Yöntem makalesi

Larva Zebra Balıklarında İskelet Kası Defektlerinin Bikırılma ve Dokunma-Uyandırma Kaçış Yanıtı Deneyleri ile Analizi

7.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50925

⸱

13 Aralık 2013

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

Zebra balığı artık kas distrofilerini, konjenital miyopatileri ve ilgili nöromüsküler hastalıkları modellemek için yerleşik ve güçlü bir araçtır. Çift kırılma ve dokunma ile uyarılmış kaçış davranışı, zebra balığı embriyolarının erken gelişim sırasında kas düzensizliği ve lokomotif bozukluğunun derecesini belirlemek için kullanılan iki yaygın noninvaziv testtir.

Özet

Zebra balığı (Danio rerio), memelilerde yüksek genomik ve yapısal koruma nedeniyle kas distrofileri1-3, konjenital miyopatiler4,5 ve sarkomerik düzenektekibozulmalar 6,7 dahil olmak üzere iskelet kasını etkileyen insan hastalıklarını modellemek için özellikle etkili bir araç haline gelmiştir. Zebra balığında kas düzensizliği ve lokomotif bozukluğu, döllenmeden sonraki ilk birkaç gün içinde hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Zebra balıklarında iskelet kası kusurlarını karakterize etmeye yardımcı olan iki tahlil, çift kırılma (yapısal) ve dokunma ile uyarılmış kaçış tepkisidir (davranışsal).

Çift kırılma, ışığın düzenli maddeden geçerken döndürüldüğü fiziksel bir özelliktir, örneğin kas sarkomerlerinin sahte kristal dizisi9. Gelişimin erken dönemlerinde yarı saydam zebra balığı larvalarında kas bütünlüğünü değerlendirmek için basit, invaziv olmayan bir yaklaşımdır. Yüksek derecede organize iskelet kasına sahip vahşi tip zebra balığı, iki polarize ışık filtresi arasında görselleştirildiğinde karanlık bir arka planın ortasında çok parlak görünürken, kas mutantları, modelledikleri birincil kas bozukluğuna özgü çift kırılma modellerine sahiptir. Kas distrofilerini modelleyen zebra balıkları, miyofiber dejenerasyonu ve ardından tekrarlanan rejenerasyon turları ile karakterize hastalıklar, polarize ışık altında iskelet kasında dejeneratif koyu lekeler sergiler. Distrofik olmayan miyopatiler nekroz veya rejeneratif değişikliklerle ilişkili değildir, ancak düzensiz miyolifler ve iskelet kası güçsüzlüğü ile sonuçlanır. Miyopatik zebra balığı tipik olarak, sarkomerlerin düzensizliğini yansıtan çift kırılmada genel bir azalma gösterir.

Dokunma ile uyarılmış kaçış testi, dokunsal stimülasyon10-12'ye yanıt olarak bir embriyonun yüzme davranışını gözlemlemeyi içerir. Yabani tip larvalarla karşılaştırıldığında, mutant larvalar sıklıkla zayıf bir kaçış kasılması gösterir, ardından yavaş yüzme veya larvaları kısa bir mesafeden daha fazla itemeyen başka bir tür bozulmuş hareket görülür12. Bu tahlillerin avantajı, aynı balık türündeki hastalık ilerlemesinin birkaç gün boyunca in vivo olarak izlenebilmesi ve çok sayıda balığın daha yüksek omurgalılara göre kısa sürede analiz edilebilmesidir.

