Yöntem makalesi

Bağışıklık Sağlam İnsan MUC1 Transgenik Farelerde İnvaziv Geçici Hücre Mesane Karsinomu indüksiyon: immünoterapi Kalkınma İçin Bir Model

DOI:

10.3791/50868

⸱

30 Ekim 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir N-bütil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin bağımlı mesane kanseri modelinde insan müsin 1 (MUC1), test amacıyla MUC1 yönlendirilmiş immünoterapi için transgenik farenin olarak geliştirilmiştir. Bir MUC1 hedefli bir peptid aşının sonra, MUC1 bir sitotoksik T-lenfosit yanıt sitokin seviyeleri ve T-hücresi spesifik aktivitesi ölçülerek teyit edilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Invaziv mesane kanseri bir klinik öncesi modeli insan müsin 1 (MUC1) immünoterapi ve / veya sitotoksik kemoterapi değerlendirmek amacıyla transgenik (MUC1.Tg) farelerde geliştirilmiştir. Mesane kanseri, C57BL / 6 fareleri (MUC1.Tg ve yabani tip) 3.0 mg / gün dozunda kanserojen N-bütil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin (OH-BBN) ile oral olarak tedavi edildi, 5 gün / haftada teşvik etmek için 12 hafta boyunca. Tümör gelişimi sırasında sitokin profili üzerinde, OH-BBN etkilerini değerlendirmek için, tam kan submandibuler tedavi öncesinde kanamaları ve her dört haftada ile toplanmıştır. Buna ek olarak, MUC1 hedefli bir peptid, aşı ve plasebo sekiz hafta boyunca haftalık fareler gruplara uygulandı. Tümör gelişimi ve aşağıdaki aşılama sırasında serum sitokin Multiplex florometrik microbead immunoanalyses yapıldı. Çıkışta, interferon gamma (IFN-γ) / MUC1 spesifik T-hücresi bağışıklık tepkisi ve tümör Çeşidi histopatolojik değerlendirme için interlökin-4 (IL-4) ELISPOT analizive sınıf yapıldı. Sonuçlar göstermiştir ki: (1) MUC1.Tg ve vahşi hem tip farelerde mesane kanseri insidansı% 67 idi, (2) 2:1 oranında geliştirilen geçiş hücreli karsinom (TCC) skuamöz hücreli karsinom (SCC) ile karşılaştırıldığında , (3), inflamatuvar sitokinlerin tümör gelişimi sırasında zamanla arttığı ve (4) peptid aşılama, Th1-polarize sitokin profili ve bir MUC1 spesifik T-hücresi tepkisi indükler. MUC1.Tg farenin tüm tümörlerde MUC1 ifadesi için pozitiftir ve MUC1.Tg ve vahşi tip farelerde tüm tümörlerin yaklaşık yarısı invaziv. Sonuç olarak, farmakolog, immünologlar, patologlar ve moleküler biyologların çabalarının koordinasyonu ile bir ekip yaklaşımı kullanarak, biz hMUC1 ifade mesane kanseri bağışıklık sağlam transgenik fare modeli geliştirdik.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesane kanseri kanser dördüncü en sık görülen ve Amerikan erkeklerde kanser ölümlerinin sekizinci önde gelen nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri'nde, mesane kanserinden tahmini 72.500 yeni olgu ve 15.000 ölüm 2013 1 kombine erkek ve kadınlar arasında bekleniyor. Mesane kanseri insidansı kadınlara göre yaklaşık üç kat erkeklerde yüksek olduğunu. Vakaların% 90'ından için Amerika Birleşik Devletleri'nde, geçiş hücreli karsinom (TTK) hesap, skuamöz hücreli karsinom (SCC)% 2'den az 2 oranı varken. Papiller TTK için genel nispi 5-yıllık sağkalım oranı SCC 2 için 30.9% ile karşılaştırıldığında% 91.5 olduğunu. Noninvaziv papiller TCCS bile hastaların% 50 daha tedavi daha fazla kas invaziv hastalığa 3,4 ilerleyen bu hastaların% 30 kadar ile, 5 yıl içinde nüks yaşayacaksınız ile, tanı sırasında vakaların yaklaşık% 75 için hesap da . Kas olmayan inv için tipik bir tedavi rejimleriAsive hastalığı intravezikal kemoterapi takiben transüretral rezeksiyon (TUR) içerir. Yüksek dereceli Ta veya T1 tümörlü hastalarda, tekrar TUR kemoterapi 3,4 öncesinde yapılabilir. Düşük dereceli Ta nüks veya yüksek dereceli Ta ya da T1 lezyonu olan hastalar için, TUR Calmette-Guerin (BCG), 3,4 kullanılabilir Bacillus şeklinde kemoterapi veya immünoterapi izledi. İntravezikal BCG nüks 5 zamana göre intravezikal mitomisin C üstün olduğu gösterilmiştir. T2 kas invaziv hastalık için, neoadjuvan kemoterapi olan veya olmayan radikal sistektomi tedavi 3 için önerilen bir derstir. SCC olan hastalarda, sistektomi en etkili tedavi 6 gibi görünmektedir. En iyi tedaviler mevcuttur rağmen nüks çok yüksek oranda göz önüne alındığında, mesane kanseri için yeni, daha etkili tedaviler için ihtiyaç açıkça vardır.

