Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İndirgeyici Olarak Metillenmiş Proteinler Üzerindeki 13C-Dimetil N-terminal Amin'in NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri

5.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50875

⸱

12 Aralık 2013

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

Bu makalede

Özet

İndirgeyici olarak 13C-metillenmiş N-terminal lizinin α- ve ε-dimetilamin nükleer manyetik rezonans sinyallerini atamak için iki yöntem açıklanmıştır. Bir yöntem, indirgeyici metilasyon reaksiyonunun pH ile indüklenen seçiciliğini kullanır ve diğeri, N-terminal lizini seçici olarak uzaklaştırmak için aminopeptidaz kullanır.

Özet

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, protein yapısı ve dinamik çalışmalar için kanıtlanmış bir tekniktir. NMR ile proteinleri incelemek için, kararlı manyetik izotoplar tipik olarak duyarlılığı artırmak ve sıralı rezonans atamasına izin vermek için metabolik olarak dahil edilir. İndirgeyici 13C-metilasyon, izotop dahil etmenin en yaygın yöntemi olan bakteriyel konakçı aşırı ekspresyonuna uygun olmayan proteinler için alternatif bir etiketleme yöntemidir. İndirgeyici 13C-metilasyon, bir proteinin birincil amino gruplarını (lizin ε-amino grupları ve N-terminal α-amino grubu) 13C-dimetilamino grubuna değiştiren hafif koşullar altında gerçekleştirilen kimyasal bir reaksiyondur. Çoğu proteinin yapısı ve işlevi, modifikasyon tarafından değiştirilmez, bu da onu metabolik etiketlemeye uygun bir alternatif haline getirir. İndirgeyici 13C-metilasyonu seyrek, izotopik etiketler eklediğinden, NMR sinyallerini atamanın geleneksel yöntemleri geçerli değildir. Protein 13C-dimetilamin NMR sinyallerinin atanmasına yardımcı olmak için kütle spektrometresi (MS) kullanan alternatif bir atama yöntemi geliştirilmiştir. Yöntem, her bir birincil amino grubunda kısmi ve farklı miktarlarda 13C-etiketlemesine dayanır. Yöntemin bir sınırlaması, proteinin N-terminal kalıntısı bir lizin olduğunda ortaya çıkar, çünkü Lys1'in α- ve ε-dimetilamino grupları MS ile ayrı ayrı ölçülemez. Bu sınırlamayı aşmak için, hem N-terminal α-amin hem de yan zincir ε-amin ile ilişkili 13C-dimetilaminin NMR rezonansını tanımlamak için iki yöntem açıklanmaktadır. Tavuk yumurtası akı lizoziminin N-terminal α-dimetilamin ve yan zincir ε-dimetilamin, Lys1'in NMR sinyalleri, 1 H-13C heteronükleer tek kuantum tutarlılık spektrumunda tanımlanır.

Giriş

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, proteinler1 için değerli bir yapı açıklama aracıdır. NMR spektroskopisi, bir proteinin doğal durumundaki çözelti yapısını belirlemek için kullanılabilir. Kararlı manyetik izotopların düşük doğal bolluğunun üstesinden gelmek için, 13C ve 15N'yi ilgilenilen proteine dahil etmek gerekir. Kullanılan en yaygın yöntem, bir bakteri konakçısı2-3'te rekombinant ekspresyondur. Bununla birlikte, bakteriyel konak aşırı ekspresyonunun iki dezavantajı, translasyon sonrası modifikasyonlar üretememesi ve tüm proteinler3-4 için çalışmamasıdır. Bakteriyel ekspresyonu protein üretimi için uygun bir yol olmadığında, bakteriyel olmayan konakçılarda aşırı ekspresyon kullanılabilir, ancak izotopik etiketleme zor ve pahalıdır5. NMR analizi için 13C ve 15N izotoplarının proteinlere dahil edilmesi için alternatif ekspresyon yöntemleri, metil etiketleme6 ve tek 13C, 15N amino asitler7-9 için metabolik öncüleri kullanan seyrek etiketleme tekniklerini içerir. Burada kullanılan seyrek etiketlemeye kimyasal bir yaklaşım, bir protein üzerindeki birincil amino gruplarının - N-terminal α-amin ve lizin, yan zincir ε-aminler - metillendiği, iyi bilinen indirgeyici 13C-metilasyon reaksiyonudur (Şekil 1). Monometilaminler oluşturulduktan sonra, amin, dimetilaminler oluşturmak için daha yüksek pKa değeri nedeniyle kolayca tekrar metilasyona uğrar.

