Yöntem makalesi

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

15.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50844

⸱

16 Kasım 2013

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

Bu makalede

Özet

FtsZ'nin polimerizasyonu bakteri hücre bölünmesi için gereklidir. Bu raporda, FtsZ polimerizasyon aktivitesini izlemek ve tampon bileşiminin etkisini tartışmak için basit protokolleri detaylandırıyoruz. Protokoller, FtsZ'nin FtsZ polimerizasyonunu etkileyen düzenleyici proteinler veya antibakteriyel ilaçlarla etkileşimini incelemek için kullanılabilir.

Özet

Bakteriyel hücre bölünmesi esnasında, esas teşkil eden protein FtsZ sözde Z-halka oluşturmak için hücre ortasında toplanır. FtsZ in vitro GTP varlığında, uzun lifler halinde polimerize ve polimerizasyon çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yaygın ışık saçılımı, sedimantasyon, GTP hidroliz deneyleri ve elektron mikroskopi dahil olmak üzere temel yöntemler kullanılarak in vitro incelenmiştir. Tampon koşullar etkisi de her iki FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinlerle etkileşime FtsZ yeteneği. Burada, biz FtsZ polimerizasyon çalışmalar için protokol tanımlamak ve model proteinler olarak Escherichia coli ve Bacillus subtilis FtsZ kullanarak koşulları ve denetimleri doğrulamak. Bir düşük hızlı çökelme tahlili FtsZ polimerleri paket ya tubulate proteinlerle FtsZ etkileşimi çalışma sağlayan sokulur. Geliştirilmiş bir GTPaz deney protokolü test edilmesine olanak tarif edilmektedirfosfat saptama tepki olarak renk gelişimi varyasyonu kaldırılması standart enkübasyon süreleri ile 96 oyuklu bir plaka kurulumu, çeşitli koşullar kullanılarak, zaman içinde GTP hidrolizinin. Işık saçılması çalışmaları ve elektron mikroskopisi için numunelerin hazırlanması tarif edilmektedir. Çeşitli tamponlar FtsZ polimerizasyon çalışmalar için uygun tampon ve pH, tuz konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır. KCl yüksek bir konsantrasyonu, deneylerin büyük bir kısmında en iyisidir. Bizim yöntemleri E. değil sadece FtsZ in vitro karakterizasyonu için bir başlangıç ​​noktası sağlar coli ve B. subtilis ama başka bir bakteriden. Bu nedenle, bu buluşun metodları düzenleyici proteinler veya FtsZ polimerizasyonu etkileyen antibakteriyel ilaçların test ile FtsZ etkileşimi çalışmaları için kullanılabilir.

Giriş

Esansiyel bakteriyel protein FtsZ bakteriyel hücre bölünmesi makine en iyi karakterize edilmiş bir proteindir. FtsZ tubulin prokaryotik homolog olan ve bir GTP bağlı bir şekilde, in vitro olarak polimerize eder. FtsZ bakteri 1,2 onun korunmuş doğası ve teklik nedeniyle yeni antibiyotik için çok cazip bir hedeftir. Hücre bölünmesi başında, FtsZ diğer hücre bölünmesi proteinlerin montajı için bir yapı iskelesi olarak hizmet midcell bir cytokinetic halka oluşturur. Z-halka oluşumu bölme düzlemi doğru lokalizasyonu için çok önemlidir. FtsZ montajı dinamikleri gibi Minc, SepF, Zapa, UgtP, ve Ezra 2 (bakteri türlerine bağlı olarak) gibi çeşitli aksesuar proteinler tarafından düzenlenir. FtsZ polimerizasyon yoğun in vitro ve protofilaments düz, kavisli protofilaments, filament levha, filaman demetleri ve filament tüpler dahil olmak üzere, pek çok farklı yapılarda incelenmiştir des olmuşturmontaj tampon, nükleotid ve deneyde 3 dahil ek protein bağlı cribed. Caulobacter crescentus elektron cryotomography deneyler Z-halkası geniş 4 donatılacak olmadan nispeten kısa, kesintili tek protofilaments monte edilir olduğunu göstermektedir rağmen in vivo FtsZ protofilaments mimarisi henüz tam olarak anlaşılmış değildir.

İn vitro olarak, FtsZ polimerizasyon özellikleri ve düzenleyici proteinleri ile FtsZ etkileşimi reaksiyon tampon bileşimine duyarlıdır. Örneğin, son zamanlarda FtsZ C-terminüsünde SepF için etkileşim sitesi tarif edilen ve bir FtsZ Δ16 arasında C-terminal kesik artık SepF 5 bağlandığını göstermiştir. SepF-FtsZ İşletmeleri etkileşim önceki bir çalışmada, benzer bir FtsZ İşletmeleri Δ16 hala SepF FtsZ üzerinde ikincil bir siteye bağlanan önerdi SepF ile cosedimented kesilmesinden 6. Bu çalışmalar arasındaki fark, pH 6.5 'te cosedimentation yoktu, oysa FtsZ kesik ile SepF hiçbir cosedimentation vardı, tepkime tampon-at pH 7.5 terkibiydi. Gündoğdu et al. SepF fonksiyonel değildir ve pH 6.5 'de görülen cosedimentation FtsZ Δ16 arasında C-terminal kesik ile SepF çökelmesi yerine etkileşimin neden olması muhtemel olduğunu gösteren, pH 6.5 7 çökeltilerini kaydetti. FtsZ polimerizasyonu pH ve KCl konsantrasyonunun etkisi daha önce incelenmiştir. E. polimerleri pH 6.5 coli FtsZ (FtsZ Ec) daha uzun ve daha bol nötr pH 8,9 oluşmuş daha vardır. Tadros et al. K + bağlayıcı FtsZ Ec polimerizasyonu ile bağlantılı ve FtsZ aktivitesi 10 için çok önemli olduğunu belirterek tek değerli katyonların mevcudiyetinde FtsZ Ec polimerizasyonunu inceledik. PH daha critica olduğuSepF önceki örnek ve FtsZ 11 MINC inhibitör etkisinin pH bağımlılığı ile gösterildiği gibi diğer proteinler ile FtsZ etkileşimi, incelenmiştir l. PH ve tuz konsantrasyonu hem de diğer proteinler ile FtsZ etkileşimini etkileyebilir gibi, bu FtsZ polimerizasyon çalışmaları için doğru koşulları ve kontrolleri seçmek önemlidir.

Burada ışık saçılması, elektron mikroskobu, sedimantasyon ve GTPaz deneyleri ile FtsZ polimerizasyonu ve GTPaz aktivitesini incelemek için protokolleri açıklanmıştır. Sağ açılı ışık dağılımı gerçek zamanlı 12 FtsZ polimerizasyon okumak için standart bir yöntemdir. Biz sedimantasyon ve GTPaz tahlil için birkaç iyileştirmeler tanıttı. Biz ışık saçılması ve elektron mikroskobu için numune hazırlamak için nasıl ayrıntılı olarak mevcut. FtsZ polimerizasyonu çalışma literatürde kullanılan çeşitli tamponlar test ve her deney için en iyi şartları tarif edilmiştir. Biz de olmalıdır kontrol eden göstermeken iyi veri elde etmek tanıttı.