Bladd için yeni immünoterapiler genişletilmesier kanseri hastalıksız sağkalım uzatmak için söz tutabilir olası bir yaklaşımdır. Tarihsel olarak, BCG mesane kanseri için tek etkili immünoterapi olmuştur. Tesir mekanizması artan interlökin-2 düzeyleri (IL-2) ve interferon gama (IFN-γ) 4 ile bir T-yardımcı 1 (Th1) tipi immün cevabın non-spesifik indüksiyonu dahil olduğu düşünülmektedir. Hücresel veya Th1 bağışıklık, hümoral veya Th2 olarak kanser immünoterapisi için kritik olan, bağışıklık sistemi büyüme faktörü reseptörleri 7 karşı antikor hariç olmak üzere, katı tümörler karşı etkili olduğu gösterilmiştir olmamıştı. BCG monoterapi yararları geliştirmek için bir girişim, IFN-α 2B/BCG kombinasyonu immünoterapi kesin sonuçları 8 ile bir faz II klinik çalışmada değerlendirilmiştir. Mesane kanseri immünoterapisi için alternatif bir yaklaşım 7 kanser immünoterapisi daha özel yapmıştır belirlenmesini arasında tümör ilişkili antijenler (TAAS), hedef olabilir, kadar.

Böyle bir TAA, mesane, göğüs, akciğer, ve pankreas kanseri 9,10 gibi birçok epitelyal hücre kanserleri aşırı eksprese bir hücre yüzeyi glikoproteini musin 1 (MUC1) 'dir. MUC1 ifadesi ve değiştirilmesi de önemli ölçüde kanser sırasında değiştirildiği, öyle ki underglycosylation peptid çekirdeği üzerine birbiri ardına dizilmiş tekrar bölgesinin değişken sayıda (VNTR) olarak bilinen amino asit dizileri arasında antijenik ortaya koyar. MUC1 kendi kendine moleküldür da, bu immünodominant VNTR bölgelerde normalde Çok kapsamlı glikozilasyon maruz değildir ve bu nedenle yabancı 11,12 olarak bağışıklık sistemi tarafından görülür. Özellikle MUC1 epitopları tanır sitotoksik T lenfositleri (CTL 'ler) bir MUC1 için potansiyel bir hedef alma, meme kanseri olan hastalarda 13, hem de miyelom hastaları 14,15 kan ve kemik iliği, tümör-lenf düğümlerinden izole edilmiştir hücresel bağışıklık tepkisi. Underglycosylate bir immünodominant VNTR dizileriMUC1 D formunda 16-19 tümör hücrelerinin imha sonuçlanan CTL 'ler tarafından tanınır. Kanserli MUC1 özgü hücresel ve / veya humoral bağışıklık yanıtları, ancak, tümörler ortadan kaldırmak için yeterince güçlü değildir. MUC1 için mevcut zayıf bağışıklık yanıtı artırmak için, sentetik immünodominant peptidler klinik yarar 18,20 olması kadar güçlü bir CTL yanıt oluşturmak için aşılama yoluyla sokulabilir. Bir MUC1 lipozomal aşı halen akciğer kanseri hastalarında 21,22 hayatta kalma oranları MUC1-pozitif tümör hücrelerini öldürme yeteneğine sahip CTL'lerin oluşturmak ve bir Th1 sitokin tepkisi polarize 23,24 üretmek için gösterilmiştir. MUC1 ifade 9,11,25 bir yüksek düzeyde, mesane kanseri MUC1-yönelik immünoterapi 26,27 test etmek için mantıklı bir adaydır. Ayrıca, MUC1 kanser 28, TTK MUC1 ifade önemli evresi ve derecesi ile ilişkili mesane bir prognostik faktör olarak potansiyele sahip ve metastatik TCCMUC1 29 ifade etmeye devam ettiği gösterilmiştir.

