Method Article

Botulinum nörotoksin Işık Zinciri Modülatörlerin Belirlenmesi ve Karakterizasyonu için bir Yüksek verim uyumlu FRET tabanlı Platformu

DOI:

10.3791/50908

⸱

December 27th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, 2Worm Institute of Research and Medicine (WIRM), The Scripps Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botulinum nörotoksin tip A hafif zinciri (BoNT/A LC), motor nöronlara giren, substratı SNAP-25'i parçalayan ve nörotransmisyonu bozan, böylece sarkık felç ile sonuçlanan bir metalloprotazdır. Yüksek verimli uyumlu FRET tabanlı bir tahlil kullanılarak, küçük moleküllerden oluşan büyük kütüphaneler, BoNT/A LC enzimatik aktivitesi üzerindeki etkileri açısından taranabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botulinum nörotoksini (BoNT), konakçı motor nöronlara bağlanan, hücre içine içselleştirilen ve nörotransmitter salınımı için gerekli olan hücre içi proteinleri parçalayan güçlü ve potansiyel olarak ölümcül bir bakteriyel toksindir. BoNT, konak hücre bağlanmasına ve içselleştirilmesine aracılık eden bir ağır zincir (HC) ve asetilkolin salınımı için gerekli olan hücre içi konak proteinlerini parçalayan bir hafif zincirden (LC) oluşur. Toksin bağlanmasını / içselleştirmesini inhibe eden tedaviler küçük bir uygulama zaman penceresine sahipken, hücre içi LC aktivitesini hedefleyen bileşikler, özellikle toksinin son derece uzun yarı ömrü göz önüne alındığında, çok daha geniş bir uygulama süresine sahiptir. Son yıllarda, küçük moleküller, daha büyük terapötiklere (peptitler, aptamerler, vb.) göre artan hücresel geçirgenliklerine dayalı olarak potansiyel LC inhibitörleri olarak yoğun bir şekilde analiz edilmiştir. Kurşun tanımlaması genellikle, terapötik hedef fonksiyonu modüle etme yeteneklerine dayalı olarak büyük küçük molekül kütüphanelerinin tarandığı yüksek verimli taramayı (HTS) içerir. Burada, potansiyel BoNT inhibitörlerinin HTS'si için otomatikleştirilebilen ticari bir BoNT / A LC substratı ve rekombinant LC ile FRET bazlı bir testi açıklıyoruz. Ayrıca, takip eden ikincil tarama için veya birkaç aday bileşiğin gücünü karşılaştırmak için kullanılabilecek manuel bir teknik tarif ediyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botulinum nörotoksin A (BoNT/A), şu anda bilinen en güçlü toksin (LD50 ~ 1 ng / kg)1, Clostridium botulinum bakterisi tarafından üretilen güçlü bir nörotoksindir. Etkilenen bir konakçıda BoNT/A, motor nöronları bağlayarak, sitozole içselleştirerek ve nihayetinde asetilkolin ekzositozu için gerekli olan nöronal proteinleri parçalayarak nöromüsküler kavşaktaki nörotransmisyonu bozar. Bir nöronun içine girdikten sonra, BoNT / A birkaç ay kadar devam edebilir2. Asetilkolin salınımının uzun süreli inhibisyonu normal kas kasılmasını engeller ve ciddi vakalarda kalp ve/veya solunum yetmezliği ile sonuçlanabilen sarkık felç ile sonuçlanır. Aşırı potansiyeli, üretim kolaylığı ve konakçı içindeki uzun vadeli etkileri nedeniyle, CDC tüm BoNT serotiplerini yüksek riskli biyoterörizm ajanları olarak etiketlemiştir.

