Yöntem makalesi

Murin Aort Sinüsünde Aterosklerotik Lezyonların Kantitatif Analizi ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/50933

⸱

7 Aralık 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histokimyasal ve immünohistokimyasal analizle birlikte aort sinüsünün ve çıkan aortun hassas kesitini kullanarak fare modellerinde aterosklerotik lezyonları ölçmek ve karakterize etmek için prosedürleri açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ateroskleroz, büyük arterlerin bir hastalığıdır ve miyokard enfarktüsü ve inmenin altında yatan önemli bir nedendir. Bu hastalığın moleküler ve hücresel patofizyolojisinin incelenmesini kolaylaştırmak için birkaç farklı fare modeli geliştirilmiştir. Bu yazıda, murin aort sinüsü ve asendan aorttaki aterosklerotik lezyonların miktar tayini ve karakterizasyonu için özel teknikler tanımlanmıştır. Bu prosedürün avantajı, lezyonun kesit alanının ve toplam hacminin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamasıdır, bu da farklı tedavi gruplarında aterosklerotik ilerlemeyi karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu, valf broşürlerinin anatomik bir dönüm noktası olarak kullanılması ve kesit açısının dikkatli bir şekilde ayarlanmasıyla mümkündür. Ayrıca, aterosklerotik ilerlemeyi karakterize etmeye başlamak için kullanılabilecek temel boyama yöntemlerini de açıklıyoruz. Bunlar, araştırmacının özel olarak ilgilendiği antijenleri araştırmak için daha da modifiye edilebilir. Tarif edilen teknikler genellikle çok çeşitli mevcut ve yeni oluşturulan diyet ve genetik olarak indüklenen aterogenez modellerine uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yirmi yılda, diyet ve/veya genetik manipülasyon yoluyla ateroskleroza eğilimli fare modellerinin geliştirilmesi ve kullanılması, aterosklerotik lezyon gelişiminde rol oynayan moleküler ve hücresel mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde artırmıştır1-3. Aterogenez hakkındaki bilgimizin ve anlayışımızın büyük bir kısmı, aterosklerotik lezyonların kendiliğinden geliştiği ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (LDLR) eksikliği olan apolipoprotein (Apo)-E deficient<span style="font-size: 12px; line-height: 28px;">4 farelerde yapılan çalışmalardan gelmektedir aterosklerozun diyete bağlı olduğu fareler. Bu modellerin önemli bir avantajı, kontrollü diyet ve çevresel koşullar altında genetik olarak tanımlanmış nispeten fazla sayıda hayvanın çalışmasına izin vermeleridir. Ek olarak, bu fare suşlarının bazılarında gelişen ileri aterosklerotik lezyonlar, lipid dolu nekrotik çekirdekler ve fibröz kapaklar içeren insan deneklerde gözlemlenenlere çok benzer görünmektedir. Ateroskleroz, bu fare modellerinde hızla gelişir ve bu da yağlı çizgiden ileri plağa kadar lezyon gelişimini birkaç hafta içinde incelemeyi çok uygun hale getirir. Ayrıca, diyabet6, dislipidemi7, obezite8, hipertansiyon9, sigara dumanı10 ve hareketsiz bir ortam11 dahil olmak üzere insanlarda kardiyovasküler hastalık için bilinen risk faktörlerinin lezyon gelişimini daha da hızlandırdığı gösterilmiştir.

Ateroskleroza eğilimli fare modellerinin hepsinde olmasa da çoğunda, lezyon gelişimi ilk olarak aort sinüsünde tespit edilebilir. Başlangıç zamanı fare suşuna ve diyetine bağlıdır. Lezyonların boyutu arttıkça, yükselen aortu büyütme eğilimindedirler. ApoE-/- ve LDLR-/- farelerde, aort arkında, inen aortta ve diğer büyük arterlerde12-14 aort çatallanmalarında müteakip lezyon gelişimi tespit edilebilir. Dr Beverly Paigen ve meslektaşları, diyete bağlı aterosklerozun en eski modellerinden bazılarını geliştirmenin yanı sıra, fare modellerinde lezyon ölçümünün standardı haline gelen aort sinüsündeki aterosklerotik lezyonların ölçülmesi için bir test de oluşturdular15. Yıllar geçtikçe, bu teknik rafine edilmiş ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır16. Burada, bir farede aterosklerotik lezyonların nicelleştirilmesi ve karakterizasyonu için "Paigen yönteminin" değiştirilmiş bir versiyonunu sunuyoruz. Seri aort kesitlerinin belirli bir vasküler bölgeden ve tanımlanmış ve sabit bir oryantasyonda analizi, kesin veri toplamayı kolaylaştırır ve farklı tedavi gruplarında lezyon gelişimindeki varyasyonların doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Burada sunulan yöntemler önceki tekniklerin üzerine inşa edilmiştir. Spesifik olarak, lezyonun alan, hacim, nekrotik ve hücresel içerik açısından karakterizasyonunun, histokimya ve immünohistokimyanın bir kombinasyonu kullanılarak seri kesitlerin incelenmesi yoluyla nasıl mümkün olduğunu açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