Mesane kanseri MUC1 yönlendirilmiş immünoterapi potansiyel kullanımını değerlendirmek amacıyla, bir bağışıklık bozulmamış insan MUC1 (hMUC1)-ifade C57BL / 6 arka plan 30 mesane kanseri congenic transgenik (MUC1.Tg) fare modeli geliştirilmiştir. İnsan MUC1 30,31 insanlarda gözlenen ile tutarlı bir desen doku ekspresyonu ile sonuçlanan, kendi promotörünün kontrolü altında bir kendi kendine protein olarak ifade edilir. Fareler daha sonra, bilinen mesane kanserojen N-bütil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin (OH-BBN) 32 ve sonuçta ortaya çıkan tümörlerin hMUC1 ekspresyonu ile tümör tipi ve derecesi açısından değerlendirildi ile indüklenmiştir. Tümör gelişimi sırasında Th1/Th2 sitokin düzeyleri üzerindeki kanserojen etkisini değerlendirmek için serum örnekleri multipleks analiz için periyodik olarak toplanmıştır. Fareler daha sonra, bir MUC1 hedefli bir peptid aşı ile muamele edilmiş ve sitokin ve bağışıklık tepkileri değerlendirmesine edildimultipleks florometrik microbead immunoassay ve ELISPOT tarafından ted.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan çalışmaları ve deneyleri University of California, Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Yönetim Danışma Kurulu kullanın tarafından onaylanmış bir protokol altında yapılmıştır.

1. MUC1.Tg Fare Yetiştirme ve Yayılım

  1. Heterozigot MUC1.Tg C57BL / 6 dişi fareler ile UC Davis Fare Biyoloji Programı (MBP) ırkları vahşi tip C57BL / 6 erkek fareler bizim üreme kolonisi kurmak. Gerektiği gibi MUC1.Tg yavrular çalışmalar için teslim edilir.
  2. MBP personel fare tanımlama için tanımlanmış bir desen (0-99) içinde yavru ayak klibi ve uygulanabilir klip kuyruk. Parmak veya kuyruk doku standart DNA izolasyonu ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) analizi ile genotip için işlenir.

