Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Özet

Biz üropatojenik Escherichia coli ile mesane enfeksiyonu sırasında akut inflamatuar yanıtın önemli bir bileşeni taklit eden bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici maddelere cevap olarak, geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiştir, mesane epiteli üzerinde insan nötrofil göçü kantitatif bir değerlendirmesini sağlar.

Özet

Enflamasyon siteye periferiden bağışıklık hücrelerinin işe herhangi mukozal yüzeyde doğal immün yanıtta önemli bir adımdır. Mesane enfeksiyonu sırasında, polimorfonükleer lökosit (PMN, nötrofiller) kan göç ve mesane epitel dolaşırlar. Nötrofilik yanıt yokluğunda enfeksiyonu gidermek için başarısızlık mesane savunma PMN önemini göstermektedir. Kesesi epitelinin üropatojenik Escherichia coli (UPEC) kolonizasyonunu kolaylaştırmak için, idrar yolu enfeksiyonları (İYE) çoğunluğunun neden olan madde, kısmen tanımlanan çeşitli mekanizmalar kullanılarak akut bir enflamatuar yanıtı ıslatın. Bundan başka ev sahibi ve bakteriyel patojen arasındaki etkileşimi incelemek için, UPEC için tabii immun cevabın bu yönünün bir in vitro modeli geliştirmiştir. Transuroepithelial nötrofil göçü deneyinde, Boyden odasının bir varyasyon, kültürlü mesane epithElial hücreler, geçirgen desteğin alt akmak üzere yetiştirilmektedirler. PMN İnsan toplardamar kanından izole edilir ve mesane epitel hücre katmanlarının bazolateral tarafına uygulanır. Bakteriyel bir enfeksiyon ya da kemo-çekici moleküllere yanıt olarak, fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönü temsil eden PMN geçişi, bir hemositometre kullanılarak numaralandırılmış. Bu model UPEC ve ökaryotik hücreler arası etkileşimleri incelemek için hem de PMN mesane epitel geçişi için moleküler şartları sorgulamak için kullanılabilir. Transuroepithelial nötrofil göçü modeli mesane UPEC için başlangıçtaki inflamatuar cevabın anlayışımızı ilerletmek olacaktır.

Giriş

Vücuttaki hücrelerin hareketi, çoğunlukla uzun mesafeler boyunca, büyüme ve gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi için gereklidir. Hücre göç karmaşık ve sinyal iletim ve sitoskeletal bileşenlerinin yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok farklı süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. Hücreler tanımlanmış kimyasal geçişlerini (kemotaksı) doğru rastgele (kemokinezinin) hareket olarak yapabilirsiniz. Birçok teknik in vitro hücre göçü incelemek için geliştirilmiştir. En eski ve en yaygın teknik, Boyden haznesi, bir kemo-çekici maddenin alt bölmeye ve ilgi hücrelerinde yerleştirilen dikey iki odacıklı sistem oluşur, üst bölmede ¹ yerleştirilir. Iki bölmeyi ayıran tanımlanan boyutta gözenekleri olan geçirgen filtre boyunca hücrelerin hareketi izlenir. Ek teknikler arasında Zigmond odası ² ve Dunn odası da dahil olmak üzere, hücre göçü araştırmak için geliştirilmiştir^3. Bu toplu yaklaşımlar çok farklı hücre tiplerinin hareketine önemli bakış açısı vermiştir.