Bu yöntemler FtsZ polimerizasyon aktivitesi ve basit bir yöntem ve en laboratuvarlarda mevcuttur ekipman kullanılarak başka proteinlerle etkileşim hızlı bir çalışma sağlar. FtsZ polimerizasyonu incelemek için daha sofistike yöntemler var ama genellikle floresan etiketleri 8,13,14 ile daha özel ekipmana erişim ve / veya FtsZ değiştirilmesini gerektirir. Bu yazıda anlatılan basit yöntemler B. FtsZ kullanılarak gösterilmektedir subtilis ve E. coli, en yaygın Gram + ve Gram-model organizmalar. Protokoller başka FtsZ proteine ​​uyarlanabilir. Bu yeni FtsZs, zaman ile ilgili olarak küçük değişiklikler, tampon veya inkübasyon sıcaklığı ile ön deneylere dayalı olarak bir optimum bir sonuç için gerekli olabilir. Burada açıklanan deneyler bu en uygun koşulları bulmakta yardımcı olmalıdır.

Protokol

Etiketlenmemiş FtsZ proteinleri daha önce tarif edildiği gibisaflaştırıldı 11,15, 20 mM Tris/ HCl (pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2.5 mM MgAc ve %10 gliserole karşı diyalize edildi ve -80 °C'de saklandı. Bu koşullar altında, protein önemli bir aktivite kaybı olmadan 2 yıldan fazla bir süre saklanabilir. Protein, numunenin çözülmesini ve donmasını önlemek için 100 μl'lik alikotlarda saklanmalıdır. Çözüldükten sonra numune en fazla bir hafta boyunca 4 °C'de tutulabilir. FtsZ yüksek konsantrasyonlarda çözünür ve 7-10 mg / ml'de saklanabilir. Daha sonraki deneylerde depolama tamponu bileşenlerinin istenmeyen etkilerinden kaçınmak için protein konsantrasyonunu yüksek tutmak önemlidir. Bu nedenle, depolama konsantrasyonu, gliserol konsantrasyonunu% 1'in altına getirmek ve reaksiyon karışımındaki diyaliz tamponunun diğer bileşenlerinin konsantrasyonunu en aza indirmek için en az 10x'lik bir FtsZ seyreltmesine izin vermelidir. FtsZ polimerizasyonu, yüksek sodyum9 veya imidazol konsantrasyonlarının varlığından da etkilenebilir, bu nedenle bu bileşenlerin polimerizasyon tamponundan çıkarılması gerekir. SepF, tarifedildiği gibi 7 saflaştırıldı ve -80 ° C'de elüsyon tamponunda saklandı. FtsZ'nin E. coli ve B. subtilis'ten saflaştırılması için alternatif yayınlanmış prosedürlerin yanı sıra farklı kaynaklardan FtsZ'nin saflaştırılması için prosedürlere yapılan atıflar Tablo 1'de özetlenmiştir (temsili sonuçlar bölümüne bakınız).

1. Numune Hazırlama

  1. Polimerizasyon tamponları hazırlayın: 1 50 mM Hepes / NaOH, pH 7.5 2 25 mM BORULAR/ NaOH, pH 6.8 3 50 mM MES/ NaOH, pH 6.5 4 50 mM Hepes / NaOH, pH 7.5; 50 mM KCl 5 25 mM BORULAR/ NaOH, pH 6.8; 50 mM KCl 6 50 mM MES / NaOH, pH 6.5; 50 mM KCl 7 50 mM Hepes / NaOH, pH 7.5; 300 mM KCl 8 25 mM BORULAR/ NaOH, pH 6.8; 300 mM KCl 9 50 mM MES/ NaOH, pH 6.5; 300 mM KCl
  2. Filtre: 22 μm'lik bir membran filtre kullanarak tüm tamponları sterilize edin.
  3. (100)'den her polimerizasyon tamponunda 2 mM GTP, GDP veMgCl 1 stok çözeltileri hazırlayın.
  4. Tüm deneyler için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 100.000 x g'da döndürerek proteinleri önceden temizleyin.

2. FtsZ Sedimantasyon Testi

  1. Yüksek hızlı santrifüjleme ile uyumlu tüplerde polimerizasyon tamponlarından birine (numune hazırlama noktası 1'e bakınız) MgCl2 ve FtsZ ekleyerek reaksiyon karışımını hazırlayın. Toplam hacim 49 μl, MgCl2 10 mM'de ve FtsZ 12 μM'de 50 μl nihai hacimde olmalıdır.
  2. Tüpü çalkalama işlevine sahip bir inkübatöre yerleştirin, 30 ° C'de 300 rpm'de 2 dakika inkübe edin (alternatif olarak numune hafifçe vurulabilir ve kısa bir süre mikrofüje edilebilir, ardından 30 ° C'de ön ısıtma yapılabilir).
  3. Deneyde kullanılanla aynı tampona 1 μl GTP veya GDP stok çözeltisi ekleyerek polimerizasyona başlayın (nihai konsantrasyon 2 mM). 30 °C'de 300 rpm'de (veya çalkalama fonksiyonlu bir inkübatörde) 10 veya 2 dakika (sırasıyla 50 mM KCl ve 300 mM KCl'lik tamponlar için) inkübe edin.
  4. Tüpleri bir ultrasantrifüj rotoruna aktarın ve 25 ° C'de 350.000 x g'da (TLA 120.1 rotor için 89.700 rpm) 10 dakika döndürün.
  5. Döndürdükten sonra, tüpleri rotordan dikkatlice çıkarın ve süpernatanı hemen temiz bir tüpe aktarın. 20 μl 2x numune tamponuna 20 μl süpernatan ekleyerek numuneleri SDS-PAGE için hazırlayın. 98 °C'de 10 dakika kaynatın.
  6. FtsZ polimerleri içeren pelet fraksiyonuna 50 μl 2x numune tamponu ekleyin. Ultrasantrifüj tüpünü 2 ml'lik bir tüpe yerleştirin. Peleti 98 °C'de 10 dakika kaynatarak yeniden süspanse edin, ardından numuneyi süpernatan numune ile aynı 2x seyreltme yapmak için 50 μl demineralize H2Oekleyin.
  7. Ultrasantrifüj tüpünü 2 ml'lik tüpte ters çevirin ve 18.000 x g'da bir Eppendorf santrifüjünde 5 dakika aşağı çevirin. Ultrasantrifüj tüpünü 2 ml'lik tüpten çıkarın.
  8. Her bir süpernatan ve pelet numunesinden 10 μl'yi %10'luk bir SDS-PAGE jel üzerine yan yana yükleyin. Jeli 150 V'ta çalıştırın.
  9. Jeli Coomassie Brilliant Blue G-250 ile boyayın ve miktar tayini için saklayın.

