerizasyonundan elde edilen verilerimizle uyumlu değildir (Şekil 3B), ancak Pacheco-Gómez ve ark. sadece MES kullanılır. Bu nedenle, sadece pH değil, aynı zamanda tampon bileşimi (iyonik kuvvet) 50 mM KCl'de FtsZ polimerlerinin kinetiğini etkiler. Bununla birlikte, 300 mM KCl'de ne tampon bileşimi ne de pH,_{FtsZ Ec} düzeneğini tespit edilebilir bir şekilde etkilememiştir.

Bu koşullar altında proteinin çökelmesi nedeniyle FtsZ_B'lerin KCl'siz tamponlarda hafif saçılma deneyi mümkün değildi. FtsZ_{B'lerin konsantrasyonu 3 μM'ye} düşürüldüğünde yağış meydana gelmedi. Bununla birlikte, 3 μM, hücredeki FtsZ'nin fizyolojik konsantrasyonu değildir. Plastik küvetlerde, FtsZ_B'ler pH 7.5'te 12 μM'de çökelmedi, ancak pH 6.8 ve 6.5 FtsZ'de KCl yokluğunda hala çökeldi.

E. coli ve B. subtilis'ten FtsZ yapılarının morfolojileri

FtsZ tarafından oluşturulan yapılar TEM tarafından denetlendi. FtsZ_B'ler, düşük tuzda tüm tamponlarda tüm ızgarayı kaplayan yakından sıkıştırılmış polimerler halinde birleştirildi (Şekil 4A-C). FtsZ_Ec, düşük tuzda tüm tamponlarda uzun filamentler, kablolar ve demetler oluşturdu (Şekil 4D-F). Bununla birlikte, FtsZ_Ec tarafından oluşturulan gözlemlenebilir polimer miktarı, FtsZ_Bs tarafından oluşturulan miktardan daha düşüktü. Yüksek tuz tamponlarında, FtsZ_B'ler, demetler halinde birleşmeyen daha uzun tek sarmallı protofilamentler oluşturdu (Şekil 4G-I). FtsZ_Bs protofilamentleri daha yüksek tuz konsantrasyonunda yapı değiştirirken, FtsZ_Ec, düşük tuz tamponununkinden ayırt edilemeyen yapılar oluşturdu (Şekil 4J-L). FtsZ_Ec'in polimerizasyonu üzerinde gözlemlenebilir bir pH etkisi yoktu, ancak FtsZ_Bs, pH 6.5'te yakından sıkıştırılmış polimerler ve tabakalar olarak görülebilen daha fazla demet oluşturur (Şekil 4B). Bu sonuçlar, ışık saçılma deneylerimiz ve daha önce yayınlanmış TEM çalışması^8,11,26 ile uyumludur.

Yüksek ve düşük KCl konsantrasyonlarında FtsZ'nin GTPase aktivitesi

FtsZ'nin GTP hidroliz aktivitesi, serbest fosfat için kolorimetrik bir test kullanılarak farklı koşullar altında ölçüldü. Daha önce bildirildiği gibi¹⁵ FtsZ'nin GTPaz aktivitesi, artan KCl konsantrasyonu ile artmıştır: kullanılan tampona bağlı olarak FtsZ_Bs. 3-7 kat artış gösterdi ve FtsZ_Ec, 50 mM KCl'ye kıyasla 300 mM KCl'de GTPase aktivitesinde 1.5-2.5 kat artış gösterdi. 50 mM KCl'de azalan GTPase aktivitesi, FtsZ_Bs filamentlerinin demetlenmesinden kaynaklanmaktadır. 50 mM KCl'de FtsZ Ec, FtsZ_Ec polimerlerinin daha hızlı sökülmesi nedeniyle FtsZ_B'lerden 3-6 kat daha yüksek GTPase aktivitesine sahipti. FtsZ Bs ve FtsZ_Ec arasındaki GTP hidroliz aktivitesindeki fark, muhtemelen FtsZ_Bs filamentlerinin demetlenmesinin azalması nedeniyle 300 mM KCl'de azalmıştır (Şekil 5).