McMaster Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu, burada açıklanan tüm prosedürleri önceden onaylamıştır.

1. Hasat Kalbi ve Aort

  1. Fareyi uyuşturun ve kalbi ve proksimal aortu ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu dikkatlice açın.
    1. Kalbin sağ ventrikülünün doğrudan noktalanmasıyla fareden kanı çıkarın.
      Not: Kan, plazma lipidlerinin ve diğer kan kaynaklı faktörlerin analizi için saklanabilir ve kullanılabilir.
  2. Fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın.
  3. Damar sistemini 5 ml tuzlu su ile durulayın.
    Not: Bu, sol ventriküle bir iğne delinmesi yoluyla yerçekimi perfüzyonu ile gerçekleştirilir. Drenaja izin vermek için sağ atriyumda küçük bir kesi yapılır. Damar sistemi durulandıktan sonra, karaciğer, kas ve yağ dokusu doku örnekleri toplanabilir, sıvı nitrojen içinde dondurulabilir ve gelecekteki analizler için -80 ºC'de saklanabilir.
  4. Damar sistemi, sol ventriküle yerçekimi perfüzyonu ile %10 nötral tamponlu formalin ile sabitlenir.
    Not: Perfüzyon başladıktan sonra,% 10 nötr tamponlu formalin akışı, işlem 1-2 dakika sürecek şekilde yavaş bir damlamaya ayarlanır. Perfüzyonla sabitlenmiş organlar ve dokular, immünofloresan veya histokimya yoluyla protein ekspresyonunun incelenmesi için kullanılabilir, ancak genellikle western blotlama veya gen ekspresyonunun incelenmesi için numune olarak kullanılamazlar.
  5. Kalbi ve yaklaşık 2 mm proksimal aortu karkastan dikkatlice çıkarın. İnen aort da dahil olmak üzere diğer dokular toplanabilir ve sonraki analizler için saklanabilir.
    Not: İnen aort (iliak bifurkasyona kadar) aterosklerozu incelemek için de kullanılabilir.
  6. Çıkarılan kalbin üzerine çıkan aorta dik olacak şekilde neşter ile enine bir kesi yapın.
    Not: Bu, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak kolaylaştırılır ve sağ ve sol kulakçıkların alt uçlarını birleştiren düz bir çizgi boyunca kesilerek etkili bir şekilde yapılabilir (Şekil 1).
  7. Kalbin apikal (üst) kısmını bir gömme kasetinde saklayın ve işlenmek üzere nötr tamponlu formaline batırın.