3. Yavaş Dönüşte FtsZ Sedimantasyon Testi

  1. Adım 2'deki gibi polimerizasyon çözeltisini hazırlayın, SepF ve/veya FtsZ (nihai konsantrasyon 12 μM) ekleyin. Bu deneyler, bir TLA-55 rotoru ile birlikte Beckman tek kullanımlık 1,5 ml'lik tüplerde gerçekleştirilebilir.
  2. Tüpü çalkalama işlevine sahip bir inkübatöre yerleştirin ve 30 ° C'de 300 rpm'de 2 dakika inkübe edin.
  3. Bir stok çözeltisinden (nihai konsantrasyon 2 mM) 1 μl GTP veya GDP ekleyerek polimerizasyona başlayın, 300 rpm'de 30 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
  4. 25 °C'de 24.600 x g'da (TLA 55 rotor için 20.000 rpm) 15 dakika döndürün.
  5. Süpernatanı çıkarın ve temiz bir tüpe aktarın, 20 μl alın ve 20 μl 2x numune tamponuna aktarın. 98 °C'de 10 dakika kaynatın.
  6. Polimerler içeren pelet fraksiyonuna 50 μl 2x numune tamponu ekleyin ve 98 °C'de 10 dakika kaynatarak tekrar süspanse edin, 50 μl demineralize H2O ekleyin.
  7. Her bir süpernatan ve pelet numunesinden 10 μl'yi %10'luk bir SDS-PAGE jel üzerine yan yana yükleyin. Jeli 150 V'ta çalıştırın.
  8. Jeli Coomassie Brilliant Blue G-250 ile boyayın ve miktar tayini için saklayın.

4. FtsZ Sedimantasyon Testlerinin Miktar Tayini

  1. Bir jel dokümantasyon sistemi (ör. LAS-4000, Fujifilm) kullanarak Coomassie lekeli jelin fotoğrafını çekin.
  2. Jel görüntüsünü, jellerin densitometrik analizi için uygun bir programda (örneğin AIDA görüntü analizörü programı (Raytest)) açın ve bu programdaki analizi aşağıda açıklayın.
  3. Araç çubuğundaki "Değerlendirme" düğmesini tıklayın.
  4. Listeden "2D Dansitometri"yi seçin ve Tamam'a tıklayın.
  5. Ana menüde "Değerlendirme" ye tıklayın ve "Bölge Belirleme" girişini seçin.
  6. Jel üzerinde bir bölge oluşturmak için, Bölge Belirleme araç kutusundaki Otomatik kontur aracının sembolüne tıklayın.
  7. Jel üzerindeki protein bandının sol üst köşesine tıklayın, fare düğmesini basılı tutun ve bandın istediğiniz sağ alt ucuna sürükleyin ve fare düğmesini bırakın.
  8. Her FtsZ/SepF bandını aynı şekilde işaretleyin.
  9. Atanan bölgelerin değerlendirilmesi ile ilgili tüm bilgiler Bölge Raporu'nda bulunabilir. Bölge Raporu'nu almak için Bölge Belirleme araç kutusundaki "Bölge Raporunu Göster" butonuna tıklayın.
  10. Raporu dışa aktarmak için, ana menüde Dosya'ya tıklayın ve "Dışa Aktar à 2B Bölge Raporu" girişini seçin.
  11. Bölge raporunda, oluşturulan her bölgenin yoğunluğu bulunmalıdır. Rapordaki yoğunluk değerlerini kullanarak peletteki protein yüzdesini (FtsZ, düzenleyici protein) hesaplayın.

5. 90° Işık Saçılımı

  1. Bir floresan spektrometresini (örneğin AMINCO-Bowman Seri 2) açın, termal dalgalanmaları önlemek için lambanın birkaç dakika ısınmasına izin verin ve küvet odası sıcaklığını 30 °C'de tutmak için sirkülasyonlu bir su banyosunu açın.
  2. Spektrometrenin çalışma parametrelerini tanımlayın: dedektör yüksek voltajı 300 V, emisyon ve uyarma dalga boyu: 350 nm, yarık genişliği: 4 nm. Birçok spektrometrenin, bir deneyin başlangıcındaki sinyali otomatik olarak maksimumun belirli bir yüzdesine (örneğin% 60) ayarladığını unutmayın. Bu, FtsZ'yi polimerize etmek için GTP eklenir eklenmez bir saçılma sinyalinin aralık dışına çıkmasına neden olur. Bir dizi deneye başlamadan önce maksimum polimerizasyon için doğru sinyal amplifikasyonunu - dedektör yüksek voltajını - kurmak akıllıca olacaktır.
  3. Bir veri toplama protokolü programlayın. 3.600 saniye süren zamana dayalı alımı seçin.
  4. Bir floresan küveti su ve etanol ile dikkatlice temizleyin, gerekirse oda sıcaklığında su banyosunda 5 dakika sonikat. Bu protokolde 1 cm tabaka uzunluğuna ve 200 μl hacme sahip küvetler kullanılmış ve depolama solüsyonunda (%0,5-1 Hellmanex) saklanmıştır. Alternatif olarak tek kullanımlık UV uyumlu plastik küvetler (UVette, Eppendorf) kullanılabilir.
  5. 300 μl için hesaplanan nihai konsantrasyon olarak 10 mM MgCl2 ve 12 μM FtsZ ile polimerizasyon tamponunun 294 μl'lik bir ana karışımını (numune hazırlama noktası 1'e bakınız) ve girdap hazırlayın.
  6. 196 μl polimerizasyon tamponunu küvete aktarın ve spektrometreye yerleştirin. 30 °C'de 2 dakika inkübe edin.
  7. Veri alımını başlatın ve sinyalin kararlı olduğunu doğrulamak için 90 saniye bekleyin.
  8. 200 μl'lik bir son reaksiyon hacmi elde etmek için 4 μl 100 mM GTP veya GDP (nihai konsantrasyon: 2 mM) ekleyin, karıştırmak ve alıma devam etmek için daha büyük hacimli bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.

6. Transmisyon Elektron Mikroskobu

  1. FtsZ sedimantasyon testi için numuneleri hazırlayın (malzemeden tasarruf etmek için hacim 10 μl nihai hacme düşürülebilir).
  2. İnkübasyon süresinden sonra, numunenin 2 μl'sini kızdırarak boşaltılan 400 gözenekli karbon kaplı bakır ızgaraya uygulayın, 15 saniye inkübe edin.
  3. Izgaraya hafifçe dokunarak veya ızgarayı bir filtre kağıdına paralel veya dik olarak sürükleyerek kurulayın.
  4. Izgarayı 4 μl% 2 uranil-asetat çözeltisi kullanarak boyayın. Izgarayı adım 6.3'te açıklandığı gibi kurulayın.
  5. Izgarayı 120 kV'da 39.200X büyütmede çalışan bir Philips CM120 elektron mikroskobunda görüntüleyin.