İndirgeyici metilasyon ilk olarak Means ve Feeney10 ile proteinleri kimyasal olarak modifiye etmek için bir yöntem olarak tanıtıldı. Bu reaksiyonun avantajları, geniş uygulanabilirliği ve tamponlu, fizyolojik pH ve düşük sıcaklıklarda hafif reaksiyon koşullarıdır11,12. Formaldehit ve dimetilamin boran kompleksi (DMAB) gibi bir indirgeyici ajanın varlığında, lizin ε-amino grupları ve N-terminal α-amino grubu, dimetillenmiş aminler üretmek için seçici olarak metillenir. Formaldehitin metilen köprülerinin oluşumu yoluyla proteinleri çapraz bağladığı bilinmesine rağmen, bu işlem indirgeyici ajan13,14 tarafından bloke edilir.

İndirgeyici metilasyon, hem NMR hem de x-ışını kristalografisi ile proteinleri incelemek için başarıyla kullanılmıştır. İndirgeyici metilasyon, aksi takdirde inatçı proteinlerin kristalleşmesini kolaylaştırmak için kullanılır15. Tavuk yumurtası akı lizozim, dimetillenmiş formunda kristalize olan ilk proteindi. Metillenmiş ve metillenmemiş lizozim yapılarındaki ağır atomlar arasındaki kök-ortalama kare farkı 0.40 Å16'dır. Bu karşılaştırma, indirgeyici metilasyondan sonra protein yapısının korunabileceğini ve reaksiyonu yapı aydınlatması için uygun bir etiketleme aracı haline getirdiğini göstermektedir.

İndirgeyici metilasyon reaksiyonunda 13C-etiketli formaldehit kullanılarak, 13C-dimetillenmiş amin üretilir. 13C-dimetilamin, protein dinamiklerini, yapısını ve işlevini incelemek için yaygın olarak kullanılan NMR ile tespit edilebilir problardır. NMR ve indirgeyici 13C-metilasyon, β2 adrenerjik reseptör17, ribonükleaz A18, lizozim19, fd geni 5 protein20 ve sitokrom c21 için protein-ligand ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, indirgeyici olarak 13C-metillenmiş ribonükleaz A22, lizozim23, fd geni 5 protein24, Clostridium pasteurianum ferredoksin25, IgG26'nın Fc fragmanı, apolipoprotein A-I27 ve MIP-1α28'in yapısal ve fonksiyonel özellikleri incelenmiştir 13C-dimetilamino grubunun dinamikleri, concanavalin A29-30 ve kalmodulin31 üzerinde incelenmiştir.

İndirgeyici 13C-metilasyonu, NMR ile proteinleri incelemek için yaygın olarak kullanılmış olsa da, etiketleme yöntemi her zaman NMR rezonanslarını26 atamanın zorluklarıyla sınırlı kalmıştır. İndirgeyici olarak 13C-metillenmiş proteinler için çoğu atama stratejisi, az sayıda bölgeye,20,28 bilinen yapısal özellikleredayanmaktadır 11,19,23,26,31,32. veya kapsamlı genetik modifikasyonlar33. Bu çalışmaların hiçbiri, piklerin her bir lizin33'ün bölgeye yönelik mutajenezi ile atandığı kalmodulin çalışması dışında, tüm 13C-dimetilamin zirvesini başarılı bir şekilde atamadı. MIP-1α dimer oluşumu çalışmasında, indirgeyici olarak 13C-metillenmiş aminlerin NMR atamasına yardımcı olmak için kütle spektrometresinin (MS) kullanımı ilk olarak rapor edilmiştir28. Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi (MALDI-TOF) MS, dimerin arayüzündeki lizini tanımlamak için kullanıldı. İnsan MIP-1α triptik peptitlerinin kısmen metillenmiş lizinleri MS ile tanımlandı ve 2D 1 H-13C HSQC NMR spektrumları28'de gözlenen bozulmamış proteinin mono- ve dimetilamin sinyallerinin görünümü ile ilişkilendirildi. Grubumuz MS'in kullanımını genişletti ve amino asit dizisi34 dışında proteinin yapısı veya özellikleri hakkında önceden bilgi gerektirmeyen bir atama yöntemi sundu. Bu yöntem çoğu protein için geçerlidir. Bunun bir istisnası, bir proteinin bir N-terminal lizine sahip olmasıdır, çünkü N-terminal lizin α- ve ε-13C-dimetilaminlerin MS izotopik profili bağımsız olarak ölçülemez.