2. Aort Hazırlığı

  1. Diseke edilmiş doku ile kaseti doku işlemcisine yerleştirin.
  2. Doku örneklerini işleyin.
    Not: Genel olarak, doku işlemcileri, işlemin uzunluğu ve bu süreçte yer alan çözümler nedeniyle gece boyunca çalışacak şekilde programlanır. Numuneler, belirlenmiş bir protokole göre işlenir:
    1. 42 ºC'de 1 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin.
    2. 42 ºC'de 1 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin.
    3. 40 ºC'de 30 dakika boyunca% 70 etanol.
    4. 40 ºC'de 30 dakika boyunca% 85 etanol.
    5. 40 ºC'de 45 dakika boyunca% 100 etanol.
    6. 40 ºC'de 45 dakika boyunca% 100 etanol.
    7. 40 ºC'de 45 dakika boyunca% 100 etanol.
    8. 40 ºC'de 1 saat ksilen.
    9. 40 ºC'de 1 saat ksilen.
    10. 40 ºC'de 1 saat ksilen.
    11. 63 ºC'de 45 dakika parafin mumu.
    12. 63 ºC'de 45 dakika parafin mumu.
    13. 63 ºC'de 45 dakika parafin mumu.
    14. 63 ºC'de 45 dakika parafin mumu.
  3. Parafin mumunu gece boyunca 62 ºC'de eritin (Şekil 1D-E). Bir histoloji kalıbını doldurmak için gereken parafin mumu gramına ve hazırlanacak blok sayısına göre kullanılacak toplam parafin mumu miktarını tahmin edin.
    Not: Sığ kalıba göre derin bir histoloji kalıbı tercih edilir, çünkü kesitleme sırasında daha geniş bir potansiyel dönme açısı sağlar. Tek bir derin histoloji kalıbı 11 g parafin mumu gerektirir.
  4. İşlenmiş her dokuyu derin bir histoloji kalıbına yerleştirin ve ardından kalıbı tamamen doldurmak için erimiş parafin mumu dökün (Şekil 1F). Kalıbı etiketli bir plastik kasetle örtün (Şekil 1G).
  5. Katı bloğu oluşturmak ve bloğu kalıptan ayırmak için doldurulmuş kalıbı buz üzerinde veya soğuk bir yüzeyde soğutun (Şekil 1H).
    Not: Disseke edilmiş kalbi kalıba yerleştirirken, kalbin iç yüzünün kalıbın tabanına temas ettiğinden emin olun ve ardından bloğu erimiş parafin ile doldurmaya devam edin. Etiketli bir plastik kaset, bloğu tutacak bir taban sağlamak için katılaşmadan önce kalıbı kaplar. Soğuduktan sonra kalıp çıkarılır ve parafin blokları oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.

3. Aortun kesit alınması

  1. Kalbin bulunduğu bloğu, içeriden kalbin tepesine doğru bölümlere ayrılabilecek şekilde mikrotomun örnek tutucusuna yerleştirin (Şekil 2)
  2. Mikrotomu 10 μm'lik bir kesit kalınlığı kesecek şekilde ayarlayın ve kalbi kesitlere ayırmaya devam edin.
  3. Bir cam slayt üzerinde bölümleri toplayın ve konumu ve yönü belirlemek için ışık mikroskobu altında inceleyin.
  4. Aort sinüsünün 1 veya 2 kapakçığı belirginleştiğinde, bloğun açısını gerektiği gibi ayarlayın (Şekil 3A).
    Not: Sinüs, ekli broşürlerle birlikte üç ayrı valf tabanı olarak görünmelidir. Yalnızca bir veya iki valf yaprağı gözlenirse, kesme açısı buna göre ayarlanmalıdır.
  5. Mikrotomu 4-5 μm'de kesecek şekilde ayarlayın ve bölümleri kaplanmış cam slaytlarda toplayın.
    Not: Prosedür değişebilse de, aort sinüsünden çıkan aorttan yukarı doğru ilerleyen ilk 10 bölümün, etiketli bir cam slaytın (1-10 etiketli slaytlar) üst kısmına toplandığı sistematik bir yaklaşım önerilir. Sonraki bölümler aynı paterni takip ederek toplanır: # 11-20, # 21-30, # 31-40 aterosklerotik lezyonlar artık gözlenmeyene kadar (Şekil 3B). Bu şekilde aterosklerotik lezyonlar, çıkan aort boyunca kesin yerlerde incelenebilir ve karakterize edilebilir. Örneğin, Slayt 1, aort sinüsünden çıkan aorta kadar aterosklerotik lezyonları temsil eden 1, 11, 21, 31, 41 ve 51 numaralı bölümleri içerir. Lezyon büyükse, aynı paterni takip eden daha fazla distal kesit toplamak için 11-20 etiketli ek slaytlar dahil edilebilir.
  6. Aterosklerotik lezyon görülmeyene kadar kesitleri toplamaya devam edin.
    Not: Slaytlar, daha fazla analizden önce aylarca oda sıcaklığında saklanabilir.