7. GTP Hidroliz Testi

Deneyin kurulumu, FtsZ'nin GTP hidrolizi, reaksiyonun malakit yeşili ile karıştırılmasıyla çeşitli reaksiyon sürelerinden sonra durdurulacak şekilde tasarlanmıştır. Bu sayede malakit yeşilinin renk gelişim süresi her numune için aynıdır.

  1. Polimerizasyon tamponlarından birinde 1,5 ml 2 mM GTP hazırlayın (bkz. numune hazırlama, madde 1).
    Bir polimerizasyon tamponunda 0-40 μM fosfat standart seyreltmesi hazırlayın ve POMG-25H (Biyo tahliller) kitinde açıklandığı gibi malakit yeşili çalışma reaktifi hazırlayın. Alternatif olarak, çalışma reaktifleri Lanzetta ve ark. tarafından açıklanan protokollere göre kurum içinde hazırlanabilir.16
  2. Ana karışımları toplam 360 μl hacimde hazırlayın: ben 24 μM FtsZBs, 20 mM MgCl2, polimerizasyon tamponu ıı 12 μM FtsZEc, 20 mM MgCl2, polimerizasyon tamponu III (kontrol 1) 24 μM FtsZBs, 2 mM EDTA, polimerizasyon tamponu IV (kontrol 2) 12 μM FtsZEc, 2 mM EDTA, polimerizasyon tamponu
  3. Ana karışımların 20 μl'lik alikotlarını, 100 μl fosfat standartlarını ve 180 μl 2 mM GTP'yi bir qPCR 96 oyuklu plakaya aşağıdaki sırayla pipetleyin: Bir B Ç D E F G H 1 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 2 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 3 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 4 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 5 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 6 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 7 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 8 ııı ııı ben ben ıv ıv ıı ıı 9 Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps 10 Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps Ps 11 12 GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası GTP (Küresel Ticari Ürün Numarası
    PS - fosfat standardı
  4. qPCR plakasını, program 30 °C'de 40 dakikalık döngüye ayarlanmış bir PCR makinesine yerleştirin.
  5. 96 oyuklu bir plakada 20 μl malakit yeşili çalışma reaktifi hazırlayın. Deneyden 60 μl polimerizasyon tamponunu 1'-8' şeritlerine ekleyin. Numune, fosfat standardına kıyasla 4 kat seyreltilecektir, lütfen son hesaplamalar sırasında bu gerçeği göz önünde bulundurun.
    BirBÇDEFGH
    1'ııııııbenbenıvıvıııı
    2'ııııııbenbenıvıvıııı
    3'ııııııbenbenıvıvıııı
    4'ııııııbenbenıvıvıııı
    5'ııııııbenbenıvıvıııı
    6'ııııııbenbenıvıvıııı
    7'ııııııbenbenıvıvıııı
    8'ııııııbenbenıvıvıııı
    9'PsPsPsPsPsPsPsPs
    10'PsPsPsPsPsPsPsPs
  6. Şerit 1'e 20 μl GTP ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin, zamanlayıcıyı başlatın (bu, 30 dakikalık reaksiyonun başlangıç zaman noktasıdır).
  7. 10 dakika 30 saniye sonra GTP'yi şerit 2'ye ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (20 dakika reaksiyon).
  8. 16 dakika sonra GTP'yi şerit 3'e ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (15 dakika reaksiyon).
  9. 21 dakika, 30 saniye sonra GTP'yi şerit 4'e ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (10 dakika reaksiyon).
  10. 25 dakika sonra GTP'yi şerit 5'e ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (7 dakika reaksiyon).
  11. 27 dakika, 30 saniye sonra GTP'yi şerit 6'ya ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (5 dakika reaksiyon).
  12. 29 dakika sonra GTP'yi şerit 7'ye ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (4 dakika reaksiyon)..
  13. 30 dakika sonra 20 μl'yi şerit 1'den şerit 1'e aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (30 dakikalık reaksiyon için malakit yeşili renk gelişiminin başlangıç noktası).
  14. 30 dakika sonra, 30 saniye sonra 20 μl'yi şerit 2'den 2'ye aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (20 dakikalık reaksiyon için malakit yeşil renk gelişiminin başlangıç noktası).
  15. Her 30 saniyede bir 3-7 şeritleri için adımı tekrarlayın.
  16. 33 dakika, 30 saniye sonra şerit 8'e 20 μl GTP ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve 20 μl'yi şerit 8'e aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (0 dakika reaksiyon ve reaksiyon için malakit yeşil renk gelişimi için başlangıç zaman noktası).
  17. 34 dakika sonra şerit 9'dan 9'a 80 μl ekleyin, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (fosfat standardı 1 için malakit yeşili renk gelişimi için başlangıç zaman noktası).
  18. 34 dakika 30 saniye sonra 80 μl'yi şeritten 10' ila 10' aktarın, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin (fosfat standardı 2 için malakit yeşili renk gelişimi için başlangıç zaman noktası).
  19. Numunelerdeki tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve plakayı oda sıcaklığında 25 dakika 30 saniye daha inkübe edin.
  20. Plakayı 96 oyuklu plaka okuyucuya yerleştirin.
  21. 60 dakika sonra, plakayı her 30 saniyede bir 10x olarak 630 nm dalga boyunda ölçün (malakit yeşili renk gelişimi ilk reaksiyon için şimdi 30 dakikadır). Her ölçüm, 7.6-7.12 ve 7.16 adımlarındaki her zaman noktasına karşılık gelir ve veri analizi sırasında ayrı olarak hesaplanmalıdır.
  22. Fosfat standart kalibrasyon eğrisini kullanarak her numunedeki serbest fosfatı hesaplayın.
  23. Verileri zaman içinde Fosfat salınımı olarak çizin ve eğrinin doğrusal aralığından FtsZ GTP hidroliz aktivitesini hesaplayın.

Sonuçlar

Farklı bakteriyel kaynaklardan FtsZ saflaştırması literatürde tanımlanmıştır ve Tablo 1'de özetlenmiştir.