Toksinin etki mekanizması, nöronal yüzey reseptörlerine bağlanma, reseptör aracılı endositoz yoluyla hücresel alım ve nöron sitozolüne translokasyon dahil olmak üzere çok sayıda adımı içerir. BoNT/A, ağır ve hafif zincir olmak üzere iki zincirden oluşur ve toksisite için her iki zincir de gereklidir. Ağır zincir (HC), bağlanma ve translokasyon alanlarını içerirken, hafif zincir (LC), endozomdan sitoplazmaya yer değiştiren çinkoya bağımlı bir metalloprotazdır. Sitozolün içine girdikten sonra, LC / A metalloprotaz iç sitoplazmik zara lokalize olur ve zara bağlı konak proteini SNAP-25'i parçalar. SNAP-25, asetilkolin ekzositozunda çok önemli bir rol oynayan SNARE (Çözünür N-Etilmaleimide Duyarlı Faktör Bağlanma Protein Reseptörü) protein ailesinin bir üyesidir (referans3'te gözden geçirilmiştir). SNAP-25'in LC/A bölünmesi, asetilkolin nörotransmitter salınımını inhibe eden ve kas kasılmasını bozan SNARE kompleks fonksiyonunu bozar.

Şu anda, botulizm tedavisi sınırlıdır ve genellikle bir at nötralize edici antikor4'ün uygulanmasını içerir; Bununla birlikte, toksin hızla nöronlara içselleştirildiğinden, antikor dar bir uygulama süresine sahiptir. Bu nedenle, birçok araştırmacı BoNT / A LC'nin daha iyi bir terapötik hedef olabileceğine inanmaktadır. LC, çinkoya bağımlı bir metaloproteaz olduğundan, LC / A aktivitesini inhibe etmek için bir yaklaşım, aktif bölge çinko iyonunu şelatlayan bileşikler geliştirmek olmuştur. Örneğin, hidroksamat bileşikleri aktif bölge çinkosunu şelatlar ve mükemmel in vitro potansiyele sahiptir (bugüne kadarki en iyi BoNT / A LC küçük molekül inhibitörünün Ki değeri 77 nM'dir)5. Bununla birlikte, birçok küçük molekül, zayıf suda çözünürlük, hızlı metabolizma ve/veya yüksek sitotoksisite dahil olmak üzere ex vivo veya in vivo çeşitli problemler nedeniyle terapötik olarak ilerleyemez. Bu nedenle, gelişmiş farmakolojik ve farmakokinetik özelliklere sahip yeni bileşiklere ihtiyaç vardır. Küçük moleküllü bileşik tanımlaması, yeni yapı iskelelerini tanımlamak için genellikle yüksek verimli taramayı (HTS) içerir. BoNT / A LC aktivite taraması için ilk yöntemler, zaman alıcı olan ve HTS uygulamalarına uygun olmayan kısa peptit substrat bölünmesinin HPLC tespitine dayanıyordu6-8. Daha sonra, Schmidt ve meslektaşları9, bir mikrotitre plakasına kovalent olarak bağlanmış floresein etiketli bir peptit substratı kullanan yüksek verimli bir BoNT / A LC aktivite testi geliştirdiler. BoNT/A LC, substratı parçalar ve bir florometre ile ölçülebilen floresein salgılar. Bu testin plaka formatı, çok sayıda bileşiğin aynı anda taranmasına izin verir; Bununla birlikte, tahlil, sentetik peptitlerin floresein ile etiketlenmesini ve tahlil plakalarının hantal teknikler olan türetilmiş substrat molekülleri ile kaplanmasını gerektirir. Düşük konsantrasyonlarda BoNT / A LC aktivitesini tespit etmek için çok daha basit bir yöntem daha sonra Schmidt ve ark. tarafından tanımlanmıştır, burada BoNT LC aktivitesini gerçek zamanlı olarak izlemek için bir dizi florojenik substrat kullanılmıştır10. Literatürde açıklanan ek teknikler arasında, ham ekstraktlarda BoNT aktivitesini tespit etmek ve ölçmek için rezonans enerji transferine dayalı testten sonra bir depolarizasyon; Bu yöntem, floresan rezonans enerji transferini (FRET) ve polarizasyon sinyallerini ölçmek için gelişmiş ekipman gerektirmesine rağmen, yüksek verimli uygulamalar10,11 için kullanılabilir. Son olarak, araştırmacıların sitotoksisite, hücre geçirgenliği ve stabilite dahil olmak üzere daha önce bahsedilen bileşiklerin genellikle sınırlayıcı özelliklerini incelemelerini sağlayacak BoNT zehirlenmesi için birkaç hücre bazlı model bildirilmiştir (referans11'de gözden geçirilmiştir). Bununla birlikte, mevcut hücre bazlı tahlillerin çoğu HTS'ye uygun değildir ve emek ve zaman yoğundur.

