Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Özet

Caenorhabditis elegans antipsikotik ilaçlar (APDS) etkilerini test etmek için yaklaşımlar gösterilmektedir. Deneyler gelişimi ve canlılığı üzerinde ve yutak pompalama hızı üzerindeki, ilaç etkilerini test etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntemler aynı zamanda APDS başka ilaç sınıfları ile farmakogenetik deneyler için geçerlidir.

Özet

Caenorhabditis elegans ileri büyük ölçekli mükellef ve genetik ekranları ve kimyasal genetik ekranları ters basit bir genetik organizmadır. C. elegans genomu nörotransmitter sentezi ve sinaptik yapısı ve fonksiyonu için gerekli olan proteinleri kodlayan genler dahil olmak üzere potansiyel antipsikotik ilaç (APD), insanlarda muhafaza hedefleri içerir. APD maruz kalması, konsantrasyona bağlı bir şekilde gelişme gecikmesi ve / veya kurt öldürücü olarak üretir. Bu fenotipler ^1,2 kaldırma farenks ve APD kaynaklı inhibisyonu ile, kısmen, kaynaklanır. Böylece, gelişimsel fenotip nöroleptiklerin farmakogenetik çalışmalar için yararlıdır, bir nöromüsküler temeli vardır. Burada nematod gelişimi ve yutak pompalamayı APD etkilerini test için ayrıntılı prosedürleri göstermektedir. Gelişimsel testi için, senkronize embriyolar nematod büyüme ortamı APDS içeren (NGM) levhalar, ve ani gelişen aşamalarında yerleştirilirmals sonra günlük puanlanır. Faringeal pompalama hızı testi için, genç yetişkin hayvanlar APDS içeren NGM plakalar üzerinde test edilir düzenledi. Birim zaman başına yutak pompaların sayısı kaydedilir ve pompalama hızı hesaplanır. Bu deneyler, küçük moleküller, büyük moleküller ya da birçok diğer türleri çalışmak için de kullanılabilir.

Giriş

Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ileri ve geri genetik ekranları ve kimyasal genetik ekranlarında mükellef basit bir genetik organizmadır. C. elegans biyolojik olarak aktif bileşikler, geniş bir spektrum duyarlıdır ve bu nedenle bu bileşiklerin, çeşitli etki mekanizmalarını tanımlamak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Örneğin, biyolojik olarak aktif bileşikler, solucan farmakogenetik asetilkolin reseptörü agonistleri (örneğin, levamisol, nikotin, morantel ve pirantel), anestezikler (ör., halotan), kafein, kolinesteraz inhibitörleri (örneğin, aldikarb, lannate ve triklorfon), florür, GABA ile ilişkili bulunmaktadır kullanılarak incelendi bileşikleri (örneğin, GABA ve Muscimol), ivermektin, parakuat, forbol esterler ve serotonin ile ilgili ilaçlar (örneğin, serotonin ve imiprimine) ^3. Ayrıca, C. elegans sağlayan, büyük ölçekli küçük molekül ekranlar için kullanılmış olan, yeni biyolojik olarak aktif bileşiğin keşfis ve yeni genetik hedefler ^4. tanımlanması.

C. elegans genomu nörotransmitter sentezi ve sinaptik yapısı ve fonksiyonu için gerekli olan ⁵ proteinleri kodlayan genler dahil olmak üzere potansiyel antipsikotik ilaç (APD), insanlarda muhafaza hedefleri içerir. Bu nedenle, C. elegans nörogenetik ve APDS etki yeni moleküler mekanizmalarını keşfetmek için nörobiyoloji teklif yöntemleri. Nematod olarak, APD maruz erken gelişim gelişme gecikmesi ve daha yüksek konsantrasyonlarda, ölümcül ^2,6 üretir. Yetişkinlik döneminde APD poz davranışsal fenotipleri üretir. Örneğin, klozapin pozlama lokomosyonu ve faringeal pompalama engeller ve ^1,2,7 döşeme yumurta geliştirir.