Şekil 1. Sedimantasyon ile FtsZ polimerizasyonunun miktar tayini. (A) 12 μM FtsZ, pH 7.5 (siyah çubuklar), 6.8 (gri çubuklar) veya 6.5 (beyaz çubuklar) 'da 2 mM GTP veya GDP varlığında polimerize edildi. Peletlenen protein miktarı, Coomassie lekeli jellerin dansitometrik analizi ile belirlendi. GSYİH, belirli bir sedimantasyon için bir kontrol görevi gördü ve GDP ile çökelen FtsZ yüzdesi, grafikte çizilen değerleri elde etmek için GTP ile çökelen FtsZ yüzdesinden çıkarıldı. Solda: 50 mM KCl'de çökelmiş FtsZ, sağda: 300 mM KCl'de çökelmiş FtsZ. (B) Coomassie lekeli jellerden elde edilen temsili sonuçlar. FtsZ_B'lerin (üst jel) ve FtsZ_Ec'nin (alt jel) 50 mM KCl'de polimerizasyonu. (S) süpernatant, (P) deneyden elde edilen pelet fraksiyonları. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. SepF/FtsZ tübüllerinin düşük hızda sedimantasyonu. (A) 12 μM FtsZ_Bs, 2 mM GDP (beyaz çubuklar) veya GTP (siyah çubuklar) ile polimerize edildi. Peletlenen protein miktarı, Coomassie lekeli jellerin dansitometrik analizi ile belirlendi. X ekseninin altındaki + ve - işaretleri, reaksiyonda FtsZ ve SepF'nin varlığını veya yokluğunu gösterir. (B) Coomassie lekeli bir jelden elde edilen temsili sonuçlar. SepF varlığında ve yokluğunda FtsZ_B'lerin polimerizasyonu. Kontrol olarak FtsZ'siz SepF kullanıldı. Polimerizasyon GTP ve GSYİH ile gerçekleştirilmiştir. (S) süpernatant, (P) deneyden elde edilen pelet fraksiyonları. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3. 12 μM FtsZ_Ec ve 12 μM FtsZ_Bs'nin ışık saçılımı. FtsZ'ler 2 mM GTP varlığında monte edildi ve polimerizasyon 90° açılı ışık saçılımı ile izlendi. pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5'te 50 mM KCl'de FtsZ_Bs (A) ve FtsZ_Ec (B)'nin polimerizasyonu. pH 7.5, pH 6.8 ve pH 6.5'te 300 mM KCl'de FtsZ_Bs (C) ve FtsZ_Ec (D) polimerizasyonu. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4. Elektron mikroskobu ile görüntülenen FtsZ_Bs ve FtsZ_Ec polimerlerinin yapıları. (A-L) 2 mM GTP ile polimerize edilmiş 12 μM FtsZ_Bs (AC ve G-I) ve FtsZ_Ec (DF) ve (JL) görüntüleri. (A-C) FtsZ_B'ler sırasıyla 50 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 ile tampon halinde. (D-F) FtsZ_Ec, sırasıyla 50 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 ile tampon içinde. (G-I) FtsZ_B'ler sırasıyla 300 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 ile tampon halinde. (J-L) FtsZ_Ec, sırasıyla 300 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 ile tampon içinde. Ölçek çubuğu: 100 nm. Resmi daha büyük görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5. 6 farklı tamponda FtsZ polimerizasyonu sırasında GTP hidrolizi. Tüm deneylerde 2 mM GTP kullanılmıştır. Kontrol numunesi olarak MgCl içermeyen bir örnek olarak₂ kullanılmıştır. MgCl₂ olmadan FtsZ'nin aktivitesi, MgCl₂ varlığında FtsZ'nin aktivitesinden çıkarıldı. Solda: 50 mM KCl'de FtsZ'nin GTPase aktivitesi, sağda: 300 mM KCl'de FtsZ'nin GTPase aktivitesi. Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın.

Tartışma

FtsZ aktivitesinin ve diğer proteinlerle etkileşiminin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlayan bir dizi yöntem açıklıyoruz. Işık saçılımı, sedimantasyon ve GTPaz tahlillerinin yanı sıra elektron mikroskobu, FtsZ polimerizasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut protokollerde bazı iyileştirmeler yaptık, farklı koşulların FtsZ montajı üzerindeki etkisini gösterdik ve FtsZ çalışmalarına dahil edilmesi gereken kontroller öneriyoruz.

