Yöntem makalesi

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

DOI:

10.3791/50934

⸱

12 Kasım 2013

 , 
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan-beyin bariyeri (KBB) sıkıca beyin ortamı kontrol geçirmeyen ama uyarlanabilir beyin kılcal damarları oluşur. BBB başarısızlık klinik ile ilgili araştırma yardımcı vitro BBB modellerinde insan gelişimi için bir ihtiyaç yaratarak, birçok beyin patolojilerin etiyolojisinde ima edilmiştir. Şimdiye kadar tarif edilen çok sayıda BBB modelleri arasında, (akış olmadan) statik, astrositler ve beyin endotel hücreleri (BECS) gözenekli zarın karşı tarafında kültüre edilir BBB modeli, iletişim, bir basitleştirilmiş simüle etmek için henüz otantik bir sistem olarak ortaya yüksek veri akışı tarama kapasiteli BBB. Yine bu modelin üretimi birkaç teknik zorluklar sunuyor. Burada, primer insan BECS ve ölümsüzleştirilmiş insan astrosit yeni bir kombinasyonunu kullanan bir kişi insan BBB modelinin hazırlanması için bir protokol açıklar. Özellikle, biz detay ters ekler üzerinde hücre tohumlama için yenilikçi bir yöntem olarak inser belirtmekt boyama teknikleri ve biz BBB-ilgili araştırmalar için bir model kullanmak nasıl örneklemektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB periferik kan dolaşımı ve beyin hemostazın korunması için hayati sorumlu olan merkezi sinir sistemi arasındaki özel bir arabirimdir. Bu işlevsel beyin içine sıkı ve dinamik bir ağ geçidi oluşturmak için (aşağıda) birkaç hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından etkilenmektedir ki farklı beyin mikrovasküler endotelyal hücreler (BECS) içerir. Fizyolojik koşullar altında, BBB beyin içine, kan hücreleri, plazma komponentleri ve zararlı maddelerin, tüm potansiyel nörotoksik geçişini sınırlandırır. Buna paralel olarak, seçici olarak BBB tam beyin ortamı 1,2 korumak için, beyin ve dolaşım arasında önemli iyonları ve besin (glikoz ve amino asitler) ve metabolik atık ürünler değiştirir. Son yıllarda BBB yetmezliği gibi nörodejeneratif veya enflamatuar ile ilgili hastalıklar (örneğin, Alzheimer hastalığı ve multipl gibi kronik patolojiler beyin, çeşitli oluşur belirgin hale gelmektedire iskemik inme 4 gibi akut koşullarda yanı sıra), sırasıyla, 3, skleroz.

Beyin endotel hücreleri (BECS) benzersiz BBB özellikleri büyük ölçüde onların beyin ortamında 5 ile oluşturulan ve özellikle de 6,7 ile astrositler edilir. Gibi diğer perisitlerin 8, nöronlar ve mikroglia 1,3 gibi hücre tipleri, hem de bazal membran 9, BECS desteklemek ve bir işlevsel birim "nörovasküler birimi" (NVU) olarak adlandırılan, birlikte giderek artan bir anlayış var ki aynı anda çiftler temin kılcal 10 metabolik ihtiyaçları nöronal.

Patolojik durumlarda BBB katılımı BBB-ile ilgili araştırma 11,12 yardımcı vitro BBB modelleri geliştirmek için sayısız girişimde yatmaktadır. Bu modeller NVU prensibine göre vivo BBB özellikleri mümkün olduğu kadar yakın bir taklit eden ve. In vitro BBB modelleri genellikle (bir (çoğunlukla sığır 13, 14 insan, sıçan 15, fare 16, ve domuz 17,18 kökenleri) sıkı kavşak oluşturan BECS tek tabaka gözenekli bir zar üzerinde kültüre birlikte destek astrositlerde ile güveniyor yoğun ) Deli vd. 2005 11 tarafından incelendi.