Lütfen çevirmemi istediğiniz kaynak metni sağlayın. Metni gönderdiğiniz anda belirtmiş olduğunuz profesyonel akademik standartlar, bilimsel terminoloji ve JoVE formatına uygun şekilde Türkçe çevirisini gerçekleştireceğim.YöntemModifikasyonElde edilen verim [kültürün L başına mg'ı]>Kaynaklar
B. subtilis1) Amonyum sülfat çöktürme/iyon değişim kromatografisiHayır40Bu çalışma, 11,15
2) Afinite kromatografisiHis-etiketiBelirlenemedi17
E. coli1) Amonyum sülfat çöktürme/iyon değişim kromatografisihayır35Bu çalışma, 11,15
2) Kalsiyum çöktürme, iyon değişim kromatografisiHayır4018
Methanococcus jannaschii1) Denatüre edici koşullar altında afinite kromatografisi/yeniden katlanma/amonyum sülfat çöktürme/jel filtrasyonuHis-etiketi1.319
2) Affinite kromatografisi/ jel filtrasyonuHis-etiketiND20
Thermotoga maritimaİyon değişim kromatografisi/jel filtrasyonHayır6.719
Pseudomonas aeruginosaAffinite kromatografisi/jel filtrasyonuStrep-tag, His-tagSaptanmadı21
Mycobacterium tuberculosis1) Afinite/iyon değişim kromatografisihayırND22
2) Afinite kromatografisi/ jel filtrasyonuhayır3023
Aquifex aeolicusAffinite kromatografisi/jel filtrasyonuHis-tag, C-terminal trunkasyonu (331-367)ND24
Caulobacter crescentusİyon değişim kromatografisi/amonyum sülfat çöktürme/jel filtrasyonuhayırSaptanamadı25

Tablo 1. Açıklanan FtsZ saflaştırma protokolleri. ND: belirlenmedi.

FtsZ polimerlerinin çöktürülmesi

Başlangıçta, FtsZ polimerlerini çöktürmek için iki farklı hız kullandık. Sadece 350,000 x g hızda tekil FtsZEc polimerlerinin çöktüğünü (Şekil 1), buna karşın 190,000 x g hızda pellet fraksiyonunda yalnızca FtsZBs demetlerinin bulunduğunu saptadık (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, sonraki deneylerimizde 350,000 x g kullanılmıştır. Işık saçılım deneyleri FtsZBs için çok daha yüksek bir saçılım sinyali ortaya koymasına rağmen, 50 mM KCl konsantrasyonunda polimerize olan FtsZEc ve FtsZBs yüzdeleri benzerdir. Bu durum, FtsZBs tarafından oluşturulan ve tekil FtsZEc polimerlerine göre daha fazla ışık saçan demetlerden kaynaklanmaktadır. Hem FtsZEc hem de FtsZBs için 300 mM KCl ile yapılan deneyde, pellet fraksiyonunda yüksek miktarda FtsZ polimeri elde etmek mümkün olmamıştır (Şekil 1). Bunu, FtsZ yapılarının hızlı parçalanması ve filamentlerin demetlenme oranının azalmasının bir kombinasyonuna bağlıyoruz.

FtsZ-SepF tübüllerinin çöktürülmesi

FtsZ'nin belirli aktivatörlerle olan etkileşimini analiz etmek için daha düşük santrifüj hızlarında sedimentasyon analizleri gerçekleştirilebilir. Bu hızda yalnızca büyük FtsZ yapıları çöktürülebilir, örneğin SepF halkaları ve FtsZBs filamentleri tarafından oluşturulan büyük tübüller5 veya FtsZ ve ZapA tarafından oluşturulan demetler. FtsZ ve SepF tarafından oluşturulan tübüller için bu yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermek amacıyla daha düşük santrifüj (24.600 x g) kullandık. FtsZ, ancak örnekte hem SepF hem de GTP mevcut olduğunda arka plan seviyelerinin üzerinde çökelekten geri kazanılmıştır (Şekil 2) ve SepF'nin varlığı FtsZ GTPaz aktivitesini etkilemez7; bu da FtsZ'nin SepF varlığında tam aktif olduğunu göstermektedir. SepF ve FtsZ'nin spesifik sedimentasyonu, toplam SepF'nin yaklaşık %45'i ve toplam FtsZ'nin %15'idir (GDP eklendiğinde çöken materyalle karşılaştırıldığında). Bu durum, SepF-FtsZ tübüllerinin FtsZ'den daha fazla SepF içerdiğini göstermektedir. Bunun nedeni, birçok SepF halkasının FtsZ-SepF tübüllerini organize etmesi olabilir5,7. Bu tübüllerdeki SepF-FtsZ'nin kesin stokiyometrisi bilinmemektedir ancak sonuçlarımız FtsZ'den daha fazla SepF bulunduğunu göstermektedir.

FtsZEc ve FtsZBs polimerizasyon ve demetleme özellikleri

FtsZBs ve FtsZEc proteinlerinin farklı tamponlardaki polimerizasyon verimliliğini karakterize etmek için her iki proteini de 90° açılı ışık saçılımı ile analiz ettik. 50 mM KCl konsantrasyonunda, tampon pH'ına bağlı olarak FtsZBs, FtsZEc'den 20-40 kat daha yüksek ışık saçılım sinyali vermiştir (Şekil 3A ve B), bu da Buske et al.26 tarafından elde edilen sonuçları doğrulamaktadır. Tampondaki KCl konsantrasyonunun artırılması, FtsZEc'nin ışık saçılım sinyalini önemli ölçüde etkilemezken (Şekil 3D), 50 mM KCl içeren tamponlarla (Şekil 3A) karşılaştırıldığında 300 mM KCl'de FtsZBs sinyali pH 7,5'te ~80 kat, pH 6,8'de ~30 kat ve pH 6,5'te ~45 kat azalmıştır (Şekil 3C). Her iki protein için de FtsZ polimerlerinin çözünmesi, daha yüksek KCl konsantrasyonunda daha hızlı gerçekleşmektedir (Şekil 3C ve D). Pacheco-Gómez et al. tarafından yapılan çalışmalar, E. coli FtsZ polimerizasyonunun ve demetlenmesinin pH'a bağımlı olduğunu göstermektedir. Söz konusu yazarlar, 50 mM KCl içeren bir tamponda, pH 6,0'da FtsZ polimerizasyonunun ışık saçılım sinyalinin pH 7,0'a kıyasla daha yüksek olduğunu ve FtsZ'nin çözünmesinin daha uzun sürdüğünü tespit etmişlerdir 8. Bu sonuçlar, 50 mM KCl'deki FtsZEc polimerizasyonuna ait verilerimizle (Şekil 3B) uyumlu değildir; ancak Pacheco-Gómez et al. sadece MES kullanırken bizim üç farklı tampon (HEPES, MES ve PIPES) kullandığımız belirtilmelidir. Dolayısıyla, 50 mM KCl'de FtsZ polimerlerinin kinetiğini sadece pH değil, aynı zamanda tampon bileşimi (iyonik şiddet) de etkilemektedir. Bununla birlikte, 300 mM KCl'de ne tampon bileşimi ne de pH, FtsZEc montajını tespit edilebilir düzeyde etkilememiştir.

KCl içermeyen tamponlarda FtsZBs ile yapılan bir ışık saçılım deneyi, proteinin bu koşullar altında çökmesi nedeniyle mümkün olmamıştır. FtsZBs konsantrasyonu 3 µM'ye düşürüldüğünde çökelme meydana gelmemiştir. Ancak 3 µM, hücredeki FtsZ'nin fizyolojik konsantrasyonu değildir. Plastik küvetlerde, pH 7,5'te 12 µM FtsZBs çökelme göstermemiş, ancak pH 6,8 ve 6,5'te KCl yokluğunda FtsZ hala çökelmiştir.

