Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Summary

48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Abstract

Kollajen ve fibrin jellerine gömülü hücreler jelin liflerine tüze gücü talar ve uygular. Bu kuvvetler jel mikro yapısının yerel ve küresel olarak yeniden düzenlenmesine ve yeniden düzenlenmesine yol açabilir. Bu işlem, kısmen hücrelerin konumu, jelin geometrisi ve jel üzerindeki mekanik kısıtlamalar arasındaki etkileşime bağlı karmaşık bir şekilde ilerler. Bu değişkenlerin küresel fiber hizalama desenlerini nasıl ürettiğini daha iyi anlamak için, geometrik aralıklı eksplantlar (fibroblast kümeleri) arasındaki sıkıştırma sürecini gözlemlemek için çevre kontrollü bir biyoreaktör ile birlikte zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi kullanıyoruz. Görüntüler daha sonra gerinim haritalarını elde etmek için özel bir görüntü işleme algoritması ile analiz edilir. Bu teknikten elde edilen bilgiler, yara iyileşmesi, hastalık gelişimi ve doku mühendisliği uygulamalarındaki süreçleri anlamak için önemli etkileri olan çeşitli hücre matrisi etkileşimlerinin mekanobiyolojisini araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

Hücre matrisi etkileşimlerini incelemek için önemli bir araç hücre doldurulmuş kollajen jel^1,2. Jel, dokunun in vivo karakterine daha yakın ve hücre davranışını anlamak için geleneksel 2D kültürleri tarafından sunulandan daha uygun bir^3Dortam sağlar 3 . Fibroblastların bir kollajen jel içinde homojen bir şekilde dağıtıldığı ilk çalışmalar, hücrelerin kollajen liflerini hızla birleştirdiğini ve jeli kompakt hale geldiğini buldu^4,5. Serbest yüzen jellerdeki kontrtil fibroblastlar, jel tamamen sıkıştırmaya ulaştıktan kısa bir süre sonra sessiz bir duruma geçiş^1,6,7. Sınırlarda kısıtlanan jellerdeki fibroblastlar aktif,....

Protocol

1. Şablon Hazırlama

İstenen geometriyi(Şekil 1A ve 1B)izleyerek her eksplantın konumunu düzene almak için Parafilm üzerinde bir şablon hazırlayın. Her biri yaklaşık 1-2 mm aralıkla boşluk açın. Bu mesafe, eksplantlar arasında fiber hizalaması oluşturmak için ideal bir araya karşılık gelir. Kalıp, numunenin bantla hazırlanacağı örtü alanının altına takın.

2. Sterilizasyon

Biyoreaktörün tüm bileşenlerini% 70 etanol kullanarak iyice temizleyin ve deneyden önce UV ışığı altında 2-3 saat sterilize edin. Biyoreaktör yerine alternatif bir damar k....

Results

Doku tadilatı, kısmen hücreler ve çevresindeki matris arasındaki karşılıklı fiziksel etkileşimler tarafından yönlendirilen karmaşık bir süreçtir. Hücreler çevredeki lifleri yeniden düzenler ve fiber ağda gerginlik oluşturur. Liflerin ve mekanik ortamın hizalanması hücre davranışını kontrol eder, böylece hem hücreler hem de matris küresel olarak yeniden şekillendirilmiş doku üretmek için yeniden düzenler. Bu deneyde, başlangıçta morfolojide yuvarlak olan eksplantların hücreleri jel içine uzanmaya ve fibrin liflerine yapış.......

Discussion

Bu protokol, hücre aracılı ECM tadilatında yer alan mekaniği gözlemlemek ve ölçmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu tür süreçler bir dizi biyolojik fenomenin altında yatan ve mühendislik dokuları için önemli etkileri olan^2,22, yara izini^1,23azaltarak ve patolojik doku tadilatını anlamak^12,24. Zaman atlamalı DIC mikroskopisi kullanımı, hücre çekiş kuvvetlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkan fibrin liflerinin yer değiştirmesini ve hizalamasını çözmesini ve ölçmesini sağlar. Burada gözlemlenen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Moleküler Problar	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biyotens Biyoreaktör	ADMET
Ti-Eklipin Mikroskobu	Nikon
# 0 35 mm Cam Alt Petri Kabı	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Cam Üst Petri Kabı	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastik Luer bağlantı parçaları, Luer uçlu PVC boru	Cole-Parmer	30600-65