Astrositler kültür ortamı, yine çözünebilir faktörleri ile BECS 16 ile iletişim kurarak (membran üst yüzeyi üzerinde yetiştirilen) BECS ayrılan iyi bir doku kültürü, altındaki temassız şartlarında yetiştirilebilir. Daha iyi in vivo BBB anatomik yapısının benzer daha gelişmiş modellerde, astrositler temas koşulları ve doğrudan BECS 13,15,17 yakın (Şekil 1) 'de zarın karşı tarafında kültürlenir içinde muhafaza edilmiştir. Bu yapılandırma kurulmuş, BECS ve astrositlere arasındaki fiziksel temas sağlar zaman astrocytes projegözenekli membran yoluyla işler. Astrositik sonu-ayak küçük gözenek boyutları (yani 0,4 mikron) 14,15 geçemez beri önemlisi, ortaya gerçek bir temas için gözenekler, çapı 1uM ≥ edilmelidir. Özellikle, iletişim BBB sistemleri, trans-endotel elektriksel direnç (TEER) ve çeşitli izleyiciler 13,17,18 endotel geçirgenliği değerleri konusundaki temassız meslektaşları üstün olduğu bazı çalışmalarda gösterilmiştir. Ortam akımının ilave bir boyut yakın beyin damar 12,19 arasında yakın bir simülasyon için endotele kesme kuvvetleri uygulamak için in vitro BBB model bir dizi ilave edildi.

Bir kişi BBB modeli oluşturulurken üstesinden gelmek için bir teknik engel gözenekli membranın ablüminal yüzeyinde yer çekimine karşı astrositlerin tohumlama olan. Astrocytes sadece bir in üstüne medyanın bir damla ekildi Önceki protokolleri 13,20,verted insert, izin, sadece kısa tohumlama kez doğru hücre eki için yetersiz olması bizim ellerde bulundu (yani 10 dk 13 ya da 2 saat 20). Bu temel yöntemi kullanılarak, daha uzun bir astrosit bağlantı süresi (sıcaklık, pH ve nem dalgalanmalara yol açması) inkübatör sık ​​açılması ile insertlerin sürekli izlenmesi gerekir ve nedeniyle gözeneklerden medya sızıntıya da düzensiz hücre ekimi eğilimli, özellikle 1 um 'den daha büyük gözenekler kullanılması durumunda.

Burada, bir temas BBB modelinin hazırlanması için genel bir protokol açıklar. Bizim prosedür, yukarıda belirtilen sınırlamaları çözen ters ekler, on hücre tohumlama için alternatif bir yöntemi içerir. Bu yöntem uzun bir zaman süresi için, dengelenmiş bir inkübatör içinde, abluminal zar yüzeyi üzerine astrositlerin rahatsız yapışmasını sağlar. Bunun bir sonucu olarak, astrositlerin muntazam bir tohumlama bariyer kalitesini arttırır elde edilirve ekler arasında bazal geçirgenliği varyasyonlar en aza indirir.

İnsan hücrelerinin kullanımı insan ilgili araştırmalar 21 için önemli olduğu için, ilave olarak bu makalede primer insan BECS yeni bir kombinasyonunun özel kullanımını göstermek ve bir yüksek veri akışı tarama kapasiteli bir temas insan BBB Model kurulması için insan astrositler ölümsüzleştirilmiş . Gözenekli membran üzerinde hücrelerin görüntüleme gözenekli membranlar üzerinde birleştiği ve hücre morfolojisi belirlenmesinde yardımcı olabilir zor, daha da ayrıntılı boyama teknikleri olabilir beri. BBB - Akut iskemik inme için bir tek tedavi seçeneği olarak hizmet veren bir pıhtı avı enzim - Nihayet, bizim insan BBB modeli doku tipi plazminojen aktivatörü etkisi (t-PA) incelemek için kullanılabilir nasıl örneklemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Hücre Kültürü (Önceki BBB Kurul'a 3-7 Gün)

1.1. İlköğretim İnsan Beyninin Mikrovasküler Endotel Hücreleri (BECS)

BECS ticari olarak elde edildi. Hücreler, normal insan beyni korteks dokusu dispase ayrışma tarafından üretilen ve geçit 3 (<12 nüfus ikiye katlama) de donduruldu sağlandı.