Burada, ticari olarak temin edilebilen FRET tabanlı BoNT/A LC substratını kullanan bir HTS yöntemi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Substrat, SNAP-25 bölünme dizisine dayanır ve bir terminal florofor ve söndürücü içeren sentetik bir 13-mer peptittir. BoNT/A bölünmesi, florofor ve söndürücüyü ayırır, FRET'i ortadan kaldırır ve bir florometre plaka okuyucusunda sürekli olarak ölçülebilen ölçülen floresansı artırır. Test, yeni BoNT/A LC inhibitör sınıflarını tanımlamak veya daha önce tanımlanmış bileşiklerin5,12-15 nispi gücünü belirlemek için diğer laboratuvarlarda olduğu gibi bizim de rutin olarak kullanılmaktadır. Bu tahlil, basitliği, otomasyon potansiyeli, düşük malzeme maliyeti ve aynı anda çok sayıda bileşiğin taranabilmesi nedeniyle HTS için uygundur (bkz. referans16; Caglič ve ark., sunulan; Bompiani ve diğerleri, hazırlık aşamasında). HTS'ye ek olarak, bu test, bir bileşiğin IC50 değerini (BoNT / A LC aktivitesinin% 50'sini inhibe etmek için gereken konsantrasyon) belirleyerek bileşiklerin nispi gücünü karşılaştırmak için kullanılabilir. Tahlil, 96 oyuklu bir formatta manuel olarak (Protokol Metninin Manuel Tarama bölümü) veya HTS için 384 oyuklu bir formatta (Protokol Metninin Otomatik Operasyon bölümü) otomatik olarak gerçekleştirilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manuel Tarama veya IC50 Tayini

Bu protokol, bileşiğin bir seyreltme serisini hazırlayarak bir bileşiğin nispi gücünü (IC50 değeri) belirlemek veya tek bir konsantrasyonda küçük moleküllü inhibitörleri manuel olarak taramak için kullanılabilir.

1. Tamponların, Reaktiflerin ve Gerekli Enstrümantasyonun Hazırlanması

  1. 50 ml tahlil tamponu (40 mM HEPES, pH 7.4 ve% 0.01 Tween-20) hazırlayın ve filtre sterilize edin. Tampon birkaç ay boyunca oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.
  2. Test tamponunda rekombinant botulinum nörotoksin / A hafif zincirinin (LC / A (1-425))17 70 nM'lik bir çalışma seyreltmesini hazırlayın, hafifçe girdap yapın ve buz üzerinde saklayın. Her bir bileşiğin test edilmesi, en az 120 μl LC / A çalışma seyreltmesi gerektirir.
  3. % 10 DMSO içeren tahlil tamponunda 7 μM FRET bazlı BoNT / A LC substrat çalışma seyreltmesi hazırlayın. Başlangıçta, substratın 5 mM'lik bir stok çözeltisini uygun bir hacimde% 100 DMSO seyreltin, ardından yavaşça (damla olarak) yavaşça (damla yönünde) yavaşça karıştırırken tahlil tamponunu ekleyin. Folyoya sarın ve buz üzerinde saklayın. Her bir bileşiğin test edilmesi, en az 130 μl substrat çalışma seyreltmesi gerektirir.
  4. Plakayı 10 saniye boyunca orta hızda sallamak için bir floresan mikrotitre plaka okuyucusunu yapılandırın, ardından floresansı RT'de 90 dakika boyunca her 5 dakikada bir (kinetik mod) sırasıyla 490 nm ve 523 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında izleyin. Ürün oluşumunun (yani floresanstaki artışın) bu süre boyunca doğrusal olduğunu unutmayın (Şekil 1A).