4. Aterosklerotik Lezyonların Boyanması ve Miktar Tayini

Aterosklerotik lezyonlar çeşitli teknikler kullanılarak birçok farklı şekilde analiz edilebilir. En temel analiz lezyon kesit alanının belirlenmesini içerir. Lezyon alanını doğru bir şekilde karşılaştırmak için, lezyon ölçümünün başlangıç noktasının numuneden numuneye tutarlı olması önemlidir. Bu, yönlendirme için valf broşürleri kullanılarak kolaylaştırılır. Lezyon alanının doğru bir şekilde tanımlanmasını ve ölçülmesini kolaylaştırmak için, seçilen kesitler hematoksilen ve eozin ile boyanır. Bu, slaytların belirli süreler boyunca dokuyu deparafinize edecek/lekeleyecek bir dizi çözeltiye daldırılmasını içerir.

Hematoksilen ve eozin boyama protokolü:

  1. Slaytları 8 dakika hava kurutucuya koyun, ardından yıkama başına 3 dakika boyunca 4× ksilen içinde yıkayarak bölümleri deparafinize edin.
  2. Slaytları %100 etanolde 3× her biri 3 dakika yıkayın.
  3. 3×'ini %70 etanol içinde 3 dakika ve ardından 2×'sini %50 etanol içinde her biri 3 dakika yıkayın.
  4. Damıtılmış su ile durulayın ve ardından 15 dakika boyunca Mayer'in Hematoksilin'ine batırın.
  5. Akan musluk suyunda 5 dakika, ardından damıtılmış suda 5 dakika yıkayın.
  6. 1-5 dakika Eosin Y'ye daldırın.
  7. Her biri 5 dakika boyunca 3 × damıtılmış suda,% 50 etanol içinde 2 dakika boyunca 2 × yıkayın, ardından% 70 etanol 3× her biri 2 dakika boyunca yıkayın.
  8. % 100 etanol içinde 3 × her biri 2 dakika yıkayın, ardından ksilen içinde 4 × 2 dakika yıkayın.
  9. Ksilen bazlı montaj ortamı kullanarak bölümleri monte edin ve ışık mikroskobuna monte edilmiş bir dijital kamera kullanarak görüntü yakalayın.
  10. Görüntüleme yazılımı kullanarak lezyon alanını tanımlayın ve nicelleştirin.
    Not: Lezyon alanı, aort sinüsünden belirli mesafelerde 40-50 μm aralıklarla (her bölümün kalınlığına bağlı olarak) belirlenebilir. Bu alan ölçümlerinin mesafeye karşı bir grafiği, aterosklerotik lezyonun bir profilini verir (Şekil 4). Eğrinin altındaki alan, aterosklerotik lezyonun toplam hacminin bir tahminini temsil eder. Lezyonun ek karakterizasyonu nekrotik alanın belirlenmesini içerebilir. İlerlemiş bir lezyonun nekrotik çekirdeği (nc) apoptotik köpük hücreleri tarafından oluşturulur. Uygulama ile bu, hematoksilen ve eozin lekeli bölümlerin aselüler bölgelerinin incelenmesiyle belirlenebilir (Şekil 4A). Erken lezyonlar çok az nekroza sahip olma eğilimindeyken, daha ileri lezyonlar plak instabilitesine katkıda bulunabilecek nekrotik alanları artırmıştır. Nekrotik bir bölgenin varlığını doğrulamak için aynı aortun seri bölümleri incelenmelidir.

5. Aterosklerotik Lezyonun Daha Fazla Karakterizasyonu

Aterosklerotik gelişim aşaması ile ilgili spesifik ayrıntılar, belirli hücre tiplerine veya belirteçlere yönelik antikorlarla boyama yoluyla belirlenebilir. Parafin kesitleri üzerindeki immünohistokimya, çevredeki boyanmamış doku bağlamında spesifik hücre tiplerini veya belirteçleri tanımlamak için kullanılan standart bir tekniktir. Antijen tespiti genellikle bir yaban turpu peroksidaz substratı kullanılarak elde edilir.

İmmünofloresan boyama, floroforla konjuge antikorların kullanımını içerir ve tespit için bir floresan mikroskobu ve uygun filtreler gerektirir. Bu teknik, iki (veya daha fazla) antijenin aynı anda boyanmasına izin verir.

