Botulinum nörotoksin tip A hafif zinciri (BoNT/A LC), motor nöronlara giren, substratı SNAP-25'i parçalayan ve nörotransmisyonu bozan, böylece sarkık felç ile sonuçlanan bir metalloprotazdır. Yüksek verimli uyumlu FRET tabanlı bir tahlil kullanılarak, küçük moleküllerden oluşan büyük kütüphaneler, BoNT/A LC enzimatik aktivitesi üzerindeki etkileri açısından taranabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Botulinum nörotoksin Işık Zinciri Modülatörlerin Belirlenmesi ve Karakterizasyonu için bir Yüksek verim uyumlu FRET tabanlı Platformu
Bu makalede
Özet
Özet
Botulinum nörotoksini (BoNT), konakçı motor nöronlara bağlanan, hücre içine içselleştirilen ve nörotransmitter salınımı için gerekli olan hücre içi proteinleri parçalayan güçlü ve potansiyel olarak ölümcül bir bakteriyel toksindir. BoNT, konak hücre bağlanmasına ve içselleştirilmesine aracılık eden bir ağır zincir (HC) ve asetilkolin salınımı için gerekli olan hücre içi konak proteinlerini parçalayan bir hafif zincirden (LC) oluşur. Toksin bağlanmasını / içselleştirmesini inhibe eden tedaviler küçük bir uygulama zaman penceresine sahipken, hücre içi LC aktivitesini hedefleyen bileşikler, özellikle toksinin son derece uzun yarı ömrü göz önüne alındığında, çok daha geniş bir uygulama süresine sahiptir. Son yıllarda, küçük moleküller, daha büyük terapötiklere (peptitler, aptamerler, vb.) göre artan hücresel geçirgenliklerine dayalı olarak potansiyel LC inhibitörleri olarak yoğun bir şekilde analiz edilmiştir. Kurşun tanımlaması genellikle, terapötik hedef fonksiyonu modüle etme yeteneklerine dayalı olarak büyük küçük molekül kütüphanelerinin tarandığı yüksek verimli taramayı (HTS) içerir. Burada, potansiyel BoNT inhibitörlerinin HTS'si için otomatikleştirilebilen ticari bir BoNT / A LC substratı ve rekombinant LC ile FRET bazlı bir testi açıklıyoruz. Ayrıca, takip eden ikincil tarama için veya birkaç aday bileşiğin gücünü karşılaştırmak için kullanılabilecek manuel bir teknik tarif ediyoruz.
Giriş
Botulinum nörotoksin A (BoNT/A), şu anda bilinen en güçlü toksin (LD50 ~ 1 ng / kg)1, Clostridium botulinum bakterisi tarafından üretilen güçlü bir nörotoksindir. Etkilenen bir konakçıda BoNT/A, motor nöronları bağlayarak, sitozole içselleştirerek ve nihayetinde asetilkolin ekzositozu için gerekli olan nöronal proteinleri parçalayarak nöromüsküler kavşaktaki nörotransmisyonu bozar. Bir nöronun içine girdikten sonra, BoNT / A birkaç ay kadar devam edebilir2. Asetilkolin salınımının uzun süreli inhibisyonu normal kas kasılmasını engeller ve ciddi vakalarda kalp ve/veya solunum yetmezliği ile sonuçlanabilen sarkık felç ile sonuçl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Manuel Tarama veya IC50 Tayini
Bu protokol, bileşiğin bir seyreltme serisini hazırlayarak bir bileşiğin nispi gücünü (IC50 değeri) belirlemek veya tek bir konsantrasyonda küçük moleküllü inhibitörleri manuel olarak taramak için kullanılabilir.
1. Tamponların, Reaktiflerin ve Gerekli Enstrümantasyonun Hazırlanması
- 50 ml tahlil tamponu (40 mM HEPES, pH 7.4 ve% 0.01 Tween-20) hazırlayın ve filtre sterilize edin. Tampon birkaç ay boyunca oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
- Test tamponunda rekombinant botulinum nörotoksin / A hafif zincirinin (LC / A (1-425)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
FRET tabanlı BoNT/A LC testi, bilinen inhibitörleri karakterize etmek veya küçük kütüphaneleri taramak için düşük kapasiteli bir şekilde manuel olarak gerçekleştirilebilir; alternatif olarak, yeni BoNT/A LC inhibitörleri tanımlama amacıyla protokol, büyük kütüphanelerle yüksek kapasiteli tarama (HTS) için ölçeklendirilip otomatize edilebilir. İzlenen yaklaşımdan bağımsız olarak, BoNT/A LC substrat ile inkübe edildiğinde zamanla floresan artışı gözlemlenmelidir (Şekil 1A, zamana bağlı floresan değişimini .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan FRET tabanlı BoNT/A LC testi, BoNT/A LC aktivitesini modüle eden küçük molekülleri tanımlamak ve karakterize etmek için çekici bir yöntemi temsil eder. Testin çözüme dayalı doğası, bu protokolü Protokol Metninin Otomatik İşlem bölümünde açıklanan yüksek verimli taramaya uygun hale getirir. Z faktörü genellikle bir testin HTS kampanyaları için uygunluğunu belirlemek için kullanılır18. Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μn) olarak belirlendiğinde, 1'lik bir Z f.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI082190 to T.J.D.) ve California Rejeneratif Tıp Enstitüsü'nden (TB1-01186 ve CL1-00502) bir hibe ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| HEPES | Teknova | H1021 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Metanol (HPLC sınıfı) | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| İzopropanol (HPLC sınıfı) | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| 96 kuyulu Siyah tahlil plakası | Costar | 3915 | |
| 384 kuyulu Düşük hacimli siyah tahlil plakası | Greiner | 788076 | |
| SNAPtide FITC/Dabcyl substrat | Listesi Biyolojik Laboratuvarlar | 521 | FRET bazlı BoNT/A LC substrat |
| Pin temizleme solüsyonu | V& P Scientific | VP 110 | |
| Tüy bırakmayan kurutma kağıdı | V& P Scientific | VP 540DB | |
| Biomek Mühür ve Numune Alüminyum folyo kapaklar | Beckman Coulter | 538619 |
Kaynaklar
- Schantz, E. J., Johnson, E. A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).
- Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