2. Bileşik Seyreltme Serilerinin Hazırlanması

  1. Bileşik konsantrasyon aralığını belirleyin (yani seyreltme serisindeki seyreltme sayısı ve seyreltme faktörü); konsantrasyon aralığı, optimum eğri uyumunu sağlamak için beklenen IC50 değerine göre seçilir. Bilinmeyen bir IC50'ye sahip bileşikler için, en yüksek bileşik konsantrasyonu olarak seyreltilmemiş bileşik stoğu kullanın.
  2. Tüpleri uygun bileşik adı ve konsantrasyonu ile etiketleyin.
  3. Bileşik seri seyreltme için hazırlamak için tüm tüplere% 100 DMSO ekleyin. Tahlil plakasındaki oyuk başına her konsantrasyondan 1 μl'nin kullanıldığı minimum 2 μl nihai seyreltme hacmi önerilir. Örneğin, standart bir 1:3 seyreltme serisi, tüp başına 2 μl bileşiğin 4 μl DMSO ile karıştırılmasını gerektirir.
  4. Bileşiklerin seri dilüsyonlarını hazırlayın ve girdap yapın veya her seyreltme arasında manuel olarak iyice karıştırın; Her seyreltme arasında pipet uçlarını değiştirin. Standart 1: 3 seyreltme serisi için, seyreltme serisinin ilk tüpündeki 4 μl DMSO'ya 2 μl seyreltilmemiş bileşik ekleyin ve iyice karıştırın. Yeni bir pipet ucu ile, ilk seyreltmenin 2 μl'sini çıkarın ve ikinci tüpte 4 μl DMSO'ya ekleyin; İyice karıştırın. Kalan seyreltmeler için tekrarlayın. Bileşik konsantrasyonlarının doğru olduğundan emin olmak için bileşik seyreltmelerini iyice karıştırdığınızdan emin olun.
  5. Bileşik tüpleri kapatın ve RT'de bir kenara koyun.

3. Plaka Hazırlama ve Lekelenme (Tablo 1)

  1. Düz tabanlı, opak, siyah 96 oyuklu bir plaka elde edin. Her bir bileşik seyreltme serisinin 1 oyuklu bir plakanın satırları halinde biçimlendirildiği Tablo 96'deki önerilen plaka kurulumuna bakın. İlgili bileşik seyreltmesinin 1 μl'sini doğrudan karşılık gelen her bir kuyucuğun (kuyu 1-9) dibine manuel olarak dağıtın. Test edilecek en yüksek bileşik konsantrasyonundan 1 μl'yi kuyu 11'e dağıtın (bileşik içsel floresan kontrolü).
  2. Bilinen güçlü bir inhibitörün 1 μl'sini kuyu 12'ye (pozitif kontrol) ve 1 μl'lik %100 DMSO'yu kuyu 10'a (negatif kontrol) manuel olarak dağıtın.
  3. Otomatik bir pipetleyici ile, 1-10 ve 12 numaralı kuyuların (bileşik seyreltmeler ve pozitif kontrol) yanına 79 μl tahlil tamponu ve 11 numaralı kuyunun yanına (bileşik içsel floresan kontrolü) 89 μl tahlil tamponu dağıtın. Kuyuları çapraz kontamine etmemek için bileşiğin bulunduğu kuyunun dibine uca dokunmadığınızdan emin olun.
  4. LC / A çalışma seyreltmesini girdaplayın ve kuyu 11 (bileşik içsel floresan kontrolü) hariç her bir oyuğun yanına 10 μl eklemek için otomatik bir pipetleyici kullanın. Eklenen tüm enzimin kuyunun dibine gittiğinden emin olmak için plakaya hafifçe vurun.
  5. Plakayı RT'de 5 dakika boyunca yavaşça karıştırın, örtün ve inkübe edin. Bu inkübasyon, substrat ilavesinden önce bileşiklerin LC/A'ya bağlanması için bir ön denge adımı sağlar.

4. Substrat Ekleme ve Floresan Ölçümü

  1. BoNT/A LC alt tabakasını nazikçe girdap haline getirin ve otomatik bir pipetleyici kullanarak her bir oyuğun diğer tarafına 10 μl alt tabaka ekleyin. Alt tabakayı, enzimin daha önce eklendiği yerin karşısındaki kuyu tarafına eklediğinizden emin olun.
  2. Reaktifleri karıştırmak için plakaya hafifçe vurun, hemen plaka okuyucuya yerleştirin ve daha önce adım 1.4'te belirtilen ayarlarla floresan ölçümüne başlayın.
  3. Enzim hızları, bağıl floresan biriminin (RFU) grafiğe karşı reaksiyonun doğrusal periyodu boyunca zamana karşı grafiği çizilerek oluşturulan çizginin eğiminden hesaplanır.