FtsZ ve etkileşen proteinleri arasındaki ilişkinin oluşturduğu büyük yapıları FtsZ polimerlerinden ayırt etmek için düşük hızlı santrifüjlemeyi tanıtıyoruz. Bu yöntem, standart sedimantasyon testine göre iki avantaj gösterir. İlk olarak, 24.600 x g'da döndürülmedikleri için pelet fraksiyonunda FtsZ polimerleri tarafından herhangi bir arka plan oluşturulmaz. İkincisi, etkileşen bir protein ile oluşturulan yapıda bulunan FtsZ miktarı jelden hesaplanabilir. Bu yöntemdeki iki kritik adım, inkübasyon süresi ve GTP konsantrasyonudur. Büyük protein yapısını tamamlandığında, ancak tüm GTP hidrolize edildiğinde parçalanmadan önce santrifüjlemek önemlidir. Bu çalışma için en iyi kontrol, FtsZ'nin GSYİH ile polimerizasyonudur. Testin potansiyel bir sınırlaması vardır. FtsZ, SepF ile 24.600 x g'da kolayca döndürülebilen kararlı bir kompleks oluşturur. Başka bir aktivatör veya FtsZ polimerlerini bir araya getiren bir ilaçla sedimantasyon yapılırsa, testin uyarlanması gerekebilir. İnkübasyon süresini değiştirerek veya santrifüjleme hızını artırarak yapılabilir.

Işık saçılımı deneyleri için numunenin uygun şekilde hazırlanması en önemlisidir. Proteinler döndürülerek önceden temizlenmeli ve kullanımdan önce tüm tamponlar filtrelenmelidir. Numunede herhangi bir agrega varsa, bunlar FtsZ polimerlerinden elde edilen kararlı bir sinyali bozacaktır. FtsZ yapılarının elektron mikroskobu ile analizi için bir ızgaranın hazırlanması ana adımdır. Izgara üzerinde numune inkübasyon süresi, az ya da çok sıkıştırılmış polimerler üretme etkisine sahip olacaktır. FtsZ_B demetleri için inkübasyon süresi, yüksek KCl konsantrasyonunda FtsZ_Ec ve FtsZ_B'lerden daha kısa olmalıdır. Sonuçları karşılaştırabilmek için her numune için 12 μM'lik bir konsantrasyon kullandık. Bununla birlikte, 50 mM KCl'de FtsZ_Bs için daha düşük bir FtsZ konsantrasyonu kullanılmalıdır, çünkü 12 μM ızgaranın tam doygunluğuna neden olur. Bu, polimerleri oldukça sıkıştırılmış ve tespit edilmesini zorlaştırır. Daha az sıkıştırılmış polimerlerin EM'de tespit edilmesi daha iyidir.