  1. Taban: üreticinin talimatlarına göre "Ek Factor" ile Coat doku kültürü gemiler.
  2. Hücre bakım: serum-içeren komple ortam içinde BECS koruyun. Komple serum serbest ortamda deney, kültür BECS için. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 hücrelerin bakımı, 37 ° C'de% 21 O 2 inkübatör
    Not: DMEM/F-12 15 mM HEPES,% 10 (v / v) cenin dana serumu (FCS) ile desteklenmiş iken özel bir tepkin bir alternatif olarak,% 0.1 (a / h) jelatin çözeltisi, bir kaplama maddesi olarak hizmet edebilir; 2 mM L-glutamin, 50 ug/ Ml gentamisin, 20 ug / ml heparin ve 20 ug / ml endotelyal hücre büyüme takviyesi BEC bakımı için de kullanılabilir.
  3. Bir sonraki kullanım için amaçlanan süre (3-7 gün) bağlı olarak, 1:03-1:06 arasında bir oranda Bölünmüş birleşik BECS: deney için alt-kültürlenmesi. Her 3 günde bir bakım ortamı değiştirin. 15 geçitlerine BECS kullanın.

1.2. SVG İnsan Fetal astroglial hücre hattı

SVG insan fetal astroglial hücreler, 22 orijinal olarak replikasyon-eksikli simian virüs 40 ile transforme edilmiş, insan fetal beyin primer kültürlerden elde edilmiştir.

  1. Bakım:% 20 (v / v) FCS (ebeveyn birincil hücreler 22 korumak için kullanılan aynı serum yüzde), 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin ve ilave edilmiş Earle dengeli tuz çözeltisi ile en az temel ortam içinde kültür SVG hücrelerin 50 ug / ml streptomisin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2,% 21 O2 hücreleri korumak inkübatör
  2. Bir sonraki kullanım için amaçlanan süre (3-7 gün) bağlı olarak, 1:05-1:10 arasında bir oranda Bölünmüş birleşik SVG lezyonu: deney için alt-kültürlenmesi. Tripsin çıkarılması nedeniyle ortam içinde yüksek serum içeriği gerekli değildir. Her 3 günde bir orta değiştirin. Kadar 20 pasajlara SVG lezyonu kullanın.

2. İnsan In vitro BBB Modelin Montaj ve Coculturing (Gün 0)

Yorum: vitro temas BBB modelinde insan modifikasyonlarla, 13,23 yayınlanmış protokollere göre hazırlanır.

2.1. Eklemelerin Kaplama

  1. Birlikte 24 oyuklu plakanın kuyularda doku kültür ekleri (polyester gözenekli zar ile, çapı 6.5 mm, 3 um gözenek boyutlu) yerleştirin. Ekler Coat luminal yüzeyi gece boyunca fare kolajeni ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör I (20 ug / cm 2, 132 ug, 50 ul/ Ml kolajen Milli-Q su içinde% 0.02 asetik asit l (MQH 2 O)). Kalıntı asidi çıkarmak için MQH 2 O (abluminal ve luminal taraftan her ikisi birden) bir kez ekler yıkayın.
    Not: beyin kılcal damarların bazal membran hiçbir kollajen içeren ben ama esas laminins, kollajen tip IV isoformları, nidogens ve heparan sülfat proteoglikan 9. Bu nedenle, bazı araştırmacılar, kolajen IV, fibronektin 13 ya da daha gerçekçi bir Matrigel BBB modelleme (BD Biosciences) 16 gibi kaplama maddeleri kullanmaktadır.