Kemokinezinin ve kemotaksi temel ilkelerini sorgulama ek olarak, iki odacık tahlilleri hücre dışı matris bileşenleri ve hem de endotelyal ve epitel hücre katmanları üzerinden hücre göçü soruşturma kolaylaştırmıştır. Diğer teknikler üzerinden iki oda sistemlerinin kullanılmasının bir avantajı, gözenekli membranı, kolajen ya da fibrinojen gibi proteinler ile kaplanabilir, ve hücre dışı matris-benzeri bariyer boyunca hücre göçü değerlendirilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, kültürlenmiş hücre soyları yetiştirildi ve geçirgen destekler üzerinde farklı olabilir. Endotelyal hücre engeli boyunca hareketini araştırmak için, kültürlenmiş endotelyal hücreleri, geçirgen desteğin üst haznesinde tohumlanır ve büyütülür. Gibi bağışıklık hücreleri gibi hareketli hücreler, en karşısındaki alt rezervuara üst hazne ve göç eklenirfizyolojik apikal-to-bazolateral yönünde endotel bariyer görülmektedir. Bu model kan akışı bağışıklık hücrelerinin ekstravazasyonunu anlamada çok değerli olmuştur. Göç endotel aksine, bir epitel bariyerinden hücrelerinin hareketi tipik olarak bazolateral-apikal yönünde meydana gelir. In vitro olarak, bu etkinlik modellemek amacıyla, araştırmacılar, tohum ve geçirgen desteklerin alt kültürlenmiş epitelyum hücreleri büyür. Hareketli hücrelerin bazolateral-apikal yönü temsil eden epitelyal bariyer boyunca üst hazne ve göç, ilave edilir, izlenir. Transepitelyal göç tür modeller belirgin mukozal yüzeylerinde inflamatuar yanıtlar, özellikle akciğer olanlar ve ^4,5 gut anlayışımıza katkıda bulunmuştur.

Bunun aksine, idrar yolu epitel boyunca bağışıklık hücresi ticareti daha az dikkat çekmiştir. Bizim understandi ilerletmek içinbir mesane epitelyal bariyer ⁶ boyunca hareket, (nötrofil PMN) ng üropatojenik Escherichia coli (UPEC) ile enfeksiyon sırasında idrar yollarında doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin nedeniyle, polimorfonükleer lökosit, inceleme sağlayan bir in vitro tahlil, transuroepithelial nötrofil göçü deneyi geliştirilmiştir ^-8. Transepitelyal göç diğer iki odacıklı modellerinde olduğu gibi, kültürlenmiş insan mesane epitel hücreleri, geçirgen desteğin alt büyüdü ve birleşik epitel tabakalar oluştururlar. Toplardamar kanından izole İnsan nötrofilleri, epitel tabakanın bazolateral tarafına uygulanır ve fizyolojik olarak ilgili bazolateral-apikal yönünde epitel boyunca göç E farklı suşları ile enfeksiyona yanıt olarak ölçülür E. coli ya da kemo-çekici moleküllerinin varlığı. Pek çok araştırma ek hücre tiplerinin yokluğunda, nötrofil hareketi kemokinezinin ve kemotaksis hem odaklı vardı. Bu hesaba enfeksiyon sırasında mesane epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki karmaşık etkileşimler alır gibi transuroepithelial nötrofil göçü deneyi avantajlıdır. Bu uysal in vitro model epitelyal yüzeylerde bağışıklık tepkilerinin ayrıntılı bir araştırma izin vermek için potansiyele sahiptir.

Protokol

1.. 5637 Mesane Epitel hücrelerinin kültür

Laminer akış doku kültürü kaputu UV radyasyonu ile hazırlanmış ve% 70 etanol ile sildi aşağıdaki adımları uygulayın.

1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) [adlandırılır RPMI +] ihtiva eden RPMI-1640 ortamı hazırlayın, filtre, su banyosu içinde bir 0.22 um gözenek boyutlu filtre kullanılarak sterilize ve sıcak 37 ° C.
2. 5637 hücre cryovial çözülme (American Type Culture Collection HTB-9, mesane karsinomu türetilmiş), 37 ° C su banyosu içinde. Hızla 20 ml RPMI + ihtiva eden bir 75 cm ² doku kültürü şişesine çözülmüş hücreleri aktarın.
3. Hücreler, yaklaşık% 95 konfluent (kap basma-6 x 10 ⁶ hücre), yaklaşık 4 gün kadar,% 5 _CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin, şişeyi.
4. 5637 hücreleri altkültürü için:
   1. Şişeden gelen orta çıkarın. 10 ml Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin ile hücrelerin yıkayınOda sıcaklığında e (DPBS).
   2. 6 ml ılık (37 ° C),% 0.05 tripsin, şişeye% 0.02 EDTA çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
   3. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile bir 15 ml konik bir tüp ve pelet hücreleri aktarın. Tripsin / EDTA çözeltisi çıkarın.
   4. 20 ml RPMI + içeren yeni bir 75 cm ² şişeye 6 ml RPMI + (10 ⁶ hücre / ml), ve transfer 1 ml (10 ⁶ hücre) 'de tekrar süspansiyon hücreleri.
5. Hücreler% 95 izdiham ulaştığınızda her 4 gün hücrelerini altkültürü için adım 1.4 tekrarlayın ya.