Tablo 1.Önerilen tahlil plakası düzeni.

Kuyu # Kuyu açıklaması bileşik Tahlil Tamponu Substrat Lc DMSO (Türkçe) 1 Bileşik doz 1 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 2 Bileşik doz 2 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 3 Bileşik doz 3 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 4 Bileşik doz 4 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 5 Bileşik doz 5 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 6 Bileşik doz 6 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 7 Bileşik doz 7 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 8 Bileşik doz 8 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 9 Bileşik doz 9 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl --- 10 Negatif kontrol
(%100 LC aktivitesi) --- 79 μl 10 μl 10 μl 1 μl 11 Bileşik içsel floresan kontrolü 1 μl 89 μl 10 μl --- --- 12 Pozitif kontrol
(%0 LC aktivitesi) 1 μl 79 μl 10 μl 10 μl ---

Yüksek Verimli Tarama için Otomatik Çalışma

5. Tamponların, Reaktiflerin, Bileşik Plakaların, Barkodların ve Gerekli Enstrümantasyonun Hazırlanması

  1. Mühürlü stok bileşik plakalarını oda sıcaklığında en az 1 saat çözdürün.
  2. Tahlil tamponundan (40 mM HEPES, pH 7.4 ve% 0.01 Tween-20) 500 ml (veya taranacak bileşik sayısına bağlı olarak daha fazla) hazırlayın ve filtre sterilize edin. Filtrelenmiş tahlil tamponu birkaç ay boyunca RT'de saklanabilir.
  3. Test tamponunda, girdapta 8.75 nM çalışma seyreltmesi rekombinant BoNT / A LC (1-425) hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Düşük hacimli 384 oyuklu bir plakadaki her kuyucuk 8 μl gerektirir. % 10-15 fazlalık veya yaklaşık 3.7 ml veya her bir düşük hacimli 384 oyuklu plaka hazırlayın.
  4. % 10 DMSO içeren tahlil tamponunda 3.5 μM FRET bazlı BoNT / A LC substrat çalışma seyreltmesi hazırlayın. Başlangıçta substratın 5 mM stok çözeltisini doğrudan% 100 DMSO'nun uygun hacminde seyreltin, daha sonra yavaşça (damla yönünde) hafifçe karıştırırken tahlil tamponunu ekleyin. Folyoya sarın ve buz üzerinde saklayın. Düşük hacimli 384 oyuklu bir plakadaki her kuyucuk 2 μl gerektirir. Her düşük hacimli 384 oyuklu plaka için% 10-15 fazlalık veya yaklaşık 1 ml hazırlayın.
  5. Her siyah, 384 oyuklu, düşük hacimli mikrotitre plakası [tahlil plakası] için barkodları hazırlayın ve etiketi doğrudan barkod tarayıcının okuyabileceği plakanın yan tarafına yapıştırın; etiketin plaka tarafına uzanmadığından emin olun, aksi takdirde plaka taşıma ve istifleme ile çakışabilir. Plakaları sayısal sırayla istifleyin ve bir kenara koyun. Üst plakayı örtün. Bu adımın isteğe bağlı olduğunu, ancak birden fazla plaka kullanıldığında sonuçların karşılık gelen bileşiklere izlenmesini kolaylaştırdığını unutmayın.
  6. Çözülmüş, sızdırmaz stok bileşik plakaları RT'de 30 saniye boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Plaka contasını dikkatlice çıkarın, kalan yapıştırıcıyı çıkardığınızdan emin olun ve buharlaşmayı önlemek için plakayı temiz bir plastik kapakla kapatın. Plaka yüzeyinde herhangi bir yapıştırıcı varsa, otomatik kapak transferini ve plaka istiflemeyi engelleyebileceğini unutmayın. Kapalı plakayı sıvı işleyiciye bağlı bir otele yerleştirin. Plakaları açıkta tutmayın, aksi takdirde buharlaşma meydana gelir.
  7. RT'de 3-6 döngü boyunca her 30 dakikada bir (kinetik mod) sırasıyla 490 nm ve 523 nm'lik uyarma ve emisyon dalga boylarında her bir tahlil plakasının floresansını okumak için yığılmış bir floresan mikrotitre plakası okuyucusu yapılandırın.