İmmünohistokimyasal boyama için Genel Protokol:

  1. Slaytları 8 dakika boyunca hava kurutucusuna yerleştirin.
  2. 4 ksilen değişikliğinde bölümleri deparafinize edin, 3 dakika her.
  3. Ksileni çıkarmak için her biri 3 dakika boyunca %100 etanol 3× yıkayın.
  4. 3×'ini %70 etanol içinde 3 dakika, ardından 2×'sini %50 etanol içinde her biri 3 dakika yıkayın.
  5. Her birini 5 dakika damıtılmış suda yıkayın, ardından 3×'ü PBS'de 5 dakika yıkayın.
  6. Antijen alımını gerçekleştirin. Bu, bir mikrodalga düdüklü tencere ve antijen geri alma çözeltisinde (10 mM sitrat tamponu, pH 6.0) Isı Kaynaklı Epitop Alma (HIER) yöntemi kullanılarak gerçekleştirilebilir.
    Not: Formalin fiksasyon işlemi, ilgilenilen antijenleri maskeleyebilir. Deneyimlerimize göre, HIER bazı antikorların performansını önemli ölçüde artırır, ancak diğerleri için gerekli değildir. Ek olarak, HIER antijen toplama yöntemine başka alternatifler de mevcuttur.
  7. Düdüklü tencere soğuduğunda, slaytları 15 dakika PBS'ye yerleştirin.
  8. Bölümleri normal serumda (ikincil antikorun türetildiği aynı türden) 30 dakika inkübe edin. SLAYTLARI YIKAMAYIN - SERUMU BOŞALTIN.
  9. Normal bloke edici serumda seyreltilmiş primer antikor ile oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  10. PBS 3× ile her biri 5 dakika yıkayın.
  11. Bölümleri, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de seyreltilmiş biyotinile edilmiş ikincil antikor ile inkübe edin.
  12. Slaytları yaban turpu peroksidaz streptavidin ile 30 dakika inkübe edin, ardından her biri 5 dakika boyunca PBS 3× ile yıkayın.
  13. Kromojenik reaksiyon - slaytları taze DAB (3,3 '-diaminobenzidin) içinde 5-30 dakika inkübe edin. Bu reaksiyon bir mikroskop kullanılarak izlenmelidir. Slaytları musluk suyunda yıkayarak reaksiyonu durdurun.
  14. 1 dakika boyunca hematoksilen ile lekeleyin. 5 dakika musluk suyuyla yıkayın, ardından her biri 5 dakika boyunca 3× damıtılmış suda yıkayın.
  15. Kızakların montajı için 4.7-4.9 adımlarını tekrarlayın.

6. İmmünofloresan Boyama için Genel Protokol

İmmünofloresan boyama için küçük değişikliklerle benzer bir protokol izlenebilir.