2. Çalışma Tasarımı

  1. Grup Ödevler Eğitim
    1. Bir denge ayrı ayrı her bir fare tartılır ve her bir fare için gram cinsinden ağırlığını kaydedin.
    2. Inv prosedürün bu bölümüÇalışmanın metodolojisi ve tasarım ZEYTİN. Çalışmanın ilk bölümü için, OH-BBN ile mesane kanseri indüksiyon başlatmak için yaştaki MUC1.Tg ve vahşi tip fareler atayın. 8 hafta histoloji ile mesane tümörlerinin varlığını doğrulamak için son OH-BBN dozdan sonra fareler Euthanize.
    3. Çalışmanın ikinci kısmı için, tedavi ve kontrol gruplarının uygun sayıda içine erkek MUC1.Tg fareler rastgele. Bu fareler 8 hafta son OH-BBN dozdan sonra Çalışmanın bitiminde sonra indüksiyon ve tümör gelişimi sırasında serum sitokin ve T hücre bağışıklık yanıtı için takip ve olacaktır.
  2. Mesane Kanseri İndüksiyon
    1. OH-BBN kanserojen ve yüksek derecede toksiktir. Bu kimyasal işleme ve saklama sırasında malzeme güvenlik bilgi formunun kuralları okuyun ve takip edin.
    2. Ağırlık ve numbe göre, her bir fare için 100 ul bir hacim içinde, uygun bir doz (3 mg) sunmak için gerekli doz solüsyonu hesaplamaHer çalışma ve grup fareler r.
    3. % 100 etanol içinde OH-BBN seyreltilir. Nihai bir konsantrasyona kadar 30 steril su ile mg / ml 'getirin. Son etanol: su konsantrasyonu 20:80 olmalıdır, h / h
    4. 8 haftalıkken başlayan tedavi grubunda atama dayalı paslanmaz çelik, günlük 20 G sonda iğne, 5 gün / 12 hafta boyunca hafta, kullanarak OH-BBN sözlü yönetmek.
  3. Aşılama Tedaviler
    1. % 0.9 steril serum fizyolojik 600 ul ve iyice bir 0,5 inç 27 G iğne 6x ile çözüm çizerek tekrar süspansiyon liyofilize peptid aşı sulandırmak her flakon. İstenen doz 100 ul bir hacim içinde, teslim edilir, böylece tuzlu su kullanılarak, konsantrasyonu ayarlanır.
    2. OH-BBN son dozdan sonra, bir 25 G iğne (hafta numarası farelerin yaşı gelir) kullanarak 100 ul deri altı enjeksiyonu ile sekiz haftalık döngüsü için haftalık olarak aşı yönetmek, Hafta 20 yılından itibaren.
  4. İzleme ve Örnek Toplama
    1. Tüm farenin tartılır ve haftada bir kez, yeni tümör varlığı için elle muayene. Palpe tümörler, idrarda kan ve / veya idrar retansiyonu varsa veya vücut ağırlığının ≥ 20% kaybetmiş herhangi bir fare Euthanize.
    2. Daha sonra ilk OH-BBN doz öncesinde ve 4 haftalık aralıklarla sonra, submandibular kanamaları ile tam kan toplamak. Serum pıhtılaşma tüpleri (BD mikrokonteyner), kan toplayın, ve kanın pıhtılaşmasına için 30 dakika bekleyin.
    3. 10 dakika boyunca 3500 x g'de bir mikrosantrifüj içinde kan örnekleri santrifüjleyin. Dikkatli bir pipet kullanarak kapağı cryotubes vida serum aktarın.
    4. -80 Sıvı azot ve mağaza Flash dondurma ° C multipleks tarafından daha fazla analiz kadar.
    5. Sekiz hafta OH-BBN son dozdan sonra, CO 2 boğulma tüm fareler euthanize.
    6. Bir diseksiyon gemide her fare yerleştirin ve dört bacağı ile sıkıştırmak.
    7. Ma, forseps ve makas kullanılarakke üst karın bölgesinde yatay bir kesi. Epidermal katmanı ve karın duvarı arasında kesi içine makas yerleştirin ve yavaşça forseps yardımı ile temel doku da deriyi kemikten ayır.
    8. Fare ön sonuna doğru orta ekseni takip eden yatay kesi dikey bir kesi yapmak. Göğüs kafesi karşı cildi ayırın ve 1 ml şırınga ve 22 G iğne, delinme kalp ve düzgün ve istikrarlı beraberlik ile kan toplamak kullanarak.
    9. Serum izolasyon ve depolama için 2.4.3 ve 2.4.4 adıma bakın.
    10. Forseps ve makas, kesim ve geri kabuğu epidermal tabakanın kalan kullanma. Karın duvarı ve periton kesti ve aseptik İmmünohistokimya (İHK) ve Western Blot için mesane tümörü çıkarmak.
    11. Hücre canlılığı analizi (Muse) ve ELISPOT için dalak toplayın. İHK, yer mesane tümör dokusu kaset örnek ve oda sıcaklığında soğutulmuş formalin gecede düzeltmek için.
    12. Ertesi gün,% 70 etanol ile formalin değiştirin.
    13. Tümör Western blot analizi için, tümör homojenize protein ekstraksiyon tamponu artı proteaz inhibitörleri durdur ekleyin ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine aktarılır.
    14. 30-60 saniye Vortex ve 5 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Flaş ortam su sıvı azot ve çözülme de dondurma. , Vorteks dondurma ve iki kez çözülme süreci tekrarlayın.
    15. 10 dakika 4 ° C'de 10,000 xg'de örnekleri santrifüj ve yeni işaretlenmiş tüplere hücresel ekstraktlar aktarın.
    16. Protein ölçümleri için bisinkoninik asit Protein Deneyi (BCA) gerçekleştirerek konsantrasyonunu ölçmek. Mağaza örnekleri Western Blot analizi için -80 ° C kadar hazır.