GTPase testi, FtsZ'nin yapılarından ziyade aktiviteyi incelemek için kullanılan tek deneydir. FtsZ polimerlerinde GTP devri için^Mg2+ gereklidir. Bu nedenle,^Mg2+ yokluğunda FtsZ, GTP'yi hidrolize etmez. Bu nedenle,^Mg2+ içermeyen bir numune bu tahlilde doğru kontroldür, ancak FtsZ depolama tamponunda Mg katyonları mevcuttur. Kontrol örneğine 1 mM EDTA eklenerek çıkarılabilirler. Bu tahlildeki kritik adım inkübasyon süresidir. Belirli bir süre sonra FtsZ aktivitesini durdurmak önemlidir. Bu, FtsZ numunesinin 96 oyuklu bir plakadaki malakit yeşili çözeltisine aktarılmasıyla elde edilir. Ancak malakit yeşili renginin gelişimi sürekli bir süreçtir. Bu nedenle ölçümler her numune için aynı anda yapılmalıdır. Her 30 saniyede bir belirlenmiş bir sırayla alınan ölçümlerle iyi planlanmış bir GTP ekleme protokolü kullanarak, her zaman noktası için aynı inkübasyon ve numune işleme süresini elde etmek mümkündür. Bir diğer kritik adım, deney için protein konsantrasyonunun seçilmesidir. Deneyde FtsZ_Ec ve FtsZ Bs için iki farklı konsantrasyon_kullandık. GTP hidrolizi, FtsZ_Bs'ye kıyasla FtsZ_Ec için çok daha hızlıdır. FtsZ_Ec'nin seçilen koşullar altında ve 12 μM'de GTPaz aktivitesi sadece maksimum 5 dakika boyunca doğrusaldır ve bu süreden sonra hidroliz hızı platolardır. Bu nedenle, bu koşullar altında gerçekleştirildiğinde deneyden elde edilen verileri yorumlamak zordur. Bu durumda FtsZEc, her iki proteinin aktivitelerini karşılaştırabilmek için FtsZ_Bs'den daha düşük konsantrasyonda kullanılmalıdır. Farklı kaynaklardan gelen FtsZ'lerin GTPaz aktivitesi değişebilir. Bu nedenle, doğru konsantrasyon seçilmelidir. FtsZ polimerizasyonu için konsantrasyon, kritik konsantrasyonun oldukça üzerinde olmalıdır (genel olarak 2.5-10 μM). FtsZ montaj ve demontaj dinamikleri de önemlidir. Bazı proteinler, 50 mM KCl'de FtsZB'ler için gösterildiği gibi, GTP ilavesinden sonra polimerizasyonda önemli bir gecikme gösterir. FtsZ polimerlerinin montaj ve demontaj süresini yaklaşık olarak tahmin etmek için GTPase testinden önce ışık saçılma testinin yapılması yararlıdır. Bundan sonra, inkübasyon zamanı ve protein konsantrasyonu seçilebilir. FtsZ polimerizasyonu için seçilen koşullar çok önemli olduğundan, her yöntemde doğru pH ve KCl konsantrasyonunun kullanılması önemlidir. Bu çalışmada, pH'ı 6.5-7.5 arasında değişen ve KCl konsantrasyonları 0 M ila 300 mM arasında değişen 9 farklı tampon üzerinde çalıştık. FtsZ'leri analiz etmek için en iyi koşulun B. subtilis ve E.coli ve biyolojik aktiviteleri, yüksek bir KCl konsantrasyonu ile birlikte fizyolojik seviyeye (7.5) yakın pH'ta olduğunu fark ettik. Yüksek bir KCl konsantrasyonunda, FtsZ daha yüksek bir GTPaz aktivitesine sahiptir ve elektron mikroskobu ile daha iyi tespit edilebilen polimerler üretir. Ayrıca, fizyolojik pH ve yüksek KCl konsantrasyonunun, FtsZ ve düzenleyici proteinler arasındaki etkileşimin incelenmesi için, çoğunlukla FtsZ düzeneğini incelemek için kullanılan diğer tamponlardan daha iyi olduğunu doğruladık. FtsZB'ler, yüksek KCl konsantrasyonunda çalışıldığında FtsZEc'ye benzer bir aktivite gösterir. Ek olarak, düşük tuz konsantrasyonunda pH'ın etkisi, yüksek tuz konsantrasyonuna sahip tamponlara göre daha belirgindir. FtsZ bazen KCl içermeyen tamponlar kullanıldığında çökelir, sonuç olarak tuzsuz tamponlardan kaçınılmalıdır. Yüksek KCl konsantrasyonlarına sahip tamponlar kullanıldığında FtsZ polimerlerinin çökelmesi düşüktür. Bu, FtsZ ile SepF ve ZapA gibi FtsZ filamentlerini birleştiren proteinler arasındaki etkileşimleri incelerken bir avantaj olabilir, çünkü bu yüksek dereceli yapıların santrifüjleme ile tespit edilmesi kolaydır. Tüm deneylerimizde 10 mM konsantrasyonda MgCl₂ kullandık. Nispeten yüksek bir^Mg2+ konsantrasyonunun FtsZ polimerlerini stabilize ettiği ve FtsZ'nin GTPaz aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Tablo 2'de, çeşitli çalışmalardan elde edilen sonuçlar, aksi takdirde aynı tampon koşulları ²⁷ kullanılarak farklı^Mg2+ konsantrasyonlarında FtsZ polimerizasyonunu ve GTPaz aktivitesini açıklayan özetlenmiştir. Ölçülen serbest sitoplazmik^Mg2+ konsantrasyonu 0.9^mM3'tür. GTP'nin eşdeğer miktarda^Mg2+ şelatlayacağına dikkat edilmelidir. Bu nedenle, GTPaz deneyleri için optimal^Mg2+ konsantrasyonu, fizyolojik seviye^3'e yakın olan 2-2.5 mM civarındadır. Bununla birlikte, deneylerimizde kullandık MgCl₂ kolayca tespit edilebilir bir ışık saçılım sinyali elde etmek ve sedimantasyon testi sırasında FtsZ polimerlerini stabilize etmek için 10 mM konsantrasyonda.