2. Geçirgen Desteklenmesi Hakkındaki 5637 Hücreler tohumlama ve Yetiştirme

Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. En iyi sonuçlar için, az 10 altkültürler uğramıştır 5637 hücreleri kullanır.

1. Steril forseps kullanılarak, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters.
2. 1.4.1-1.4.3 aşamalara göre% 95 birleştiği noktada 5637 hücre, 75 cm ² şişe tripsinize edin.
3. 1000 ul pipet kullanarak, yumuşak bir hemositometre kullanılarak bir hücre sayımı ile belirlenir 3 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar ~ 2 ml RPMI + hücreleri tekrar süspansiyon.
4. Membran dokunmadan her geçirgen destek hücre süspansiyonu (1.5 x 10 ⁵ hücre) 50 ul uygulanır. Tabağına yerleştirin kapağı ve dikkatli bir şekilde en fazla 16 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de çanak yerleştirin.
5. Oyuk başına 0.6 ml RPMI + ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içine steril forseps sağ geçirgen destek kullanılması. Her bir geçirgen desteğin üst haznesine 0.1 ml RPMI + ekleyin. % 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
6. Her 2 günde bir ortam değiştirin. First, aspirat alt rezervuar ardından üst hazneden orta ve alt hazne (0.6 mi), ters sırayla taze RPMI + uygulamak ve daha sonra üst reservoir (0.1 ml).
7. Yedi gün 5637 hücreleri ile geçirgen destek tohumlama sonra, hücrelerin izdiham değerlendirmek. RPMI + (~ 0.35 mi) ile üst doldurun. Orta üst ve alt kapları arasındaki dengeye etmez, hücreler yeterince birleşmiş olan.

3. Bakteriyel inokulum hazırlanması

1. Aseptik teknik kullanılarak, bir kap ile bir 250 ml şişeye uygun bir kültür et suyu ile 20 ml ekleyin. E. Luria-Bertani (LB) suyu kullanın coli kültürleri ve uygun olduğunda suyu için antibiyotik ekleyin.
2. Steril bir aşılama döngü kullanılarak, bir gliserol stokundan bakteri ya da bir çizgi plaka ile suyu inoküle. UPEC suşlar için, (tip 1 pili üretimini teşvik etmek için) çalkalama olmaksızın, yaklaşık olarak 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe bakteri kültürü.
3. Bir santrifüj tüpüne bakteri kültürü aktarın. 10 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ile bakteriler Pelet.
4. Süpernatant süzünVe ~ 10 ⁹ CFU / ml 'ye eşdeğer, = 1.000 OD ₆₀₀ için PBS içinde tekrar süspansiyon bakteri.
   1. Isı ile öldürülmüş bakteriyel uyarıcı oluşturmak için, bir kısım 30 dakika boyunca 55 ° C 'de yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteri (150 ul, örneğin 1.5 x 10 ~ ⁸ CFU) inkübe edilir. Bakteriyel ölüm onaylamak için ısı ile öldürülmüş süspansiyonu bir kısım Plate.
5. Kullanımdan hemen önce, yeniden süspansiyon haline getirilmiş bakteriler (canlı ya da ısıyla öldürülmüş) 10 kat sıcak serum içermeyen RPMI ⁸ CFU / ml 10 için bir mikro tüp içerisinde [RPMI-adlandırılır] seyreltin.

4. Periferik Kan İnsan nötrofilleri İzolasyonu

Yetişkin gönüllülerin kan toplanması ileri inceleme ve kurumsal inceleme kurulu onayı gerektirir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve düzgün bir insan kanına maruz kalmaktan kaçınmak için tehlikeli madde atmayın.