APD kaynaklı gelişimsel gecikme ve öldürücülüğü büyük ölçekli kimyasal genetik ekranlar için güçlü fenotipleri vardır. Büyük olasılıkla birden fazla hücresel ve genetik Basi gibi bu fenotipleri kadar karmaşıktırs. Bu nedenle, genetik ekranlar dolaylı ilaç hedefleri bir dizi elde etmek için beklenir. Ancak, bizim laboratuvar aday gen ekranları ve APD kaynaklı gelişimsel gecikme ve letalitesinin bastırıcılarının için bir genom RNAi ekran gerçekleştirilen ve başarıyla olasılıkla dopamin, insülin ve nikotinik asetilkolin reseptörleri ^2,8 dahil olmak üzere doğrudan hedefleri, kodlayan genleri kurtarıldı. Yetişkin APD kaynaklı davranışları dayalı genetik ekranlar da yeni APD hedeflerinin tanımlanmasına yol açmıştır, ve biz şimdi memelilerde ⁷ gelişimsel ve davranışsal hem de ekranlardan hedefleri doğrulayarak edilir. Bu nedenle, APDS aksiyon yeni moleküler mekanizmaları keşfetmek için bir omurgasız kimyasal bir genetik yaklaşım ^5,8 mümkün görünmektedir.

C. elegans yutak 20 nöronlar, 20 kas hücreleri ve Bir taban zan ile sarılmış 20 aksesuar hücreleri içeren bir organdır. Memeli kalp benzer şekilde, yutak özerk a,nd sürekli dış ortamdan ⁹ gıda pompaları. Faringeal pompalama oranı engellenmesi gıda alımını uzlaşma ve böylece mutasyonlar veya uyuşturucu faringeal pompalama nedeni gelişimsel gecikme inhibe veya ⁹ tutuklama söyledi. APDS gelişimi ve canlılığı ^1,2 üzerindeki etkileri kısmen muhasebe, yutak pompalama hızını inhibe. Burada, nematod gelişimi ve yutak pompalama için ilaç deneyleri göstermek için bir örnek olarak atipik AKB klozapini kullanın.

Protokol

1.. Gelişim Delay / Lethality Deneyi: Vahşi tip (N2) ve iki Mutant (Mut1 ve Mut2) Suşlar, 12 oyuklu bir plaka içerisinde üç Klozapin Konsantrasyonlar test edilir

1. 1. günde, (2 cm çaplı her oyuğa), 12 oyuklu plakanın her oyuğuna 2 mi NGM ortamı ¹⁰ dökün ve gece boyunca oda sıcaklığında (RT) de tezgah üzerinde sertleşmesine olanak sağlar. Aynı gün, bir gece boyunca 220 rpm devirle, Escherichia coli OP50 bir bakteri kolonisi seçmek 50 ml LB solüsyonu bir şişe enfekte eder ve 37 ° C bir çalkalayıcı içinde kültür o.
2. 2. günde, her bir oyuğa NGM merkezi üzerine 20 ul OP50 bakteri kültürü aktarın. 37 ° C inkübatör içinde inkübe edilir ya da bakteri çim kalın büyümesine izin vermek için gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
3. DMSO (dimetil sülfoksit) solvent içinde eritilmesi ile klozapin bir 80 mM stok solüsyonu klozapin olun. Daha sonra 1.7 mM asetik asit B içinde seyreltilmiş stok çözeltisi ile bir 80 ul çalışma çözeltisi yapmakTablo 1 ased.
   Not: ilgi belirli bir ilaç için hazır çözelti mutantlardan alınan yabani tür ayırt için en uygun konsantrasyonunu bulmak için, ön konsantrasyon bir dizi test yaparak tespit edilmelidir.
4. Aktarım 80 ul klozapin de tohumlanmış NGM plaka üzerine çalışma çözeltisi ve çözelti yüzeyi üzerinde eşit olarak dağıtmak için izin vermek için plaka girdap. Plaka kurumasını bekleyin. Aynı gün deneyi için plaka kullanarak ya da bir sonraki gün kullanılmak üzere 20 ° C inkübatör içine yerleştirin.
   Not: çalışma çözeltisi, özellikle yüksek konsantrasyonda, Klozapin düşük çözünürlüğe sahip bir ilaç bir süspansiyondur. Bu nedenle, ilaç konsantrasyonu doğru olduğunu garanti etmek için ilaç plakaya çözüm aktarmadan önce tüp vorteks.
5. M9 tampon ile birçok gebe yetişkin içeren 3,5 cm plaka solucanlar yıkayın ve daha sonra bir 15 ml tüp onları aşağı spin1 dakika boyunca 2000 rpm'de.
6. Süpernatant aspire. 5 ml çamaşır suyu (: hipoklorit: NaOH 04:01:05 de GKD ₂ O) ekleyin ve hafifçe tersini tüpleri nematodları bozabilir.
7. Yarısı yaklaşık 5 dakika ile eritilir kadar hayvanlar dikkat edin. 1 dakika 2.000 rpm'de yumurta aşağı spin.
8. Süpernatant aspirat ve hızla 14 ml M9 tampon ekleyin.
9. 1 dakika 2.000 rpm'de yumurta aşağı Spin ve yaklaşık 100 ul çözüm bırakarak, süpernatant aspire. Yumurta askıya Vortex.
10. Transferi 2 ul yumurta transfer kaç yumurta test etmek için düzenli bir NGM plaka üzerine M9 asılı. Yaklaşık 30-35 yumurta her transferi olmadığından emin olmak için askıya yumurta seviyesini ayarlayın. Deney plakasının her oyuğuna 30-35 yumurta transferi ve daha sonra 24 saat için bir 20 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.
11. Tahlilin ilk gününde, yumurtadan yumurta sayısını skor. Picki tarafından 25ul/çukur için taranmış hayvanların toplam sayısını ayarlayınGerekirse ekstra kapalı solucanlar ng.
12. Daha sonraki günlerde, hayvanları gözlemlemek ve onları her 24 saatte skor. Gelişim aşama hayvanın boyutu ve vulva ¹¹ şekline göre puanlanmıştır. Deney tipik olarak, üçüncü ya da dördüncü gününde görülen en güçlü etkisi ile 5-6 gün sürer.
13. Bir Excel dosyası içine girdi veri ve deney her gün için her gelişimsel aşamada hayvanların yüzdesi hesaplanır. '100% Menüsünden ''2-B sütun içinde' sütun Yığılmış fonksiyonu ile grafikler oluşturun.