3. Moleküler Biyoloji / Batı

Aşağıdaki prosedürler standart Western Blot protokolü kullanarak fare mesane tümörü dokusunda MUC1 ifade doğrulamak için yapıldı (verileri göstermiyorn) içerir.

  1. Yarı kuru aygıtı kullanılarak PVDF membran üzerine aktarmak daha sonra, SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile protein ekstreleri ayırınız ve.
  2. % 0.1 içinde% 5 yağsız süt ile bloke membran proteini transfer Fosfat Tween-20, oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 saat boyunca tuzlu su (PBS-T), pH 7.4 Tamponlu.
  3. % 0.1 PBS-T içinde anti-MUC1 ya da anti-β-aktin antikoru ile bir çalkalayıcı içinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe membran.
  4. Çözelti aktarma ve% 0.1 PBS-T ekleyerek membran yıkayın. 5 dakika ve süzün için çalkalayıcı girdap membran. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
  5. Bir yaban turbu peroksidaz (HRP) konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe membran.
  6. 3x (3.4 adıma bakın) yıkayın.
  7. Flüorografi etkinleştirmek ve okumak için Gelişmiş Chemiluminesence (ECL) kiti için protokol izleyin.

4. Multiplex Florimetrik microbead İmmünoassay

  1. Kurulum ve Hesaplamalar
    1. Bir 96-plaka haritası kullanarak, kuyulara boşlukları, standartlar, kontroller ve bilinmeyenler atayın. Sayısı ve analitlerin hacmi hesaplamak antikorlar, yakalama ve Streptavidin-Fikoeritrin (SA-PE) tahlili için gerekli.
    2. Tüm tamponlar ve seyrelticiler oda sıcaklığına izin verin. Boş bir 96-plaka kullanarak standart ve numune dilüsyonları hazırlayın.
    3. Üreticinin protokolü ve 96 oyuklu plaka içinde, uygun bir seyreltici ile standart 01:05 seri dilüsyonları için uygun serum matrisi ve liyofilize standart çözün. Boş kaplar için, uygun bir seyreltici kullanın.
    4. 96-kuyulu plakanın geri kalan uygun bir seyreltici içinde tüm kontrol ve bilinmeyen numunelerin 1:02 seyreltin.
    5. Boncuk karışımı, bir 15 ml tüp içinde uygun seyreltici gerekli hacmi pipetle. 20 saniye ve pipetle 15 ml'lik bir tüp içine, her bir analitin gerekli hacmi vorteksleyin her boncuk şişe.
    6. Her zaman photobleaching önlemek için ışıktan boncuk korumak. Esneklik ile örnek kaybını önlemek için emici materyal üzerinde 96 plaka koymayın.
  2. Tahlil Protokolü
    1. Tahlil Tamponu 200 ul ile 96 oyuklu filtre alt plaka Prewet ve filtrenin tamamen ıslatma için izin verir. Yavaşça 96-plaka vakum cihazı kullanarak drenaj ve bir kağıt havlu ile plakanın alt kuru kurulayın.
    2. Bir çok kanallı pipet, boşlukları ve standartlar ve kontroller ve bilinmeyenler için atanan kuyulara analiz tamponunu pipet 25 ul için atanan kuyulara serum matris pipet 25 ul kullanma.
    3. Pipet 25 boş ul, standartlar, kontroller ve ilgili atanan kuyulara bilinmeyenler. Vortex boncuk 20 saniye boyunca karıştırın ve bir rezervuar için boncuk aktarın.
    4. Her kuyuya boncuk karışımı Pipet 25 ul. Alüminyum folyo veya ışıktan korumak için opak bir plaka kapağı ile plaka Kapak.