6. Pin Aracının Hazırlanması

  1. 384 başlı pim aletinde eğilme, parçalanma veya büyük kalıntılar dahil olmak üzere herhangi bir anormallik olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
  2. Üç ayrı tepsiyi yaklaşık 1 inç %100 metanol (HPLC sınıfı), %100 izopropanol (HPLC sınıfı) ve ultra saf suda seyreltilmiş pimli alet temizleme solüsyonu ile doldurun.
  3. Temizleme istasyonunu %100 DMSO ile bir sıvı işleyici üzerinde doldurun.
  4. 2-3 adet temiz, yeni kurutma kağıdını bir tepsiye istifleyin. Robotu z ekseninde kalibre etmek önemlidir, böylece pimler kurutma kağıdıyla temas eder, ancak delmez.
  5. Yıkadıktan sonra pimleri kurutmak için çalışma alanına bir fan eki sabitleyin.
  6. Pim aletini sıvı işleyicinin robotik koluna takın ve DMSO'ya batırarak, kurutma kağıdında kurutarak, temizleme solüsyonunda 2 dakika bekleterek, kurutma kağıdında kurutarak, izopropanole batırarak, kurutma kağıdında kurutarak, metanole batırarak, kurutma kağıdında kurutarak ve son olarak fan üzerinde kurutarak pimleri önceden temizleyin.

7. Düşük Hacimli Sıvı Sebilinin Hazırlanması

  1. Sıvı dağıtıcıya düşük hacimli (1-10 μl) bir kaset takın ve uygun bir kaba bir atık hattı bağlayın.
  2. Kasetin dağıtım nozullarını görsel olarak inceleyin ve bunların eğrilmediğini, yırtılmadığını veya tıkanmadığını kontrol edin. Yağış veya kalıntılar sıvı dağılımını etkileyeceğinden kanalları ve nozulları temiz tutmak önemlidir.
  3. 30 ml ultra saf su, 30 ml %70 etanol ve ardından 30 ml ultra saf suyu tekrar doğrudan atık kabına akıtarak kanalları astarlayın.
  4. Düşük hacimli 384 kuyulu bir tahlil plakasını sıvı dağıtıcıya yerleştirin ve her kuyucuğa bilinen bir hacimde su ekleyin. Her kuyucuğun doğru hacmi aldığından ve kuyular arasında herhangi bir dökülme veya çözelti dağıtılmadığından emin olmak için görsel olarak inceleyin.
  5. Suyu çıkarmak ve kanalları kurutmak için tüpleri yaklaşık 5 saniye hava ile astarlayın.

8. BoNT/A Hafif Zincirinin Test Plakasına Dağıtılması

  1. Sıvı dağıtıcı giriş hattını BoNT/A LC çalışma solüsyonuna daldırın, havayı çıkarmak için astarlayın ve düşük hacimli 384 kuyulu bir tahlil plakasının her bir kuyucuğuna 8 μl dağıtın. Plakaların sıvı işleyicinin çalışma alanına manuel olarak yerleştirilebileceğini veya ekli bir plaka oteli kullanılarak otomatik olarak konumlandırılabileceğini ve yeniden istiflenebileceğini unutmayın.
  2. Her plakayı temiz bir plastik kapakla örtün ve sıvı işleyiciye bağlı plaka otelinin farklı bir sütununa istifleyin. Plakaları ağzı açık tutmayın, aksi takdirde buharlaşma meydana gelir.
  3. 30 ml ultra saf su, 30 ml %70 etanol, 30 ml ultra saf suyu tekrar doğrudan atık kabına akıtarak sıvı dağıtıcıyı temizleyin.
  4. Kanalları kurutmak için tüpleri yaklaşık 5 saniye hava ile doldurun.