2.2. Alt tarafı (abluminal) Membran Yüzey üzerinde tohumlama SVG lezyonu

  1. Ekleme ters çevirin ve yavaşça gözenekli membran elastik silikon boru kısa bir parça jantı etrafında uygun; de ablüminal yüzeyi üzerinde esas olarak yeni bir tane oluşturmak ("dış boru" yaklaşık 10 mm uzunluğunda, 8 mm iç çap, 1.6 mm duvar) (Şekil 2A).
  2. Insert nee en altds medya kaçağı önlemek için kapalı olması. Plastik bir sızdırmazlık koni ile bir ucunda kapalı, ilk (Şekil 2B;, ~ 8 mm uzunluk, 3.2 mm iç çap, 1.6 mm duvar "iç boru" olarak adlandırılır), bir silikon boru yapılmış bir fiş (Şekil 2A ve 2B) hazırlanması (~ 3 mm uzunluğunda, bir 0.2 ml, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp alt kesim tarafından hazırlandı; Şekil 2B). bu koni iç boru lümen keçe, aynı zamanda ucun içine sıkı montaj için kenar genişletmektedir değil. Bu zardan up-~ 1-2 mm (Şekil 2A) ulaşana kadar Sonraki steril bir forseps kullanarak, lümen boşluğu ve önceden, içine silikon fişini takın.
  3. Daha sonra, 200 ul SVG bakım ortamı içinde 4 x 10 4 SVG hücreler (tohum seşeklinde gösterilmektedir yukarıda 1.2.2) doğrudan de abluminal zar yüzeyi üzerinde silikon (Şekil 2A) içine. SVG lezyonu inkübatör içinde en az 4 saat boyunca yapışmaya izin verin.
    Not: sterilite iki adet 6 oyuklu plakalar içinde (diğer üzerinden ters bir plaka, Şekil 2C) arasında monte ekler taşıma muhafaza etmek için filtre işlemi sırasında havaya maruz kalmasını en aza indirmek için. Silikon borular ve prizler etanol içinde yıkandı ve daha sonra kullanılmak üzere otoklavlanır.
    Not: Kullanım fişleri sadece membran gözenek olan uçlar için (bölüm 2.2.2) 1 mikron daha büyük boyutları. 1 mikron ≤ gözenek çaplı membranlar nadiren sızıntı ve dış silikon tüp (bölüm 2.2.1) sadece montaj gerektirir. Buna ek olarak, kollajen dışındaki bazı kaplama maddeleri I (bölüm 2.1 nota bakınız) hatta 3 mikron gözenekleri sayesinde sızmaları engelleyebilir. Ampirik Bu belirleyin.
  4. Da astrositlerin yapışması durumunu izlemek amacıyla, içine paralel olarak tohumastrosit hücre süspansiyonu standart 96 oyuklu özdeş bir hacim. Bu da 6.5 mm uç ile aynı yüzey alanına (0.33 cm 2) sahiptir ve membran çanağının daha faz-kontrast mikroskobu ile görselleştirme hücreleri daha kolay izin verir. Eğer kontrol astrosit yeterli yapışmasını gözlendiğinde 96-kuyu, astrositler yeterince insert zarı da yapıştırılır var.
  5. Astrocytes yeterince 96-iyi kontrol yapıştığı zaman, (yukarıdaki nota bakınız) doku kültürü kaputu insert derlemeleri aktarmak ve hafifçe dış silikon tüp ve tıpaları çıkarın. 800 ul / oyuk BEC bakım ortamı (yukarıdaki bölüm 1.1.2) ihtiva eden birlikte kuyu içine normal (yani dikey) yöne ekler dönün.

2.3. Astrositler yukarıdaki Lüminal Odası'na BECS ekme

Kollajen kaplı lümen yüzeyi üzerine 200 ul ve böcek ö geri Seed 2x10 4 BECSinkübatör içine rts.

2.4. Coculturing

Deney öncesi medya değişim olmadan BEC ortamda 3 gün boyunca SVG / BEC seribaşı ekler Coculture.