    5. bir levha sarsıcı üzerinde oda sıcaklığında iki saat boyunca 500 rpm'de plaka çalkalayın. Boşaltın ve 0.1% 200 ul Fosfat içinde Tween 20 ile plaka yıkayın iki kez (PBS-T) Tuzlu Tamponlu. Boşaltın ve kuru kurulayın.
    6. Yakalama antikor çözüm hazırlayın. % 0.1 PBS-T gerekli miktarda pipet ve 10 saniye boyunca 15 ml'lik bir tüp ve girdap içine yakalama antikoru. Her kuyuya bir rezervuar ve pipet 25 ul yakalama antikor karışımı aktarın.
    7. Bir levha sarsıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca 500 rpm'de plaka çalkalayın. Iki boşaltın ve% 0.1 PBS-T 200 ul ile plaka yıkayın. Boşaltın ve kuru kurulayın.
    8. SA-PE çözeltisi hazırlayın. 15 ml tüp ve 10 saniye girdabına% 0.1 PBS-T ve SA-PE gerekli hacmi pipetle. Her kuyuya bir rezervuar ve pipet 25 ul çözüm aktarın.
    9. Bir levha sarsıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 rpm'de plaka çalkalayın. Iki boşaltın ve% 0.1 PBS-T 200 ul ile plaka yıkayın. Drenaj ve bçok kuru.
    10. Pipet 100% 0.1 PBS-T ul ve süspanse boncuklar için en az iki dakika boyunca 500 rpm'de bir levha sarsıcı üzerinde çalkalayın. LUMINEX LX200 makinede plaka okuma ve analiz.

5. IFN-γ/IL-4 ELISPOT Hazırlama ve Analiz

  1. Bir biyolojik güvenlik kabininde, 100 mikron Naylon doku ile dalak işlemek 5 ml steril fosfat içine elekler Salin (PBS) steril Petri kapları içinde tamponlu. Steril 15 ml tüp içinde, lenfosit ayırma ortamı, 3 ml üzerine tabaka splenositler.
  2. Kırmızı kan hücreleri, lenfositlerin ayırmak için 15 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj tüpleri. Yeni bir steril 15 ml tüpler için degrade yukarıda katmanlı lenfositler aktarın.
  3. Steril PBS ile 10 ml'ye ses seviyesini ayarlayın. Pelet hücreleri 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj süspansiyon.
  4. Süpernatan aspire ve hücre canlılığı, 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve Muse saymakanalizörü. Muse Sayısı ve Canlılık Kiti protokolü izleyin.
  5. 1.5 ml vidalı kapaklı santrifüj 1:10 seyreltme faktörleri de tüpler: 1:20, ve Kont ve Canlılık Reaktif (en az toplam hacmi 300 ul) 01:40 (ya da gerektiği gibi) en lenfositlerinin seri dilüsyonları olun. Muse karıştırın ve analiz etmek için birkaç kez her seyreltme pipet ve aşağı yukarı.
  6. ELISPOT plaka için örnekleri ve koşulları bir tabak haritası hazırlayın. Üreticinin protokolü ve orta pipetle 100 ul peptid (10 ug / ml) ya da karıştıran her bir peptit (10 ug / ml) göre ELISPOT plakası hazırlayın.
  7. De her 1,0 x 10 6 hücre teslim ve 37 ° C gecede plaka inkübe hücre süspansiyonu Pipet 100 ul,.
  8. ELISPOT testi için üreticinin protokol izleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak gelişmiş ELISPOT plaka analiz edin.
  9. Renkli noktalar sayısı correspondi sayarak sonuçları sayısalHer iyi her analit için ng. Noktaları her bir spot-oluşturucu hücrelerin sayısı (SFC) karşılık gelir.