E. coli ve B. subtilis kaynaklı FtsZ yapılarının morfolojileri

FtsZ tarafından oluşturulan yapılar TEM ile incelendi. Düşük tuz konsantrasyonundaki tüm tamponlarda FtsZBs, tüm ızgarayı kaplayan sıkıca paketlenmiş polimerler oluşturdu (Şekil 4A-C). FtsZEc ise düşük tuz konsantrasyonundaki tüm tamponlarda uzun filamentler, kablolar ve demetler oluşturdu (Şekil 4D-F). Ancak, FtsZEc tarafından oluşturulan gözlemlenebilir polimer miktarı, FtsZBs tarafından oluşturulan miktardan daha düşüktü. Yüksek tuzlu tamponlarda FtsZBs, demetler oluşturmayan daha uzun tek zincirli protofilamentler oluşturdu (Şekil 4G-I). FtsZBs protofilamentleri yüksek tuz konsantrasyonunda yapı değiştirirken, FtsZEc düşük tuzlu tamponlardakinden ayırt edilemeyen yapılar oluşturdu (Şekil 4J-L). FtsZEc polimerizasyonu üzerinde gözlemlenebilir bir pH etkisi yoktu; ancak FtsZBs, pH 6,5'te sıkıca paketlenmiş polimerler ve tabakalar şeklinde görülen daha fazla demet oluşturdu (Şekil 4B). Bu sonuçlar, ışık saçılma deneylerimizle ve daha önce yayınlanmış TEM çalışmalarıyla8,11,26 uyumludur.

Yüksek ve düşük KCl konsantrasyonlarında FtsZ'nin GTPaz aktivitesi

FtsZ'nin GTP hidroliz aktivitesi, serbest fosfat için kolorimetrik bir analiz kullanılarak farklı koşullar altında ölçülmüştür. Daha önce bildirildiği üzere15 FtsZ'nin GTPaz aktivitesi, KCl konsantrasyonu arttıkça artmıştır: kullanılan tampona bağlı olarak, 300 mM KCl'de, 50 mM KCl ile karşılaştırıldığında FtsZBs 3-7 kat, FtsZEc ise 1,5-2,5 kat GTPaz aktivitesi artışı göstermiştir. 50 mM KCl'deki düşük GTPaz aktivitesi, FtsZBs filamentlerinin demetlenmesinden kaynaklanmaktadır. 50 mM KCl'de, FtsZEc polimerlerinin daha hızlı sökülmesi nedeniyle FtsZEc, FtsZBs'den 3-6 kat daha yüksek GTPaz aktivitesine sahipti. FtsZBs ve FtsZEc arasındaki GTP hidroliz aktivitesi farkı, muhtemelen FtsZBs filamentlerinin daha az demetlenmesi nedeniyle 300 mM KCl'de azalmıştır (Şekil 5).

FtsZ polimerizasyonu, % pelet analizi, sütun grafiği, jel elektroforezi, GTP/GDP etki karşılaştırması.
Şekil 1. FtsZ polimerizasyonunun sedimentasyon ile nicelendirilmesi.(A) 12 µM FtsZ, pH 7.5 (siyah sütunlar), 6.8 (gri sütunlar) veya 6.5 (beyaz sütunlar) değerlerinde 2 mM GTP veya GDP varlığında polimerize edilmiştir. Peletlenen protein miktarı, Coomassie ile boyanmış jellerin densitometrik analizi ile belirlenmiştir. GDP, spesifik sedimentasyon için kontrol olarak kullanılmış ve grafikte çizilen değerleri elde etmek için GDP ile sedimente olan FtsZ yüzdesi, GTP ile sedimente olan FtsZ yüzdesinden çıkarılmıştır. Solda: 50 mM KCl'de sedimente olan FtsZ, sağda: 300 mM KCl'de sedimente olan FtsZ. (B) Coomassie ile boyanmış jellerden elde edilen temsili sonuçlar. 50 mM KCl'de FtsZBs (üst jel) ve FtsZEc (alt jel) polimerizasyonu. (S) süpernatant, (P) deneyden elde edilen pelet fraksiyonları. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

FtsZ ve SepF etkileşim grafiği ve GTP/GDP'nin protein pelet yüzdesi üzerindeki etkisini gösteren jel.
Şekil 2. SepF/FtsZ tübüllerinin düşük hızda sedimentasyonu. (A) 12 µM FtsZBs, 2 mM GDP (beyaz çubuklar) veya GTP (siyah çubuklar) ile polimerize edilmiştir. Peletlenen protein miktarı, Coomassie ile boyanmış jellerin densitometrik analizi ile belirlenmiştir. x-ekseninin altındaki + ve - işaretleri, reaksiyonda FtsZ ve SepF'nin varlığını veya yokluğunu belirtir. (B) Coomassie ile boyanmış bir jelden elde edilen temsili sonuçlar. SepF varlığında ve yokluğunda FtsZBs polimerizasyonu. Kontrol olarak FtsZ içermeyen SepF kullanılmıştır. Polimerizasyon GTP ve GDP ile gerçekleştirilmiştir. (S) süpernatant, (P) deneyden elde edilen pelet fraksiyonları. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

KCl konsantrasyonlarına göre FtsZ ışık saçılma grafikleri; 6,5, 6,8, 7,5 pH etkilerini göstermektedir.
Şekil 3. 12 μM FtsZEc ve 12 μM FtsZBs ışık saçılımı. FtsZ'ler 2 mM GTP varlığında birleştirilmiş ve polimerizasyon 90° açılı ışık saçılımı ile izlenmiştir. pH 7,5, pH 6,8 ve pH 6,5 değerlerinde 50 mM KCl ile FtsZBs (A) ve FtsZEc (B) polimerizasyonu. pH 7,5, pH 6,8 ve pH 6,5 değerlerinde 300 mM KCl ile FtsZBs (C) ve FtsZEc (D) polimerizasyonu. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Değişen pH ve KCl konsantrasyonlarında FtsZ polimerlerinin elektron mikroskopisi; yapısal analiz.
Şekil 4. Elektron mikroskopisi ile görüntülenen FtsZBs ve FtsZEc polimerlerinin yapıları. (A-L) 2 mM GTP ile polimerize edilmiş 12 µM FtsZBs (A-C ve G-I) ve FtsZEc (D-F) ile (J-L) görüntüleri. (A-C) Sırasıyla 50 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZBs. (D-F) Sırasıyla 50 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZEc. (G-I) Sırasıyla 300 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZBs. (J-L) Sırasıyla 300 mM KCl ve pH 7.5, 6.8 ve 6.5 içeren tampon içindeki FtsZEc. Ölçek çubuğu: 100 nm. Daha büyük görüntüyü görmek için buraya tıklayın.