Burada, bir N-terminal lizin kalıntısının N-terminal α-dimetilamin ve yan zincir ε-dimetilamin bölgelerini tanımlamak için biri kimyasal diğeri enzimatik olmak üzere iki yöntem sunuyoruz. İlk yöntem Córdova ve arkadaşlarından esinlenmiştir.protein asetilasyonunun seçiciliğini kontrol etmek için pH kullanan,35. Reaksiyon, düşük pH'ta N-terminal α-amini ve yüksek pH'ta yan zincir ε-aminleri tercih eder ve protein α- ve ε-amino gruplarının çalışmalarında kılcal elektroforez35 ile ayırt edilmesini sağlar. İndirgeyici 13C-metilasyon reaksiyonunu kullanarak protein amino gruplarının etiketlenmesini değiştirmek ve MS destekli atama stratejisinin uygulanmasına izin vermek için yüksek ve düşük pH'ın nasıl kullanıldığını gösteriyoruz. N-terminal α- ve ε-13C-dimetilaminleri atamak için ikinci yöntem, rekombinant Aeromonas proteolytica aminopeptidaz kullanılarak N-terminal kalıntılarının seçici olarak uzaklaştırılmasından yararlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Lizozimin İndirgeyici Metilasyonu

  1. pH 7.5'te 500 ml 50 mM sodyum fosfat tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
  2. Tam etiketli numune (FLS), düşük pH'lı kısmen etiketli numune (LpH) ve yüksek pH'lı kısmen etiketli numune (HpH) için üç adet 1 ml'lik mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin.
  3. 10 mg lizozimi tartın ve 5 mg / ml konsantrasyonda sulu bir çözelti oluşturmak için 2 ml sodyum fosfat tamponu içinde çözün. Formaldehitin ışığa maruz kalma nedeniyle bozulmasını önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün. Her tüpe 500 μl lizozim çözeltisi ekleyin.
  4. Taze 1.0 M dimetilamin boran kompleksi (DMAB) ve 13C-formaldehit çözeltileri hazırlayın. 0 °C'de saklayın.
  5. Tam etiketli numune için 1:10'luk bir molar oran (reaktif amin: formaldehit) kullanın ve kısmen etiketlenmiş numuneler için 1:5 oranı kullanın. Alternatif olarak, oran optimize edilebilir. Örneğin, düşük pH'ta α-13C-dimetilamin zirvesinin baskınlığını görmek için 2:7 oranı gerekliydi.
  6. FLS'ye 6.1 μl 1.0 M DMAB ekleyin, LpH ve HpH'ye 3.2 μl 1.0 M DMAB ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Daha sonra FLS'ye 12.3 μl 1.0 M 13C-formaldehit ve LpH ve HpH'ye 6.1 μl 1.0 M 13C-formaldehit ekleyin. Reaksiyon karışımlarını 4 °C'de 2 saat çalkalayın.
  7. Önceki adımda olduğu gibi 1.0 M DMAB ve 13C-formaldehitten oluşan başka bir alikot ekleyin ve reaksiyon karışımını toplam 18-24 saatlik bir reaksiyon süresi için gece boyunca 4 °C'de çalkalayın.
  8. Bir santrifüj filtre (3 kDa moleküler ağırlık kesmesi) kullanarak fazla reaktifleri ve yan ürünleri çıkarmak için numunenin tamponunu pH 7.5'te fosfatla değiştirin.
  9. Kısmen etiketlenmiş numuneler için, homojen olarak modifiye edilmiş bir protein oluşturmak için numuneleri pH 7.5'te doğal bolluk formaldehit ile indirgeyici olarak metilleyin. Yeni 1,0 M DMAB ve doğal bolluk formaldehit çözeltileri hazırlayın.
  10. Numune tüplerini folyo ile örtün, LpH ve HpH'ye 6.1 μl DMAB ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Ardından 12.3 μl doğal bolluk formaldehit ekleyin. Reaksiyon karışımlarını 4 °C'de 2 saat çalkalayın.
  11. Önceki adımda olduğu gibi 1.0 M DMAB ve doğal bollukta formaldehitten oluşan başka bir alikot ekleyin ve reaksiyon karışımlarını toplam 18-24 saatlik bir reaksiyon süresi için gece boyunca 4 °C'de çalkalayın. Daha sonra 2.5-2.6 adımlarını kullanarak tampon değişimi yapın ve MS için 50 μg numuneleri -20 °C'de saklayın.