6. Immünhistokimyasal (İHK) ve Hematoksilen ve Eosin (H & E) Boyama

  1. Immünohistokimyasal analizi için 4 mikron parafin ve adım bölümünde embed yukarıda açıklandığı gibi korunmuş mesane tümör dokusu (Bölüm 2.4.11), alın.
  2. MUC1 tandem tekrar bölgede tanıyan bir MUC1 antikor kullanarak IHC gerçekleştirin. Dokuda mevcut endojen immünoglobülin ile ikincil fare antikorunun reaktivitesini en aza indirmek için Animal Research takımı peroksidaz kullanın.
  3. Standart protokolleri kullanarak H & E boyama yapın.

7. İstatistiksel Yöntemler

Multiplex Florimetrik microbead İmmünoassay için, ortalama tedavi ve kontrol grubu arasında serum sitokin konsantrasyonları gözlenen karşılaştırmak için bir iki kuyruklu Student t-testi kullanın. ELISPOT için, bir tek-W kullanımımedya kontrolü arasındaki koloniler oluşturan nokta karşılaştırmak ay ANOVA, peptid ve peptid grupları şifreli. Bir yanlış pozitif sonuç olasılığını azaltmak için Dunnett Çoklu Karşılaştırma Testi. ≤ 0.05 p-değeri tüm analizler için önemli ölçüde farklı olarak kabul edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesane kanserinde yeni immünoterapi ve kombinasyonları etkilerinin klinik öncesi değerlendirme uygun bir hayvan modelinin geliştirilmesi gerekir. Bizim transgenik fare modelinde, kimyasal kanserojen OH-BBN ile indüksiyon insanlarda mesane kanseri benzer bazı SCC, ağırlıklı olarak TTK mesane kanseri insidansı yüksek oranda sonuçlandı. Tümörün tipi, MUC1 ifadesi durumu ve peptid aşı tedavisi için bağışıklık yanıtı belirlemek için, 21 ve 18 MUC1.Tg vahşi tip farenin OH-BBN indüksiyon sonrasında kan toplanması, mesane ve da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insan MUC1.Tg farelerde invaziv geçiş ve skuamöz hücreli mesane kanserinin başarılı indüksiyon immünoterapi gelişimi için klinik öncesi model sunuyor. Immünoterapötik çalışmalar zaman yanı sıra immünoterapi için bağışıklık yanıtı üzerinde tümör ilerlemesi için inflamatuvar yanıt değerlendirmek için bir spontan, bağışıklık sağlam modelinin kullanılmasını gerektirir. Kendiliğinden bir tümör geliştirme modelinde, tümör mikro bozulmadan kalır ve tümörlerin tedavi antitümör etkilerinin değerlendirilmesine olanak daha temsilc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DPV, AYKA, SMG, CJK, AMG, ve GKH herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim. MWD Merck KGaA alınan bir hibe Baş Araştırmacı ve MW Merck KGaA bir çalışanıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar fareler üreme için UC Davis Fare Biyoloji Anabilim Dalı teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Merck KGaA, Darmstadt, Almanya bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif 
N-butil-N- (4-hidroksibutil) -nitrozamin (OH-BBN)TCI AmerikaB0938
20 G Gavaj İğneleriPopper Sons, Inc.7921Paslanmaz çelik
Peptit AşısıN/AN/Aaraştırma ajanı
BD MikrotainersBD365957
Doku KasetleriSimportM490-12
%10 Nötr Tamponlu FormalinFisher ScientificSF100-4
Lizis Tamponu Delmek87787
Halt Proteaz & Fosfataz inhibitör kokteyliThermo Scientific78444
Pierce BCA Protein Test KitiPierce23225
Fare Sitokin 20plex KitiInvitrogenLMC006
Manyetik MikroküreBoncukları LuminexMC100xx-01xx boncuk bölgesidir
Anti-fare TNF-Yakalama AntikoruBD Pharmingen551225
Anti-fare TNF- Algılama AntikoruBD Pharmingen554415
Anti-fare IFN- Yakalama AntikoruAbcamab10742
Anti-fare IFN- Algılama AntikoruAbcamab83136
PBS, pH 7.4SigmaP3813-10PAK
Tween-20FisherBP337-500
Test TamponuMiliporeL-MAB
Sitokin StandartMillipore MXM8070
Çok ekranlı HTS 96well filtre plakalarıMillipore MSBVN1210
SA-PEInvitrogenSA10044
100 m Naylon Doku ElekleriBD352360
Splenosit Ayırma OrtamıLonza17-829E
