Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

6.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50869

⸱

5 Aralık 2013

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Bu makalede

Özet

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

Özet

Proteinler, belirli üç boyutlu kıvrımlarından ortaya çıkan işlevleri yerine getirerek organizmalarda çok önemli görevleri yerine getirirler. Polipeptitlerin doğal yapıları birçok amacı yerine getirmesine rağmen, çoğu proteinin alternatif bir beta tabakası zengin amiloid montajını benimseyebileceği kabul edilmektedir. Çözünmeyen amiloid fibriller başlangıçta birden fazla insan rahatsızlığı ile ilişkilidir, ancak giderek artan bir şekilde çeşitli önemli hücresel süreçlere katılan fonksiyonel oyuncular olarak gösterilmektedirler. Ek olarak, hasta dokularında biriken amiloid, nükleik asitler ve glikozaminoglikanlar (GAG'ler) gibi proteinli olmayan bileşenler içerir. Bu kofaktörler, amiloid oluşumunu kolaylaştırabilir ve bu da farklı tipte çözünmeyen çökeltilerin oluşmasına neden olabilir. Proteinlerin, çözünür amiloid öncüsünün bir ara aşaması yoluyla nasıl yanlış katlandığını anlamamızdan yararlanarak, doğal proteinleri in vitro olarak amiloid fibrillere dönüştürmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yaklaşım, amiloidin büyük miktarlarda hazırlanmasına, spesifik proteinlerden üretilen amiloidin özelliklerinin incelenmesine ve dönüşüme eşlik eden yapısal değişikliklerin değerlendirilmesine olanak tanır.

Giriş

Proteinler, tüm hücre tiplerinde en bol bulunan biyolojik makromoleküllerdir. Çok çeşitli boyutlarda, yapılarda ve translasyon sonrası modifikasyonlarda ortaya çıkarlar ve doğal formlarında olduklarında çok çeşitli önemli biyolojik işlevleri yerine getirirler. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Tip 2 Diyabet1-4 gibi çok sayıda insan patolojik durumunda iki düzineden fazla anormal polipeptit rol oynamıştır. Terminal yanlış katlanmış proteinler, hücre dışı veya hücre içi olarak meydana gelen çözünmeyen kararlı agregatlar olan amiloid fibrilleri olarak birikir.

Bazı hastalıklarda spesifik proteinlerin ima edilmesine rağmen, artan kanıtlar tüm polipeptitlerin amiloid dönüşümünü sağlayan içsel özelliklere sahip olduğu fikrini desteklemektedir. Genom çapında bir dizi araştırması, amiloid eğilimli fragmanların E. coli'den insanlara kadar tüm kodlama peptit segmentlerinin kabaca %15'ini oluşturduğu "amilomu" tanımladı5. Buna göre, son yıllarda çeşitli önemli hücresel süreçlere katılan artan sayıda fonksiyonel amiloid keşfedilmiştir. Örneğin, bakteriler, hayatta kalmaları ve patogenezleri için kritik olan biyofilm ve spor yapıları oluşturmak için amiloidleri bir araya getirir6-9. Peptit hormonları, salınmadan önce memeli salgı granülleri içinde depolama sırasında amiloid birikintileri oluşturur, bu da protein amiloid formunun yararlı biyolojik işlevlere hizmet edebileceğini ima eder6,10,11. Ayrıca, proteinler kritik hücresel sinyalleri iletmek için amiloid fibriller halinde de birleşebilir12,13.