2. Numuneyi NMR Analizi için Hazırlayın

  1. H2O'da pH 8.5'te 2.0 M'lik bir sodyum borat tampon çözeltisi hazırlayın.
  2. Dört adet 15 ml'lik konik tüpe 375 μl 2.0 M sodyum borat tampon çözeltisi ekleyin. Üstleri parafilm yapın ve delikleri açın. Şişeyi bir liyofilizan şişeye yerleştirin ve numuneyi dondurun.
  3. Dondurulmuş numuneyi kuruması için bir liyofilizatör üzerine yerleştirin. Kuruduğunda çıkarın.
  4. Bir pipet kullanarak, her tüpe 15 ml D2O ekleyin ve karıştırın.
  5. Üç adet 4 ml'lik santrifüj filtreyi (3 kDa moleküler ağırlık kesme) FLS, LpH ve HpH ile etiketleyin. İlgili numuneyi filtre tüplerine (~500 μl) ekleyin. Her tüpe pH 8.5'te 3.0 ml 50 mM sodyum borat tamponu ekleyin. Üçüncü tüp için bir denge tüpü yapın ve 4 °C ve 7.500 rcf'de 35 ° sabit açılı rotorlu bir santrifüj kullanarak numuneleri 500 μl'ye konsantre edin.
  6. Her filtrenin altındaki tuzağı boşaltın. Numunelere 3.0 ml daha tampon ekleyin ve numuneleri tekrar 500 μl'ye konsantre edin. Adım 2.5 4x'i tekrarlayın.
  7. Bikinkoninik asit (BCA) protein tahlili36'yı kullanarak, her bir numunenin konsantrasyonunu belirleyin. 150 μM numune yapmak için lizozim numunelerini 50 mM sodyum borat tamponu ile seyreltin.
  8. 530 μl'yi 5 mm'lik bir NMR tüpüne veya 250 μM'yi 5 mm'lik manyetik duyarlılığa uygun bir tüpe aktarın.
  9. D2O'da 1,2-dikloroetan-13 C2'den oluşan 80 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Bu stok çözeltisini -80 ° C'de saklayın. 80 μl'de 24 mM'ye seyreltin ve NMR analizinde referans olarak kullanmak için koaksiyel yerleştirme tüpüne aktarın. Örnekleri NMR ile analiz edin. Not: Bir 1D 1 H-13C HSQC çalıştırın ve her rezonans için tepe alanlarını entegre edin. Tam etiketli numune için tepe alanları aynı olmalıdır.