TNF- /IL-4 ELISpot plakalarıAr-Ge D SistemleriELD5217
Tavşan Anti-MUC1 monoklonal antikorEpitomik2900-1
Keçi Anti-aktin monoklonal antikorSigmaA1978
Anti-tavşan HRP antikoruPromegaW401B
Keçi anti-fare HRP antikoruSanta Cruz Biotechnology, Inc.SC-2005
PVDF membranBioRad162-0174
Mini Protean TGX Prekast JellerBioRad456-1083
Muse Sayım & Canlılık KitiMillipore MCH100104
MUC1 AntikoruBD Pharmingen550486IHC
antikoru Hayvan Araştırmaları Peroksidaz KitiDakoK3954IHC boyama
< güçlü > Ekipman ve Yazılım< / güçlü >
Millipore plaka vakum aparatıMilliporeMSVMHTS00
Luminex Lx200Millipore / Luminex40-013Luminex tarafından üretilmiştir, Millipore tarafından dağıtılmıştır
Luminex Xponent YazılımıMillipore / LuminexN/ASürüm 3.1; Luminex ile birlikte verilir Lx200
Milliple Analist YazılımıMilliplex / VigeneTech40-086Sürüm 5.1
Muse Hücre Analiz CihazıMillipore0500-3115
Muse YazılımıMilliporeN/ASürüm 1.1.0.0; Analizör
Diseksiyon MikroskobuUnitronZ730
Graphpad Prism SoftwareGraphpad Software Inc.YokSürüm 5.1
Mini Protean Tetra Hücre Jel aparatıBioRad165-8001
Trans Blot SD Hücre ve PowerPacBioRad170-3849
ile birlikte verilir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
  2. Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215(2007).
  3. Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
  4. Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
  5. Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
  6. Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
  7. Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
  8. Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
  9. Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
  10. Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
  11. Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
  12. Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
  13. Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
  14. Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
  15. Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
  16. Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
  17. Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
  18. Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
  19. Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
  20. Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
  21. Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
  22. Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
  23. Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
  24. Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
  25. Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
  26. Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
  27. Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
  28. Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
  29. Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
  30. Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
  31. Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
  32. McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
  33. Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
  34. Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
  35. Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
  36. Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
  37. Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
  38. Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
  39. Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bladder Cancer ModelOH BBN CarcinogenPeptide VaccineCytotoxic T LymphocyteMultiplex Cytokine AnalysisELISpot AssayHistopathological EvaluationImmune Intact MiceTh1 Polarized Response

İlgili makaleler