9. Bileşiklerin Test Plakasına Damgalanması

  1. Bileşik plakalar, tahlil plakaları ve temizleme solüsyonları içeren kaplar için sıvı işleyici platformunda alanlar atayın.
  2. Sıvı işleyiciyi, bileşik plakaları ve tahlil plakalarını belirlenen konumlara yerleştirecek şekilde programlayın ve damgalamadan önce plaka kapaklarını çıkarın.
  3. Bileşiğin 50 nl'sini doğrudan 8 μl BoNT / A LC içeren tahlil plakasına damgalayın. Damgalama programını kalibre ederken, pimlerin suya daldırıldığından emin olun, ancak tahlil plakasının altını çizmeyin. Bileşiklerin% 100 DMSO'ya eklenmesinin, dağılırken yerel bir enzim denatürasyon bölgesi oluşturabileceğini unutmayın. Bu nedenle, sadece DMSO kontrolünü tedavi edilmemiş kontrolle (yani DMSO eklenmeden enzim) karşılaştırarak enzim denatürasyon seviyesini değerlendirmek için özen gösterilmelidir.
  4. Her plakadan sonra DMSO'ya batırarak, kurutma kağıdında kurutarak, izopropanole batırarak, kurutma kağıdında kurutarak, metanole batırarak, kurutma kağıdında kurutarak ve son olarak fan üzerinde kurutarak pimleri temizleyin.
  5. Bileşikler tahlil plakasına enzim ile damgalandıktan sonra, stok bileşik plakalarını ve tahlil plakalarını ayrı ayrı istifleyin. Buharlaşmayı önlemek için üst tahlil plakasını yığının içine kapatın ve bir kenara koyun. LC'yi RT'de en az 5 dakika bileşiklerle inkübe ettiğinizden emin olun; Çok sayıda plakayı damgalarken daha uzun inkübasyon süreleri kullanılabilir.

10. Alt Tabakanın Test Plakasına Dağıtılması

  1. Sıvı işleyicinin giriş hattını BoNT/A LC alt tabaka çalışma solüsyonuna daldırın ve ışıktan koruyun. Kuru olduklarından ve tıkalı olmadıklarından emin olmak için dağıtım nozullarını kontrol edin. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için kanalları doldurun.
  2. Tahlil plakalarını istifleyin ve substratın 2 μl çalışma seyreltmesini her bir oyuğa dağıtın. Alt tabakanın doğrudan her bir kuyucuğa dağıtıldığını kontrol edin. Plakaları istifleyin ve plaka okuyucuda okuma ve yeniden istifleme sırasında buharlaşmayı önlemek için ilk plakanın üstüne bir boş tahlil plakası ve yığındaki alt plakanın altına bir boş plaka yerleştirin.

11. Floresan Ölçümleri

  1. Tahlil plakası yığınını hemen bir floresan plaka okuyucusuna yükleyin.
  2. Floresan ölçümüne daha önce adım 5.7'de belirtilen ayarlarla başlayın. Her bileşik için tahlil hızı, zaman içinde bağıl floresan biriminin (RFU) bir grafiğinden hesaplanır. Engellenmemiş bir oran elde etmek için bir negatif kontrol (DMSO) eklemenin önemli olduğunu unutmayın; Her plakaya bilinen bir inhibitör ile pozitif bir kontrol de eklenebilir. Tek bir zaman noktasından temsili bir çıktı Şekil 2'de gösterilmiştir.