3. Lizozimin Aminopeptidaz Bozunması

  1. Ultra saf suda 5 mg / ml'lik bir lizozim çözeltisi hazırlayın.
  2. Temiz, 1 ml'lik bir santrifüj tüpüne 250 μl lizozim çözeltisi ekleyin.
  3. 25 μl 0.1 M trisin çözeltisi, pH 8.0 ve 6 μl 2.16 μg / ml Aeromonas proteolytica aminopeptidaz çözeltisi ekleyin.
  4. 37 °C'de 6 saat inkübe edin.
  5. Aminopeptidazın lizozime 1:50 molar oranı için numuneye 6 μl daha 2.16 μg/ml aminopeptidaz çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 20 saat daha inkübe edin.
  6. Bir C18 döndürme sütunu kullanarak numunenin 30 μl'sini tuzdan arındırın (üreticinin protokolünü izleyin). MALDI MS analizi için -20 °C'de saklayın.
  7. Kalan protein örneğini protokol 2'de açıklandığı gibi NMR için hazırlayın).

4. Kütle Spektrometresi için Numune Hazırlayın

  1. Adım 2.3'te ayrılan 50 μg numuneyi kullanarak, tamponu 100 mM amonyum bikarbonat, pH 8.0 ile değiştirin ve 1 ml'lik bir santrifüj filtre (3 kDa moleküler ağırlık kesme) kullanarak yaklaşık 50 μl'ye konsantre edin. Numuneyi 1 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve alüminyum folyoya sarın.
  2. Disülfid bağlarını azaltmak için 2.0 μl 500 mM ditiyotreitol ekleyin. Çözeltiyi 60 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  3. Tiyol gruplarını alkillemek için 2 μl taze hazırlanmış 500 mM iyodoasetamid ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  4. Folyoyu çıkarın ve reaksiyonu söndürmek için 1.0 μl 500 mM ditiyotreitol çözeltisi ekleyin.
  5. Proteini sindirmek için 2.0 μg sıralama dereceli tripsin ekleyin. Karışımı 37 °C'de 16-24 saat inkübe edin.
  6. Sindirimi gidermek için pH 2'den az olana kadar TFA ekleyin. (Formik ve asetik asitler de kullanılabilir)
  7. Numuneyi bir C18 döndürme kolonunda tuzdan arındırın ve proteini %80 asetonitril / %0.1 TFA'da elüte edin. Numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.
  8. MALDI MS analizi için numuneyi 5.0 μl %50 asetonitril/%0.1 TFA'da sulandırın. MALDI hedef plakası üzerinde eşit hacimlerde sulandırılmış numune ve doymuş bir 2,5-dihidroksibenzoik asit matris çözeltisi çözeltisini karıştırın. Not: Peptit tepe noktalarının kimliğini doğrulamak için tandem MS kullanın. Kütle spektrumlarını düzeltin ve analiz edin. Her dimetilamin içeren peptit için, profildeki her izotopun tepe yoğunluğunu ve tepe alanını belirleyin. Daha önce açıklandığı gibi 13C-birleşmesinin yüzdesini hesaplayın34.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Redüktif Metilasyon ve pH