1. Sağlıklı yetişkin v venöz kan yaklaşık 25 miolunteer phlebotomy eğitimli personel tarafından 3 steril sodyum heparin içeren kan toplama tüpleri içine çekilmelidir.
   1. Sıkıca dirsek üstü, üst kol etrafında bir lastik turnike sarın.
   2. Steril% 70 alkol silin kullanarak giriş siteyi, Antekübital fossayı dezenfekte edin.
   3. Kanatlı bir kelebek iğne sistemine bir plastik tüp tutucu takın.
   4. Yukarı bakacak şekilde 30 ° açı veya daha az, eğimin bir antekubital damara iğne takın. Kan bir hamle plastik boru göründüğünde iğne damarı delinmiş.
   5. Plastik tüp yuvasına bir kan toplama tüpü yerleştirin. Ilk koleksiyonu tüp dolu olduğunda, ikinci toplama tüpü ile değiştirin. Üçüncü boru ile tekrarlayın.
   6. Üçüncü toplama tüp, yaklaşık yarısı dolduğunda, turnike çıkarın.
   7. Steril bir pamuk ile delinme siteyi örtün ve yavaş yavaş damardan iğneyi. İğne ve yer i üzerinde koruyucu kalkan kaydırınna biohazard konteyner diyez.
   8. Ponksiyon basınç uygulayın. Yapışkan bandaj ile delinme site ve pamuk örtün.
   9. Yavaşça heparin dağıtmak için kan toplama tüpleri ters.

Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın.

2. 10 ml bir pipet kullanarak, yumuşak bir taze, steril bir 50 ml konik bir tüp için kan aktarın. % 3 eşdeğer bir hacim (a / h) dekstran% 0.9 NaCI ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. 20 dakika boyunca, oda sıcaklığında dik olarak tüp inkübe edin.
3. Alt katmanı bozmadan, dikkatle üst tabakası aspire ve yeni bir 50 ml konik tüp transfer. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın.
4. Kan tekrar başlangıç ​​hacmine eşit% 0.9 NaCI hacminde hücre pelletini.
5. Hücre süspansiyonu, p altında yoğunluk santrifüj çözeltisi 10 ml Katmanİki faz arasındaki arayüz ayırma. Hiçbir frenli 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj. Süpernatant atın.
6. Arta kalan kırmızı kan hücreleri lize etmek için, 10 ml soğuk% 0.2 NaCl'de hücre pelletini. 30 saniye boyunca inkübe ve sonra derhal izotonikliğe yeniden 10 ml soğuk% 1.6 NaCI ekleyin.
7. 6 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile Pelet hücreleri. Süpernatant atın.
8. Hücre topağı, kırmızı kan hücrelerinin lize, tipik olarak 3 tur arındırılmış olması görünene kadar yineleyin 4,6-4,7 adımları tekrarlayın.
9. 1000 ul pipet kullanarak, in, hücre pelletini, öncelikle PMN tekrar süspansiyon sıcak (37 ° C) RPMI-hücre bir hemasitometre kullanılarak saymak suretiyle belirlendi 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda,. Kullanılana kadar 37 ° C'de hücreleri tutun. Sırasıyla, boyandıktan sonra, nükleer morfoloji tripan mavi dışlama ve görselleştirme ile değerlendirilen Tipik olarak, PMN canlılığı ve saflık>% 99 bulunmaktadır.

5. Transuroepithelial Nötrofil Göç gibidemek

Aseptik teknik kullanılarak doku kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. Adım 2.7 'de tespit edildiği üzere, birleşik 5637 hücre katmanları taşıyan sadece geçirgen destek kullanın. Ihtiva eden 24 oyuklu plakalar RPMI-olabilir, önceden hazırlanmış ve% 5 _CO2, kullanıma kadar 37 ° C 'de muhafaza edilebilir.