12. Temizleme

  1. Her bir bileşik stok plakasını bir rulo kullanarak bir folyo conta ile kapatın ve -80 ° C'de saklayın.
  2. Her tahlil plakası okunduktan sonra, biyolojik tehlike atığında plakaları, kalan LC / A veya substrat seyreltmelerini atın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET tabanlı BoNT/A LC testi, bilinen inhibitörleri karakterize etmek veya küçük kütüphaneleri taramak için düşük verimli bir şekilde manuel olarak gerçekleştirilebilir; alternatif olarak, protokol, yeni BoNT / A LC inhibitörlerini tanımlamak amacıyla büyük kütüphanelerle yüksek verimli tarama (HTS) için küçültülebilir ve otomatikleştirilebilir. Alınan yaklaşımdan bağımsız olarak, BoNT/A LC substrat ile inkübe edildiğinde zaman içinde floresanda bir artış gözlenmelidir (Şekil 1A, zaman içinde temsili bir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan FRET tabanlı BoNT/A LC testi, BoNT/A LC aktivitesini modüle eden küçük molekülleri tanımlamak ve karakterize etmek için çekici bir yöntemi temsil eder. Testin çözüme dayalı doğası, bu protokolü Protokol Metninin Otomatik İşlem bölümünde açıklanan yüksek verimli taramaya uygun hale getirir. Z faktörü genellikle bir testin HTS kampanyaları için uygunluğunu belirlemek için kullanılır18. Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μn) olarak belirlendiğinde, 1'lik bir Z f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI082190 to T.J.D.) ve California Rejeneratif Tıp Enstitüsü'nden (TB1-01186 ve CL1-00502) bir hibe ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HEPESTeknovaH1021
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Metanol (HPLC sınıfı)Sigma-Aldrich34860
İzopropanol (HPLC sınıfı)Sigma-Aldrich650447
96 kuyulu Siyah tahlil plakasıCostar3915
384 kuyulu Düşük hacimli siyah tahlil plakasıGreiner788076
SNAPtide FITC/Dabcyl substratListesi Biyolojik Laboratuvarlar521FRET bazlı BoNT/A LC substrat
Pin temizleme solüsyonuV& P ScientificVP 110
Tüy bırakmayan kurutma kağıdıV& P ScientificVP 540DB
Biomek Mühür ve Numune Alüminyum folyo kapaklarBeckman Coulter538619

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schantz, E. J., Johnson, E. A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).
  2. Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A. Neurology. 49, 189-194 (1997).
  3. Willis, B., Eubanks, L. M., Dickerson, T. J., Janda, K. D. The strange case of the botulinum neurotoxin: using chemistry and biology to modulate the most deadly poison. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47, 8360-8379 (2008).
  4. Tacket, C. O., Shandera, W. X., Mann, J. M., Hargrett, N. T., Blake, P. A. Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism. Am. J. Med. 76, 794-798 (1984).
  5. Capek, P., et al. Enhancing the Pharmacokinetic Properties of Botulinum Neurotoxin Serotype A Protease Inhibitors Through Rational Design. ACS Chem. Neurosci. 2, 288-293 (2011).
  6. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin. J. Protein Chem. 14, 703-708 (1995).
  7. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin. J. Protein Chem. 16, 19-26 (1997).
  8. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Bostian, K. A. Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite. FEBS Lett. 435, 61-64 (1998).
  9. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Millard, C. B. High-throughput assays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: serotypes A, B, D, and F. Anal. Biochem.. 296, 130-137 (2001).
  10. Schmidt, J. J., Stafford, R. G. Fluorigenic substrates for the protease activities of botulinum neurotoxins serotypes A, B, and F. Appl. Environ. Microbiol. 69, 297-303 (2003).
  11. Pellett, S. Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 257-285 (2013).
  12. Boldt, G. E., et al. Synthesis, characterization and development of a high-throughput methodology for the discovery of botulinum neurotoxin a inhibitors. J. Comb. Chem. 8, 513-521 (2006).
  13. Henkel, J. S., et al. Catalytic properties of botulinum neurotoxin subtypes A3 and A4. Biochemistry. 48, 2522-2528 (2009).
  14. Joshi, S. G. Detection of biologically active botulinum neurotoxin--A in serum using high-throughput FRET-assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 65, 8-12 (2012).
  15. Smith, G. R., et al. Reexamining hydroxamate inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A: extending towards the beta-exosite. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 3754-3757 (2012).
  16. Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).
  17. Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability. Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).
  18. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  19. Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations. Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).
  20. Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity. Toxicon. 53, 392-399 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Botulinum Neurotoxin Light ChainFRET based AssayHigh throughput ScreeningCompound Dilution SeriesFluorescence Plate ReaderEnzyme Inhibition KineticsIC50 DeterminationAutomated Liquid HandlingSubstrate Hydrolysis MeasurementInhibitor Potency Comparison

Related Articles