Lizozim üzerinde pH ile tetiklenen kemoselektif redüktif 13C-metilasyon reaksiyonu gösterilmiştir. Düşük pH'da reaksiyon, yan zincir ε-aminlerinden ziyade N-terminal α-amini tercih eder; yüksek pH'da ise durum tam tersidir. Çözeltide proteinin amino grupları, pH ile ayarlanabilen serbest amin ve konjuge asit arasındaki dengede bulunur. Bu reaksiyon için optimum pH aralığı, kullanılan indirgeyici ajana bağlıdır. Bu durumda, dimetilamin boran için optim...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu izotopik etiketleme yöntemini tam olarak kullanmak için indirgeyici olarak 13C-metillenmiş proteinin NMR sinyallerinin atanması gereklidir. Kısmi 13C-birleşme verilerinin korelasyonu yoluyla NMR sinyallerinin atanmasına yardımcı olmak için MS'nin kullanılması umut verici bir tekniktir. Bu tekniğin diğer atama yöntemlerine göre avantajı, yalnızca birincil amino asit dizisine ihtiyaç duyulmasıdır. N-terminal amino asit bir lizin olduğunda MS destekli atama yöntemi sınırlıdır çünkü α-dimeti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi'nden R00RR024105 Numaralı Ödül ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonitrilSigma34851
Amicon Ultra 4 ml santrifüj filtre (3k MWCO)Fisher ScientificUFC800308 (8pk)
AminopeptidazCreative BiomartAminopeptidaz-86A
Amonyum bikarbonatSigmaA6141
Amonyum sülfatSigmaA5132
Boran-dimetilamin kompleksiSigma180238Kullanmadan önce taze 1 M çözelti yapın.
Borik asitSigmaB6768
Sığır pankreas insüliniSigmaI5500
C18 Spin SütunlarıThermo Scientific89870
Döteryum oksitCambridge İzotop LaboratuvarlarıDLM-4-100
1,2-dikloroetan-13< / sup>C < sub>2< / sub>Sigma714321-80 ° C'de depolanan 80 mM stok çözeltisi 24 mM'de NMR spektrumlarında referans olarak kullanılır.
Formaldehit (ağırlıkça %36,5Sigma33220Kullanmadan önce taze 1 M solüsyon hazırlayın.
13C-formaldehit (%99)Cambridge İzotop LaboratuvarlarıCLM-806-1Kullanmadan önce taze 1 M solüsyon yapın.
Lizozim (tavuk yumurtası akı)SigmaL6376
Sodyum fosfat (dibazik heptahidrat)SigmaS9390
Sodyum fosfat (monobazik)SigmaS9638
TrisinSigmaT0377
Trifloroasetik asitSigma302031
700 MHz Varian VNMRS, 5 mm HCN 5922 probluAgilent Teknolojiler
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOFBruker
)

Kaynaklar

  1. Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
  2. Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
  3. Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. Recombinant Gene Expression. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).
  4. Graslund, S., et al. Protein Production and Purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  5. Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. Lessons from Structural Genomics. Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).
  6. Goto, N. K., Kay, L. E. New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).
  7. Lian, L., Middleton, D. Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR. Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).
  8. Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies. Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).
  9. Chen, C., et al. Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris. Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).
  10. Means, G., Feeney, R. Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins. Biochem. 7 (6), 2192 (1968).
  11. Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13. J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).
  12. Rayment, I. Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).
  13. French, D., Edsall, J. T. The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins. Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).
  14. Jentoft, N., Dearborn, D. G. Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride. J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).
  15. Walter, T., et al. Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization. Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).
  16. Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution. Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).
  17. Bokoch, M. P., et al. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor. Nat. 463 (7277), (2010).
  18. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).
  19. Sherry, A., Teherani, J. Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts. J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).
  20. Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding. J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.
  21. Moore, G. R., et al. N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation. Biochem. J. 332, 439-449 (1998).
  22. Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR. Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).
  23. Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme. J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).
  24. Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate. Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).
  25. Gluck, M., Sweeney, W. V. C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde. Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).
  26. Jentoft, J. E. Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments. Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).
  27. Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization. J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).
  28. Ashfield, J., et al. Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure. Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).
  29. Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A. Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).
  30. Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques. Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).
  31. Huque, M., Vogel, H. C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments. Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).
  32. Brown, L., Bradbury, J. Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A. Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).
  33. Zhang, M., Vogel, H. Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin. J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).
  34. Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins. J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).
  35. Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins. Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).
  36. Smith, P. K., et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  37. Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR. J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).
  38. Bradbury, J. H., Brown, L. R. Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy. Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).
  39. Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles. Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).
  40. Poncz, L., Dearborn, D. G. The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues. J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

NMR Rezonans AtamasıRedüktif C13 MetilasyonuProtein EtiketlemeKütle Spektrometrisi AnaliziLizozim ModifikasyonuHeteronükleer Tek Kuantum KoheransıAminopeptidaz DegradasyonuTampon Değişim ProsedürüKarbon İzotopu İnkorporasyonuN-terminal Amin Tespiti
İndirgeyici Olarak Metillenmiş Proteinler Üzerindeki 13C-Dimetil N-terminal Amin'in NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.