2. Pharyngeal Kaldırma Deneyi: Yabani-tür ve mutant suşu için genç yetişkin Hayvan Deneyi Klozapin tabakalarına atacak

1. Analiz plakası gelişimsel gecikme / letalite deneyinde kullanılan aynı protokol takip edilerek yapılır.
2. 24 saat analizden önce ekim yapılmış olan NGM plakalarına her bir suş için 50 L4 hayvanlar almak ve 20 ° C de inkübe solucanlar
3. Bir assa 10 hayvan almaky iyi plaka. Ardından bir sonraki de her 15-20 dk 10 hayvan almak.
4. İlk kuyudaki hayvanlar 30 dakika için bir ilaca maruz bırakıldıktan sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında yutak pompalama gözlemleyerek deneyi başlatın ve 20 saniye için pompalar ⁹ puan. Faringeal pompalama attı sonra, plaka kapalı solucan almak.

Sonuçlar

1.. Gelişimsel gecikme / letalite tahlil sonucu

Gelişimsel gecikme / öldürücülüğü deneyi için tipik bir sonucu Şekil 1a gösterdi ve 1b edilir. Kontrol grubunda, vahşi tip hayvanlara gebe yetişkin aşamasında (Şekil 1a) büyümüştür zaman, klozapin maruz vahşi tip hayvanların ölmüş (Şekil 1b). Şekil 1c karşılaştırma temsili bir sonuç göstermektedir Genç larva aşamalarında hala ya da vardır baskılayıcı bir mutant (Mut1) ve ...

Tartışma

Burada, C ve davranış ile ilgili APDS etkilerini test etmek için yöntemleri tarif eder elegans. İlaç suda çözünmediği DMSO ya da etanol, klozapin çözmek için kullanılır. Çözücüler C etkilediği bildirilmiştir Çünkü elegans biyoloji ^12, DMSO-tek başına veya etanol başına bir kontrol grubu gereklidir. Analizlerde kullanılan en yüksek DMSO konsantrasyonu, C üzerinde belirgin bir etkisi yoktur% 3 e kadar olduğu elegans gelişimi. DMSO hatta birçok küçük moleküll...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Klozapin	Sigma	C6305
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D8418
Asetik asit (HAC)	Fisher	BP2401
Sodyum hidroksit (NaOH)	EMD	SX0590-13
Hipoklorit	Sigma-Aldrich	425044
Santrifüj 5810	Eppendorf	5810 000.017
Kuluçka makinesi çalkalayıcı	New Brunswick Scientific	M1246-0006
Düşük sıcaklık inkübatörü 815	Hassas Bilimsel	J1790-1B
Stereomikroskop	Olympus	SZX12
Petri kabı 35 x 10 mm	Fisher Scientific	NC9434271
12 kuyulu Doku kültürü plakası	BD Falcon	REF 353043