Uzun yıllar boyunca, en çok çalışılan amiloidler, amiloid beta veya prion peptidi gibi insan hastalıklarıyla ilişkili bireysel peptitlerden hazırlanır. Bu peptitler genellikle iyi tanımlanmış bir yapıdan yoksundur ve zamanla çözelti içinde kendiliğinden amiloid oluşturur, bu da çözünmeyen amiloidin öncüsü olarak hizmet eden kısmen yanlış katlanmış bir ara maddenin aracılık ettiği bir süreçtir. Amiloidin öncüsü, doğal peptitlerden(14,15) üretildiğinde nadir ve kararsız olan çözünür protein oligomeri olarak da adlandırılır. Bununla birlikte, daha önce tarif edildiği gibi, prensip olarak hemen hemen her protein, uygun koşullar altında amiloid konformasyonunu benimseyebilir. Son zamanlarda, çeşitli kofaktörlerin16 varlığında kolayca amiloid oluşturan doğal proteinlerin stabilize çözünür oligomerlerini hazırlamak için bir yöntem oluşturduk. Elde edilen amiloid fibriller, terminal protein yanlış katlanma agregatlarının karmaşık doğasını yansıtır17,18. Burada, kofaktör içermeyen protein fibrillerini ve proteinli olmayan bileşenler içeren fibrilleri ifade etmek için hibrit amiloid terimini kullanıyoruz.

Önceden, yüksek sıcaklık, hidrofobik ortam vepH değişimleri 19-23 gibi protein yanlış katlanmasını desteklediği bilinen koşulları uygulayarak in vitro amiloid üretmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, düşük verimlilik, tersine çevrilebilir katlama, büyük parti varyasyonları veya yavaş kinetik gibi çeşitli problemlerle ilişkilidirler. Burada açıklanan yaklaşım tekrarlanabilir, ölçeklendirilmesi kolaydır ve amiloid dönüşümünün zamanlamasını ve durumunu hassas bir şekilde kontrol etmeye izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. MES Arabelleğini Hazırlayın

  1. Hem sadece protein amiloid hem de stabilize çözünür protein oligomerlerini hazırlamak için MES tamponu (0.1 M 2- (N-morfolino) etansülfonik asit ve 0.9 M NaCl) kullanın. 1.95 g MES ve 5.27 g NaCl ağırlığında. H2Oekleyin ve pH'ı 4.7'ye ayarlayın. Son hacmi 100 ml'ye kadar tamamlayın. 4º C'de 6 aya kadar saklayın.

2. Yalnızca Protein İçeren Amiloidi Doğrudan Doğal Proteinlerden Hazırlayın

  1. Tercih edilen proteini (herhangi bir doğal protein veya peptit) tartın ve MES tamponunda 10 mg / ml'ye kadar sulandırın.
  2. 65 °C'de bir su banyosunda 4 saat inkübe edin. Dönemin sonunda, çözeltide beyaz çökelti görülebilir.
  3. Numuneyi %10 (h/h) Tris-HCl (1 M, pH 10.5) ile nötralize edin.
  4. Daha fazla analiz için istenen tampona geçmek için proteini gece boyunca bir diyaliz kasetinde diyaliz edin.
  5. Doğal proteinin bir kontrol numunesi, ısı çökeltmesi olmadan 2.1, 2.3 ve 2.4 adımları izlenerek hazırlanabilir (adım 2.2).