1. Kısım 1, 24 oyuklu plakada oyuk başına RPMI-ısınmaya ml; geçirgen destek başına 3 kuyu hazırlar.
2. Geçirgen desteklerin üst ve alt haznelerden ortam aspire.
3. Steril forseps kullanılarak, aşama 5.1 'de hazırlanan 24 plaka için geçirgen destek aktarın. Kuyudan kuyuya destekleri aktararak geçirgen özelliği destekleyip üç kez yıkayın.
4. Bakteriyel inokulum kullanılacak ise, steril bir 25 mm derin doku kültürü çanağı içinde geçirgen destek ters. Bir kimyasal çekicidir (örneğin, N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) ya da IL-8) kullanılacak ise, 5.6 adıma geçin.
5. Canlı veya öldürülen Bact ile deneyler içinerial uyarı, 60 ul RPMI-(sahte enfeksiyon) veya bakteriyel aşı aşama 3.5 de hazırlanan (6 x 10 ⁶ CFU) ile her bir geçirgen destek apikal yan inoküle. Tabağına yerleştirin ve kapağı, 1 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
6. , 24 oyuklu, düşük bağlanma plakasına oyuk RPMI-başına 0,6 ml ilave et; geçirgen destek oyuk başına 1 hazırlar. RPMI-to PMN girişi numaralandırmak 0.5 ml içeren 3 kuyu hazırlayın.
   1. Bir kimyasal çekicidir bakterilerin yerine kullanılıyorsa, aşama 5.6 'de hazırlanan 24 oyuklu plaka RPMI-in 0.6 ml kemoatraktan ekleyin.
7. 24-iyi düşük eki plaka içine doğru geçirgen destekler.
8. Her bir geçirgen desteğin üst haznesine (bazolateral taraf), aşama 4.9 de hazırlanan 0.1 ml PMN (10 ⁶ PMN) ekleyin. Doğrudan 500 ul ihtiva eden gözlere 100 ul RPMI-PMN ekleyin. 1 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
9. Steril forseps kullanarak, hafifçe kazıyınKuyunun kenarına karşı geçirgen destek zar apikal taraftan ek PMN kaldırmak ve daha sonra desteğin imha etmek.
10. Yavaşça 1000 ul pipet ucu ile de her bir alt kazıma ile PMN toplayın ve mikrofüj tüpler için PMN süspansiyonlar aktarın.
11. Hemasitometre kullanarak PMN Enumerate.
12. Alt haznede PMN toplam sayısını hesaplamak için, 6000 1 mm ^2'de PMN sayısı (100 nl) çarpın. PMN sayısı 10 ⁶ giriş PMN normalize gibi veri girişi PMN bir yüzdesi olarak belirtilir, ya da olabilir.

Sonuçlar

Transuroepithelial nötrofil göçü deneyi, çeşitli uyaranlara (Şekil 1B) karşılık olarak kültürlenmiş mesane epitel hücre tabakası boyunca insan PMN göç kantitatif bir değerlendirmesini sağlar. Protokol basit iken, PMN göçünü etkilemeye ve sonuç olarak bu tahlilin tekrarlanabilirliğini etkileyen değişkenler vardır. Teknik ve biyolojik çoğaltır arasındaki değişkenliği azaltmak için geçirgen destek ve PMN hazırlarken önlemler alınmalıdır. Örneğin, yeterli bir birleşik 5637 hücre tek tabakaları ihtiva eden g...

Tartışma

Kültürlü bir mesane epitel hücre çizgisi ve yeni izole edilmiş insan PMN kullanarak, transuroepithelial nötrofil göçü bir in vitro bir model oluşturduk. Bu model idrar yolu enfeksiyonu (İYE) sırasında doğal immün yanıt, tipik UPEC ⁹ nedeniyle son derece yaygın bir bakteriyel enfeksiyon karmaşıklığı incelemek başlayan vesile olmuştur. Mesane ya da sistit enfeksiyon esnasında, mesane lümenine PMN işe bakteri açıklık ¹⁰ için gereklidir. Bir enflamatuar yanıtın karşısında bir dayanak oluşturma...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Transwell Kesici Uçlar (i.e.  geçirgen destekler)	Corning	3472	6,5 mm, 3 & mu; m gözenek, polyester membran ek BD
Vacutainer Kan Alma Tüpleri	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	16 mm x 100 mm x 10 ml sodyum heparin içeren yeşil kapaklı tüpler
BD Safety-Lok Kan Alma ve İnfüzyon Seti	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 inç iğne x 12 tüp
BD Vacutainer tek kullanımlık, istiflenemeyen tutucu	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS yoğunluk santrifüj çözümünden	GE Healthcare	17-1440-02
Ultra Düşük Bağlantı Plakaları	Corning	3473	24 kuyulu, şeffaf düz tabanlı
N-Formil-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	DMSO'da 10 mM
Rekombinant İnsan CXCL8 / IL-8	R& D Systems	208-IL	, PBS'de 100 & mu'ya yeniden yapılandırıldı; g/ml

,