GTPaz aktivitesi grafiği; 50mM'e karşı 300mM KCl'de FtsZ'nin sütun grafiği, pH varyasyonları 7,5, 6,8, 6,5.
Şekil 5. 6 farklı tamponda FtsZ polimerizasyonu sırasında GTP hidrolizi. Tüm deneylerde 2 mM GTP kullanılmıştır. Kontrol olarak MgCl2 içermeyen bir örnek kullanılmıştır. MgCl2 içermeyen FtsZ'nin aktivitesi, MgCl2 varlığındaki FtsZ aktivitesinden çıkarılmıştır. Solda: 50 mM KCl'de FtsZ'nin GTPaz aktivitesi, sağda: 300 mM KCl'de FtsZ'nin GTPaz aktivitesi. Daha büyük resmi görüntülemek için buraya tıklayın.

Tartışma

FtsZ aktivitesinin ve diğer proteinlerle etkileşiminin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlayan bir dizi yöntem açıklıyoruz. Işık saçılımı, sedimantasyon ve GTPaz tahlillerinin yanı sıra elektron mikroskobu, FtsZ polimerizasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut protokollerde bazı iyileştirmeler yaptık, farklı koşulların FtsZ montajı üzerindeki etkisini gösterdik ve FtsZ çalışmalarına dahil edilmesi gereken kontroller öneriyoruz.

FtsZ ve etkileşen proteinleri arasındaki ilişkinin oluşturduğu büyük yapıları FtsZ polimerlerinden ayırt etmek için düşük hızlı santrifüjlemeyi tanıtıyoruz. Bu yöntem, standart sedimantasyon testine göre iki avantaj gösterir. İlk olarak, 24.600 x g'da döndürülmedikleri için pelet fraksiyonunda FtsZ polimerleri tarafından herhangi bir arka plan oluşturulmaz. İkincisi, etkileşen bir protein ile oluşturulan yapıda bulunan FtsZ miktarı jelden hesaplanabilir. Bu yöntemdeki iki kritik adım, inkübasyon süresi ve GTP konsantrasyonudur. Büyük protein yapısını tamamlandığında, ancak tüm GTP hidrolize edildiğinde parçalanmadan önce santrifüjlemek önemlidir. Bu çalışma için en iyi kontrol, FtsZ'nin GSYİH ile polimerizasyonudur. Testin potansiyel bir sınırlaması vardır. FtsZ, SepF ile 24.600 x g'da kolayca döndürülebilen kararlı bir kompleks oluşturur. Başka bir aktivatör veya FtsZ polimerlerini bir araya getiren bir ilaçla sedimantasyon yapılırsa, testin uyarlanması gerekebilir. İnkübasyon süresini değiştirerek veya santrifüjleme hızını artırarak yapılabilir.

Işık saçılımı deneyleri için numunenin uygun şekilde hazırlanması en önemlisidir. Proteinler döndürülerek önceden temizlenmeli ve kullanımdan önce tüm tamponlar filtrelenmelidir. Numunede herhangi bir agrega varsa, bunlar FtsZ polimerlerinden elde edilen kararlı bir sinyali bozacaktır. FtsZ yapılarının elektron mikroskobu ile analizi için bir ızgaranın hazırlanması ana adımdır. Izgara üzerinde numune inkübasyon süresi, az ya da çok sıkıştırılmış polimerler üretme etkisine sahip olacaktır. FtsZB demetleri için inkübasyon süresi, yüksek KCl konsantrasyonunda FtsZEc ve FtsZB'lerden daha kısa olmalıdır. Sonuçları karşılaştırabilmek için her numune için 12 μM'lik bir konsantrasyon kullandık. Bununla birlikte, 50 mM KCl'de FtsZBs için daha düşük bir FtsZ konsantrasyonu kullanılmalıdır, çünkü 12 μM ızgaranın tam doygunluğuna neden olur. Bu, polimerleri oldukça sıkıştırılmış ve tespit edilmesini zorlaştırır. Daha az sıkıştırılmış polimerlerin EM'de tespit edilmesi daha iyidir.