Protokollerimizi model organizmalardan FtsZ'ye uygulamış olsak da E. koli ve B. subtilis, başka herhangi bir organizmadan FtsZ'ye uyarlanabilirler. Fizyolojik pH'ın ve tek değerlikli ve iki değerlikli katyonların konsantrasyonlarının organizmalar arasında farklılık gösterdiğine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, FtsZ polimerizasyonu için en uygun koşullar değişebilir. Farklı bakterilerin ikiye katlanma süresi ve büyüme koşullarındaki farklılıklar, FtsZ'nin farklı montaj kinetiğine ve deneylerin optimal koşullarına neden olabilir. Bununla birlikte, protokolümüz, diğer organizmalardan FtsZ'lerle yapılan deneyler için iyi bir başlangıç noktası sağlar. Protokoller, düzenleyici proteinlerle FtsZ'nin incelenmesi veya küçük bileşiklerin ve ilaçların FtsZ üzerindeki etkilerinin incelenmesi için faydalı olmalıdır.

Kaynak	Polimerizasyon [çökelmiş FtsZ'nin %'si]	GTPase [Pi/FtsZ/dak]	Mg2+ konsantrasyon [mM]	FtsZ konsantrasyonu [μM]	Başvuru
FtsZEC	~ %28	~ 2.1	10	12	Bu çalışma
	~ %50	~ 2.4	10	12.5	27
	~ %43	~ 3.5	5	12.5	27
	~ %27	~ 4.6	2.5	12.5	27
	ND	~ 5.4	2.5	5	26
FtsZBs	~ %30	~ 0.8		12	Bu çalışma
	~ %52 (DEAE dekstran ile)	~ 0.5	10	10	11
	ND	~ 2.25	2.5	5	26

Tablo 2. ^Mg2+ 'nın FtsZ polimerizasyonu ve GTPaz üzerindeki etkisi. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, yayınlanan verilerle karşılaştırıldı. Tüm deneyler 50 mM MES/ NaOH, pH=6.5, 50 mM KCl'de gerçekleştirildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
GTP	Roche	10106399001	Bölüm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Kalın Duvar Polikarbonat Tüpler	Beckman Coulter	343776	Bölüm 2
Optima MAX-XP Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	393315	Bölüm 2, 3
Geçmeli Kapaklı Poliallomer Tüp	Beckman Coulter	357448	Bölüm 3
AIDA Biyo-paket, 1D, 2D, FL	Işın Testi İzotopenmessgerä te GmbH	15000001	Bölüm 4
Lüminesans Görüntü Analiz Cihazı LAS-4000	Fujifilm		Bölüm 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Lüminesans Spektrometresi	Spectronic Instruments		Bölüm 5
Floresan Hücre	Hellma Analytics	105-250-15-40	Bölüm 5
Kare 400 Mesh, Bakır, 100/flakon	Elektron Mikroskobu Bilimleri	G400-Cu	Bölüm 6
CM120 Elektron Mikroskobu 120 kV'da Çalışıyor	Philips		Bölüm 6
96 ml x 0.2 ml Plaka	BIOplastics	B70501	Bölüm 7
Malakit Yeşil Fosfat Test Kiti	BiyoTest Sistemi	POMG-25H	Bölüm 7
PowerWave HT Mikroplaka Spektrofotometresi	BioTek		Bölüm 7