Protokol

1. İskelet Kası Yapısının Birefringence ile İn vivo Analizi

  1. Beslenmeden sonra öğleden sonra geç saatlerde istenen zebra balığı hatlarının erkek(ler)ini dişi(ler)inden ayıran çiftleşme kafesleri hazırlayın.
    1. Dişileri daha büyük göbekleri ve hafif mavi/beyaz renkleriyle ve erkekleri ince vücut şekilleri ve pembe/sarı tonlarıyla ayırt edin.
    2. Çift yönlü çaprazlamalarda (bir erkek ve bir kadın) başarı sadece %50 civarında olabilir. Daha yüksek bir başarı oranı için, bir erkeği 2-3 dişiyle çiftleştirin.
  2. Ertesi sabah ışığın başlamasından kısa bir süre sonra kafes ayırıcıları çıkarın ve balığın rahatsız edilmeden yumurtlamasına izin verin.
  3. Tankın dibine yeterli sayıda döllenmiş yumurta bırakıldığında yumurtaları bir süzgeç kullanarak toplayın.
  4. Süzgeci balık suyuyla durulayarak embriyoları derin bir Petri kabına aktarın ve ana balığı tanklarına geri koyun. Embriyo tabaklarını 28,5 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  5. O gün veya ertesi sabah daha sonra cansız yumurtaları ve kalıntıları temizleyin ve daha fazla büyüme için embriyoları kuluçka makinesine geri koyun.
  6. Embriyolar / larvalar, döllenmeden 3-7 gün sonra (dpf) çift kırılmayı gözlemlemek için uygun yaşa ulaşır, çünkü 3 dpf'den önceki sonuçlar potansiyel olarak sınırlı kontrasttan muzdarip olabilir. Yabani tip embriyolar, döllenmeden 48-60 saat sonra (hpf) koryonlarından çıkar ve ardından vücut ekseni düzleşir. Geç yumurtadan çıkan vahşi tip veya mutant embriyolar manuel dekoryonasyon gerektirebilir.
    1. Keskin forseps ile koryonda nazikçe bir yırtık yapın ve embriyonun düşmesi için ters çevirin.
    2. Teste başlamadan önce dekoryonlu embriyoların düzleşmesine izin verin.
    3. Doğru konumlandırılmalarına yardımcı olmak için embriyoları trikare (balık suyunda% 0.04) ile uyuşturun.
  7. Polarize ışığın açısını ayarlamak için döndürülebilen polarize bir lense sahip bir diseksiyon mikroskobu takın (Şekil 1A).
  8. Dekoryonlu, anestezi uygulanmış embriyo (lar) ı doğrudan vücudun lateral ekseni boyunca ikinci bir polarize lensin üzerine yerleştirin. İkinci lens, mikroskop sahnesinde üst lensin altına yerleştirilmelidir (Şekil 1B). Plastik, kırılan ışığın iletimi için uygun bir ortam olmadığından, çift kırılma testi sırasında herhangi bir noktada plastik Petri kapları kullanmayın.
  9. İki merceğin polarizasyon eksenleri birbirinden 90° yönlendirilene ve arka plan tamamen karanlık olana kadar ilgilenilen embriyo görünürken üst merceği döndürün.
  10. Testin optimum çıktısı, balığın iki polarize lens arasındaki oryantasyonuna bağlıdır. Mümkün olduğunca düz yattıklarından emin olmak için balıkları hareket ettirin.
    1. Balık kavisliyse, yalnızca bu düz yönelime sahip segmentler polarize ışığı geçecek ve çift kırılma sergileyecektir. Bu gibi durumlarda, düz alanlardaki çift kırılmayı ölçün ve vahşi tip balıklarda karşılık gelen alanın çift kırılmasını kaydedin (örneğin, hem vahşi tip hem de mutant balıklarda somitler 1-10).
  11. Balığın iki kırılmalı fenotipini gözlemleyin.
    1. Oldukça organize iskelet kasına sahip vahşi tip balıklar, miyofilamentlere paralel ışığın kırılma indisi, bu yapılara dik olan polarize ışıktan daha yüksek olduğundan, parlak çift kırılma gösterir.
    2. Dejeneratif olmayan bir miyopati veya gelişimsel bir kusuru düşündüren düzensiz iskelet kasına sahip balıklar tipik olarak iki kırılmada genel bir azalma gösterir.
    3. Kas distrofisinin karakteristiği olan düzensiz iskelet kası olan balıklar, genellikle normal kas mimarisinin parlak alanları arasında kas dejenerasyonunu temsil eden koyu alanlar ile yama benzeri bir çift kırılma paterni sergiler.
  12. Aynı pozlama ayarlarında ve büyütmede polarize ışık altında vahşi tür ve mutant balıkların görüntülerini çekerek çift kırılmayı ölçün. Görüntüleri .tiff dosyaları olarak kaydedin.
    1. Çift kırılma görüntülerini ImageJ yazılımında açın (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. Her görüntü için, araç çubuğundan "Poligon Seçimleri" seçeneğini kullanarak vücudun etrafına bir çizgi çizerek zebra balığı kasının alanını seçin.
    3. Görüntü için gerekli istatistikleri seçmek için "Analiz Et" açılır menüsü altındaki "Ölçümleri Ayarla"yı kullanın.
      1. Minimum seçim, "Alan", "Ortalama gri değer" ve "Minimum ve maksimum gri değer" kutularının işaretli olmasını gerektirir.
      2. Maksimum >255 gri değeri, piksel doygunluğunu gösterir. Bu nedenle, maksimum gri değerleri 255'ten küçük olan görseller kullanın.
    4. Seçilen alanla ortalama yoğunluğu normalleştirin ve her çift kırılma görüntüsü için aynı niceleme prosedürünü tekrarlayın.