  1. Slaytları 8 dakika hava kurutucuya yerleştirin, ardından her biri 3 dakika olmak üzere 4 ksilen değişikliğinde bölümleri deparafinize edin.
  2. Ksileni çıkarmak için her biri 3 dakika boyunca %100 etanol 3× yıkayın.
  3. 3×'ini %70 etanol içinde 3 dakika, ardından 2×'sini %50 etanol içinde her biri 3 dakika yıkayın.
  4. Her birini 5 dakika damıtılmış suda yıkayın, ardından PBS 3 ×'de her birini 5 dakika yıkayın.
  5. Antijen alımını gerçekleştirin. Bu, bir mikrodalga düdüklü tencere ve antijen geri alma çözeltisinde (10 mM sitrat tamponu, pH 6.0) Isı Kaynaklı Epitop Alma (HIER) yöntemi kullanılarak gerçekleştirilebilir.
    Not: Formalin fiksasyon işlemi, ilgilenilen antijenleri maskeleyebilir. Deneyimlerimize göre, HIER bazı antikorların performansını önemli ölçüde artırır, ancak diğerleri için gerekli değildir. Ek olarak, HIER antijen toplama yöntemine başka alternatifler de mevcuttur.
  6. Düdüklü tencere soğuduğunda, slaytları 15 dakika PBS'ye yerleştirin.
  7. Bölümleri normal serumda (ikincil antikorun türetildiği aynı türden) 30 dakika inkübe edin. SLAYTLARI YIKAMAYIN - SERUMU BOŞALTIN.
  8. Normal bloke edici serumda seyreltilmiş primer antikor ile oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  9. PBS 3× ile her biri 5 dakika yıkayın.
  10. Normal bloke edici serumda (veya PBS) seyreltilmiş ikincil florofor konjuge antikor ekleyin. Oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin.
  11. PBS 3× ile her biri 5 dakika yıkayın.
  12. DAPI ile lekeye karşı koyun.
  13. PBS 3×'da her birini 5 dakika yıkayın.
  14. Antifade montaj ortamını kullanarak bir lamel uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beş haftalık LDLR-/- fareler, on hafta boyunca standart bir diyet veya yüksek yağlı bir diyetle beslendi. Fareler sakrifiye edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi formalin ile perfüze edildi. Aort sinüsünün kesitleri hazırlandı ve lezyon alanı ve hacmini belirlemek için hematoksilen ve eozin ile boyandı (Şekil 4). Fareler standart bir yemek diyetiyle beslendiğinde, aterosklerotik gelişim çok sınırlıdır ve 15 haftalıkken tespit edilemeyebilir. Yüksek yağlı diyet bu modelde aterogenezi önemli ölçüde hızla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ateroskleroz, miyokard enfarktüsü ve inmenin altında yatan önemli bir neden olan büyük kas arterlerinin karmaşık bir kronik hastalığıdır. Hastalığın ilerlemesi, arter duvarı içindeki birçok farklı hücre tipinin, dolaşımdaki kan hücreleri, lipoprotein parçacıkları ve yeni anlamaya başladığımız diğer kan yoluyla bulaşan faktörlerle etkileşimini içerir. Aterosklerozun gelişimi ve ilerlemesi ile ilgili mevcut bilgilerimizin çoğu, özel olarak tasarlanmış ateroskleroza eğilimli fare model sistemlerinde yapılan çalışmalardan ge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Kanada Sağlık Bilimleri Enstitüleri ve Kanada Diyabet Derneği'nden bir işletme hibesi ile finanse edilmiştir. DEV, Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica'dan (CONICYT, Şili) bir burs ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
LDLR eksikliği olan fareler ( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)Jackson Laboratuvarıstok #002207
FormalinSigma-AldrichHT5011
Histoloji KalıplarıTed Pella Inc27195
ParafinParamat19286-10
Kaplamalı slaytlarFisher12-550-15
Solvent kaplarıDoku Tek II4457
MikrotomLeicaRM22S5
Su banyosuVWR80086-982
MikroskopOlympusBX41TF
Fotoğraf MakinesiOlympusDP72
ImageJNIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
İşlemciSakura FinetekVIP6-A1
İşleme kasetleriVWR18000-134
Preassure OcakNordic Ware
LamelFisher12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
Mikrotom bıçağıThermo Scientific30-518-35
Antifade montaj ortamıSigma-AldrichF-4680
Ksilen montajı orta Sigma-Aldrich44581
Aquus montaj ortamıSigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4 / 80 antikoruAbcamAb6640
Alfa aktin antikoruSanta Cruz BiyoteknolojiSC-32251
Mayer’ s HematoksilenSigma-AldrichE4382
Eozin YSigma-AldrichMHS16
DAB (3,3'-Diaminobenzidin)DakoK3468

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).
  2. Daugherty, A., Rateri, D. L. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36, 129-138 (2005).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Diet and murine atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).
  4. Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  5. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  6. Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice. J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).
  7. Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).
  8. King, V. L., Hatch, N. W., et al. A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis. Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).
  9. Taylor Weiss, D. &, R, W. Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II. Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).
  10. Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice. Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).
  11. Pynn, M., Schäfer, K., et al. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice. Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).
  12. Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  13. Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).
  14. Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice. J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).
  15. Paigen, B., Morrow, A., et al. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  16. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root. Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).
  17. Lee, T. Y., Muschal, S., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  18. Ballon, G., Chen, K., et al. Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice. J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).
  19. Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis. PLoS One. 5 (1), e8852(2010).
  20. Rotzius, P., Thams, S., et al. Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice. Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).
  21. Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).
  22. Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. Observations on localization of arterial plaques. Circ. Res. 11, 63-73 (1962).
  23. Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  24. Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).
  25. McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).
  26. Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice. Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).
  27. Kirkby, N. S., Low, L., et al. Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography. PLoS One. 6 (2), e16906(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Histolojik Kesit AlmaParafin G mmeHematoksilin Eozin Boyamamm nohistokimyasal AnalizLezyon KantifikasyonuLDLR Fare ModeliY ksek Ya l Diyet

İlgili makaleler