GTPase testi, FtsZ'nin yapılarından ziyade aktiviteyi incelemek için kullanılan tek deneydir. FtsZ polimerlerinde GTP devri içinMg2+ gereklidir. Bu nedenle,Mg2+ yokluğunda FtsZ, GTP'yi hidrolize etmez. Bu nedenle,Mg2+ içermeyen bir numune bu tahlilde doğru kontroldür, ancak FtsZ depolama tamponunda Mg katyonları mevcuttur. Kontrol örneğine 1 mM EDTA eklenerek çıkarılabilirler. Bu tahlildeki kritik adım inkübasyon süresidir. Belirli bir süre sonra FtsZ aktivitesini durdurmak önemlidir. Bu, FtsZ numunesinin 96 oyuklu bir plakadaki malakit yeşili çözeltisine aktarılmasıyla elde edilir. Ancak malakit yeşili renginin gelişimi sürekli bir süreçtir. Bu nedenle ölçümler her numune için aynı anda yapılmalıdır. Her 30 saniyede bir belirlenmiş bir sırayla alınan ölçümlerle iyi planlanmış bir GTP ekleme protokolü kullanarak, her zaman noktası için aynı inkübasyon ve numune işleme süresini elde etmek mümkündür. Bir diğer kritik adım, deney için protein konsantrasyonunun seçilmesidir. Deneyde FtsZEc ve FtsZ Bs için iki farklı konsantrasyonkullandık. GTP hidrolizi, FtsZBs'ye kıyasla FtsZEc için çok daha hızlıdır. FtsZEc'nin seçilen koşullar altında ve 12 μM'de GTPaz aktivitesi sadece maksimum 5 dakika boyunca doğrusaldır ve bu süreden sonra hidroliz hızı platolardır. Bu nedenle, bu koşullar altında gerçekleştirildiğinde deneyden elde edilen verileri yorumlamak zordur. Bu durumda FtsZEc, her iki proteinin aktivitelerini karşılaştırabilmek için FtsZBs'den daha düşük konsantrasyonda kullanılmalıdır. Farklı kaynaklardan gelen FtsZ'lerin GTPaz aktivitesi değişebilir. Bu nedenle, doğru konsantrasyon seçilmelidir. FtsZ polimerizasyonu için konsantrasyon, kritik konsantrasyonun oldukça üzerinde olmalıdır (genel olarak 2.5-10 μM). FtsZ montaj ve demontaj dinamikleri de önemlidir. Bazı proteinler, 50 mM KCl'de FtsZB'ler için gösterildiği gibi, GTP ilavesinden sonra polimerizasyonda önemli bir gecikme gösterir. FtsZ polimerlerinin montaj ve demontaj süresini yaklaşık olarak tahmin etmek için GTPase testinden önce ışık saçılma testinin yapılması yararlıdır. Bundan sonra, inkübasyon zamanı ve protein konsantrasyonu seçilebilir. FtsZ polimerizasyonu için seçilen koşullar çok önemli olduğundan, her yöntemde doğru pH ve KCl konsantrasyonunun kullanılması önemlidir. Bu çalışmada, pH'ı 6.5-7.5 arasında değişen ve KCl konsantrasyonları 0 M ila 300 mM arasında değişen 9 farklı tampon üzerinde çalıştık. FtsZ'leri analiz etmek için en iyi koşulun B. subtilis ve E.coli ve biyolojik aktiviteleri, yüksek bir KCl konsantrasyonu ile birlikte fizyolojik seviyeye (7.5) yakın pH'ta olduğunu fark ettik. Yüksek bir KCl konsantrasyonunda, FtsZ daha yüksek bir GTPaz aktivitesine sahiptir ve elektron mikroskobu ile daha iyi tespit edilebilen polimerler üretir. Ayrıca, fizyolojik pH ve yüksek KCl konsantrasyonunun, FtsZ ve düzenleyici proteinler arasındaki etkileşimin incelenmesi için, çoğunlukla FtsZ düzeneğini incelemek için kullanılan diğer tamponlardan daha iyi olduğunu doğruladık. FtsZB'ler, yüksek KCl konsantrasyonunda çalışıldığında FtsZEc'ye benzer bir aktivite gösterir. Ek olarak, düşük tuz konsantrasyonunda pH'ın etkisi, yüksek tuz konsantrasyonuna sahip tamponlara göre daha belirgindir. FtsZ bazen KCl içermeyen tamponlar kullanıldığında çökelir, sonuç olarak tuzsuz tamponlardan kaçınılmalıdır. Yüksek KCl konsantrasyonlarına sahip tamponlar kullanıldığında FtsZ polimerlerinin çökelmesi düşüktür. Bu, FtsZ ile SepF ve ZapA gibi FtsZ filamentlerini birleştiren proteinler arasındaki etkileşimleri incelerken bir avantaj olabilir, çünkü bu yüksek dereceli yapıların santrifüjleme ile tespit edilmesi kolaydır. Tüm deneylerimizde 10 mM konsantrasyonda MgCl2 kullandık. Nispeten yüksek birMg2+ konsantrasyonunun FtsZ polimerlerini stabilize ettiği ve FtsZ'nin GTPaz aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Tablo 2'de, çeşitli çalışmalardan elde edilen sonuçlar, aksi takdirde aynı tampon koşulları 27 kullanılarak farklıMg2+ konsantrasyonlarında FtsZ polimerizasyonunu ve GTPaz aktivitesini açıklayan özetlenmiştir. Ölçülen serbest sitoplazmikMg2+ konsantrasyonu 0.9mM3'tür. GTP'nin eşdeğer miktardaMg2+ şelatlayacağına dikkat edilmelidir. Bu nedenle, GTPaz deneyleri için optimalMg2+ konsantrasyonu, fizyolojik seviye3'e yakın olan 2-2.5 mM civarındadır. Bununla birlikte, deneylerimizde kullandık MgCl2 kolayca tespit edilebilir bir ışık saçılım sinyali elde etmek ve sedimantasyon testi sırasında FtsZ polimerlerini stabilize etmek için 10 mM konsantrasyonda.

Protokollerimizi model organizmalardan FtsZ'ye uygulamış olsak da E. koli ve B. subtilis, başka herhangi bir organizmadan FtsZ'ye uyarlanabilirler. Fizyolojik pH'ın ve tek değerlikli ve iki değerlikli katyonların konsantrasyonlarının organizmalar arasında farklılık gösterdiğine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, FtsZ polimerizasyonu için en uygun koşullar değişebilir. Farklı bakterilerin ikiye katlanma süresi ve büyüme koşullarındaki farklılıklar, FtsZ'nin farklı montaj kinetiğine ve deneylerin optimal koşullarına neden olabilir. Bununla birlikte, protokolümüz, diğer organizmalardan FtsZ'lerle yapılan deneyler için iyi bir başlangıç noktası sağlar. Protokoller, düzenleyici proteinlerle FtsZ'nin incelenmesi veya küçük bileşiklerin ve ilaçların FtsZ üzerindeki etkilerinin incelenmesi için faydalı olmalıdır.

KaynakPolimerizasyon [çökelmiş FtsZ'nin %'si]GTPase [Pi/FtsZ/dak]Mg2+ konsantrasyon [mM]FtsZ konsantrasyonu [μM]Başvuru
FtsZEC~ %28~ 2.11012Bu çalışma
~ %50~ 2.41012.527
~ %43~ 3.5512.527
~ %27~ 4.62.512.527
ND~ 5.42.5526
FtsZBs~ %30~ 0.812Bu çalışma
~ %52 (DEAE dekstran ile)~ 0.5101011
ND~ 2.252.5526

Tablo 2. Mg2+ 'nın FtsZ polimerizasyonu ve GTPaz üzerindeki etkisi. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, yayınlanan verilerle karşılaştırıldı. Tüm deneyler 50 mM MES/ NaOH, pH=6.5, 50 mM KCl'de gerçekleştirildi.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

Laboratuvarımızdaki çalışmalar, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (DJS'ye) bir VIDI hibesi ile finanse edilmektedir. Marc Stuart'a ve üniversitemiz Elektron Mikroskobu Bölümü'ne, transmisyon elektron mikroskobuna yardım ettikleri ve erişim sağladıkları için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
GTPRoche10106399001Bölüm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Kalın Duvar Polikarbonat TüplerBeckman Coulter343776Bölüm 2
Optima MAX-XP UltrasantrifüjBeckman Coulter393315Bölüm 2, 3
Geçmeli Kapaklı Poliallomer TüpBeckman Coulter357448Bölüm 3
AIDA Biyo-paket, 1D, 2D, FLIşın Testi İzotopenmessgerä te GmbH15000001Bölüm 4
Lüminesans Görüntü Analiz Cihazı LAS-4000FujifilmBölüm 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Lüminesans SpektrometresiSpectronic InstrumentsBölüm 5
Floresan HücreHellma Analytics105-250-15-40Bölüm 5
Kare 400 Mesh, Bakır, 100/flakonElektron Mikroskobu BilimleriG400-CuBölüm 6
CM120 Elektron Mikroskobu 120 kV'da ÇalışıyorPhilipsBölüm 6
96 ml x 0.2 ml PlakaBIOplasticsB70501Bölüm 7
Malakit Yeşil Fosfat Test KitiBiyoTest SistemiPOMG-25HBölüm 7
PowerWave HT Mikroplaka SpektrofotometresiBioTekBölüm 7

Kaynaklar

  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

I k Sa lmas DeneyiSedimantasyon DeneyiGTP Hidrolizi DeneyiElektron MikroskobuTampon Ko ullarPotasyum Klor rEscherichia coliBacillus subtilisProtein Etkile imi

İlgili makaleler