2. Dokunma ile Uyarılmış Kaçış Davranışı Testi

  1. Uygun zebra balığı hatlarının çiftleşme çiftlerini ayarlayın ve yukarıda 1.1-1.5 adımlarında açıklandığı gibi embriyoları toplayın.
  2. Döllenmeden 2-7 gün sonra, dekoryonlu embriyoları / larvaları ayrı ayrı derin bir Petri kabına veya çok kuyulu plakaların odalarına yerleştirin.
  3. Bir seferde sadece bir embriyo ile çalışarak, embriyoyu bir SPOT RT3 dijital kamera sistemi veya benzeri bir Nikon SMZ1500 stereomikroskobun görüş alanında ortalayın ve sıralı görüntülemeye başlayın.
    1. Hem vahşi tip hem de mutant balıklar için aynı görüntüleme sıklığı kullanılmalıdır. Daha düşük hızlar genellikle vahşi tür balıkların hızlı yüzmelerini yakalamak için yeterli olmayacağından, >30 Hz kare hızları önerilir.
  4. Kuyruğa bir böcek iğnesi ile dokunarak embriyoya mekanosensoriyel uyaranlar verin.
  5. Embriyo yüzmeyi bıraktığında veya görüş alanından yüzerek çıktığında görüntülemeyi durdurun.
  6. SPOT 5.1 Advanced yazılımını kullanarak ardışık görüntüleri bir video dosyasına dönüştürün veya zaman atlamalı görüntülerin tek tek karelerini çevrimdışı olarak analiz edin. Benzer yazılım paketleri arasında Open Lab, NIS Elements veya ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) bulunur.
  7. Birden fazla embriyoda dokunma ile uyarılmış yanıtı gerçekleştirerek yüzme davranışını ölçün.
    1. Bu, yüzme müsabakasının başlangıç ve bitiş noktalarını işaretlemek için yazılım veya metrik bir cetvel kullanarak embriyoların sabit bir zaman aralığında yüzebildikleri mesafenin ortalaması alınarak elde edilebilir.
    2. Her deney tekrarı için yeni bir embriyo ile testi gerçekleştirerek embriyoların zamanla dokunma uyaranına alışmasını önleyin. Vahşi tip ve güvenilir mutant modellerdeki davranışlar yüksek oranda tekrarlanabilir olma eğilimindedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çift kırılma (birefringence), canlı zebra balığı embriyolarındaki miyofibriller organizasyonun durumunu aydınlatmak için etkili ve noninvaziv bir analiz yöntemi olarak kullanılabilir. Yabanıl tip zebra balıklarının yanı sıra iskelet kası gelişimi ve fonksiyonu için kritik olan genlerin ekspresyonu azalmış zebra balıklarına örnekler sunulmuştur. 5 dpf'deki yabanıl tip zebra balıkları, miyofilamanların düzenli dizilimi nedeniyle polarize ışık altında yüksek derecede çift kırılmalı iskelet kasları sergiler (Şekil 2A...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Primer nöromüsküler bozukluklar geleneksel olarak distrofik veya distrofik olmayan süreçler olarak sınıflandırılır. Kas distrofileri, miyofiber dejenerasyonu ve ardından tekrarlanan rejenerasyon turları ile karakterize edilir, bu da sonuçta fibroz ve yağ dokusu14 ile değiştirilen bir son aşama sürecine yol açar. Distrofik olmayan miyopatiler, aksine, nekroz veya rejeneratif değişikliklerle ilişkili değildir, ancak düzensiz miyofiberlere ve genel iskelet kası zayıflığına neden olur.

...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

Behzad Moghadaszadeh'e çift kırılma görüntülerinin nicelleştirilmesindeki harika yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, ABD Musküler Distrofi Derneği (MDA201302) ve Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (R01 AR044345) tarafından finanse edildi ve ayrıca A Foundation Building Strength, Cure CMD ve AUism Charitable Foundation'dan cömert destek aldı. VAG, Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü'nden K01 AR062601 tarafından desteklenmektedir ve LLS, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü'nden F31 NS081928 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Trikain SigmaA5040
Petri kaplarıFischer Scientific0875711Z
ForsepsFischer Scientific100189-588
Böcek pimiFischer ScientificS67375
Polarize lenslerRitz KameraQuantaray Tristar Optik C-PL 72mm
İnkübatörFischer BilimselIsotemp İnkübatör Modeli 630D
MikroskopNikon Instruments Inc.SMZ 1500
KameraArıza Tespit Cihazları A.Ş.SPOT RT3
Görüntüleme yazılımıTeşhis Cihazları A.Ş.SPOT 5.1 İleri Düzey

Kaynaklar

  1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  2. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
  3. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  4. Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
  5. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
  6. Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle. J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).
  7. Hawkins, T. A., et al. The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis. Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).
  8. Barbazuk, W. B., et al. The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes. Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).
  9. Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy. Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).
  10. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish. Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).
  11. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).
  12. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
  13. Hirata, H., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).
  14. Wallace, G. Q., McNally, E. M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).
  15. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  16. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  17. Low, S. E., et al. TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors. J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).
  18. Liu, D. W., Westerfield, M. Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming. J. Physiol. 403, 73-89 (1988).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrafish Larvalarift K r lma DeneyiDokunma ile Tetiklenen KaKas Yap s AnaliziPolarize I k MikroskopisiKas B t nl Nicelle tirmesiKa Tepkisi l mIn Vivo zlemeY ksek Kapasiteli Tarama

İlgili makaleler