3. Doğal Proteinlerin Stabilize Çözünür Oligomerlerinden Hibrit Amiloid Hazırlayın

  1. Stabilize çözünür protein oligomerleri hazırlayın
    1. Tercih edilen proteini tartın ve MES tamponunda 10 mg / ml'ye kadar sulandırın. 15 dakika oda sıcaklığında bırakın.
    2. 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorürü (EDC) tartın ve MES tamponunda 20 mg / ml'lik taze bir stok hazırlayın.
    3. Protein ve EDC çözeltilerini 2: 5 (h / v) oranında karıştırın, yani her 10 mg EDC için 2 mg protein.
    4. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    5. Numuneyi %10 (h/h) Tris-HCl (1 M, pH 10.5) ile nötralize edin.
    6. Daha fazla analiz için istenen tampona geçmek için proteini gece boyunca bir diyaliz kasetinde diyaliz edin.
    7. Stabilize çözünür protein oligomerini 4 ºC'de 4 haftaya kadar saklayın.
  2. Stabilize edilmiş çözünür protein oligomerinden hibrit amiloidler hazırlayın.
    1. DNA içeren amiloid hazırlamak için, DNA ve stabilize edilmiş çözünür protein oligomerini 1: 1 oranında (a / a) karıştırın. 4 ºC'de en az 2 saat bekletin. Bu süre zarfında, başlangıç protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml veya daha yüksek olduğunda çözeltide çözünmeyen çökelti görülebilir.
    2. RNA içeren amiloid hazırlamak için, RNA ve stabilize çözünür protein oligomerini 1:1 oranında (a/a) karıştırın. 4 ºC'de en az 2 saat bekletin. Bu süre zarfında, başlangıç protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml veya daha yüksek olduğunda çözeltide çözünmeyen çökelti görülebilir.
    3. Heparin içeren amiloid hazırlamak için, heparin ve stabilize çözünür protein oligomerini 1: 1 oranında (a / a) karıştırın. 4 ºC'de en az 2 saat bekletin. Bu süre zarfında, başlangıç protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml veya daha yüksek olduğunda çözeltide çözünmeyen çökelti görülebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Doğal proteinlerin doğrudan amiloide dönüştürülme yeteneği, MES tamponu içerisinde yüksek sıcaklıkta meydana gelen konformasyonel değişime dayanmaktadır. Çözeltideki çökelme, protein agregasyonunun ve muhtemelen amiloid oluşumunun iyi bir göstergesidir. Öte yandan, çözünür protein oligomerlerin stabilize olmasına izin vermek için, MES tamponunda indüklenen oligomerik konformasyonu sabitlemek amacıyla proteinleri çapraz bağlamak için EDC kullanılır. Sonuç olarak, stabilize edilmiş protein oligomerleri, SDS-PAGE ile ayrışt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan yöntem, hemen hemen her protein veya tercih edilen peptitten in vitro amiloid fibrilleri hazırlamak için hızlı ve esnek bir yol sunar. Birkaç farklı amiloid türü güvenilir bir şekilde hazırlanabilir - yalnızca protein içeren fibriller veya DNA, RNA veya glikozaminoglikanlar içeren hibrit agregatlar. İlgili prosedürler basit, anlaşılırdır ve ileri düzeyde teknik eğitim gerektirmez. Bu yöntemle hazırlanan amiloid oldukça stabildir ve 4 ºC'de güvenle saklanabilir veya -80 ºC'de daha uzun süre dondu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe AI074809 ve Texas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Araştırma Hibe Programı'ndan WC'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES)Sigma-AldrichM8250
NaClFisherBP358-10
1-etil-3 - [3-dimetil-aminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC)Thermo / Pierce22980
Somon sperminden DNASigmaD1626
Torula mayasındanRNA SigmaR6625
Domuz bağırsak mukozasından heparinSigmaH3149
Tris tabanıFisherBP152-1
Ekipman:
Su banyosuFisher ScienceIsotemp 210
Slide-A-Lyzer diyaliz kasetiThermo / Pierce66380

Kaynaklar

  1. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  2. Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
  3. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
  5. Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).
  6. Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Barnhart, M. M., Chapman, M. R. Curli Biogenesis and Function. Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).
  9. Claessen, D., et al. A n olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils. Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).
  10. Maji, S. K., et al. Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules. Science. 325, 328-332 (2009).
  11. Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. Functional Amyloids Signal Their Arrival. Sci. Signal. 2, pe43(2009).
  12. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  13. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  14. Stefani, M. Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity. FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).
  15. Glabe, C. G. Structural classification of toxic amyloid oligomers. J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).
  16. Di Domizio, J., et al. Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid. J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).
  17. Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).
  18. Jiménez, J. S. Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis. J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).
  19. Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin. J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).
  20. Vetri, V., et al. Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism. Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).
  21. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  22. McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin. Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).
  23. Chiti, F., et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).
  24. McParland, V. J., et al. Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro. Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).
  25. Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).
  26. Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid. Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).
  27. Di Domizio, J., et al. Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).
  28. Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol. 9, 857(2008).
  29. Masters, S. L., O'Neill, L. A. Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome. Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Amiloid Olu umuProtein Yanl KatlanmasMES TamponuIs ile kt rmeEDC apraz Ba lanmasN kleik Asit AmiloidiHeparin Amiloidiz n r Protein OligomerleriJel Kayma AnaliziSitotoksisite Analizi
İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.