3. İnsan BBB Modeli ile Deneme (Gün 3)

  1. Sırasıyla 600 ul ve serumsuz BECS ortamın 100 ul ile abluminal ve luminal ortam değiştirerek in vitro BBB birinci yıkama hücrelerini teşvik etmek.
  2. Yine orta luminal aspire ve uyarıcı maddeler ile serumsuz ortamın 100 ul ile değiştirin.
    Not: abluminal odasının uyarılması (astrositik bölmesinden in vitro aktive etmek için BBB) gerekli ise, abluminal ortam aspire ve uyarıcı maddeler bulunan serumsuz ortamın 600 ul ile değiştirin.
  3. Lümen stimülasyon 3 x 100 ul gerektiren, yapılırsa, dolayısıyla (üç nüsha, her deney grubu test, biz yeniden seyreltilmesi tavsiye kuyular arasında pipetleme hataları en aza indirmek için, grup başına, serum içermeyen ortam içinde 350 ul) içinde nihai konsantrasyonlara ajanlar.
  4. Daha önce tarif edildiği gibi ve / veya TEER 13,16,25 ölçümü (ikincisi için biz floresein izotiosiyanat (FITC)-konjügeli albumin kullanın) standart paraselüler ve / ya da etiketlenmiş izleyici 16,24 arasında transsellüler geçirgenlik deneyleri yapın.

Geçirgenliği (maksimum%) = (: taban geçirgenlik dalgalanmalara hesaba katılması için deneyler arasında, (maksimum geçirgenlik için bir referans olarak hizmet eder) hücreler olmaksızın kaplanmış bir ekleme için ve aşağıdaki formül kullanılarak araçla tedavi edilen gruba geçirgenliği nispetle değişiklikleri analiz araç grubunun ortalama geçirgenlik değeri) X 100 - araç grubu boş ucu) / (geçirgenlik değeri ortalama geçirgenlik değeri - geçirgenlik deneysel ekin değeri.

4. Gözenekli zarlara Hücrelerinin görselleştirme

nt "> Yorum: insert zarlar üzerinde boyanmamış hücrelerin zar oldukça opak ve ışık iletimi engelleyen beri faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi ile gözlemlemek zor olan biz hücrelerin çeşitli boyama yöntemleri geliştirmiştir bu konu ile ilgilenmek için. büyük zar üzerinde hücre görünümünü güçlendirmektedir. hala kuyularda, ekin bağlı iken. Zarlar, sadece montaj amaçlar için boyama işlemi sonunda çıkarılmalıdır Genel olarak, uç membranlar leke ekler.

4.1. Hematoksilen Boyama

  1. 20 dakika için, fosfat-tamponlu salin (130 mM NaCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7.2 PBS) (w / v) paraformaldehit (PFA), buz soğukluğunda% 4 ile ekler düzeltildi. PBS içinde bir kez yıkayın.
  2. 2 dakika boyunca% 0.1 Mayer hematoksilin çözelti içinde ekleme daldırın.
  3. Yavaşça ins daldırarak (musluk suyu ile yıkayın elemanınıBir kabı içeren musluk suyunda ert ve hafifçe) fazla suyu dışarı pipetleme. İstenilen mavi renk gelişene kadar 20 sn ~ için Scott'ın musluk suyu çözeltisi (2 g / L NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) için ekleme aktarın. Musluk suyu (bölüm 4.1.3) ile tekrar insert yıkayın. İsteğe bağlı bir eozin boyama, bir musluk suyu yıkama, ardından 10 saniye boyunca% 1 çözeltisi içinde eosin ekleme daldırılarak burada dahil edilebilir.
  4. Insert membran hava-kurutun. (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak ve aydınlık alan görüntüleme için bir cam slayt üzerine monte
    Not: di-N-butylphthalateinxylene (DPX) montaj orta kullanıldığı takdirde membran ayrılması ve monte etmeden önce, ksilen, ardından% 100 etanol ile ekleme yıkayın.

4.2. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM)

  1. Buz soğukluğunda% 4 ile uçlar saptamak (ağırlık / hacim) 20 dakika boyunca PBS içerisinde PFA. PBS içinde üç kez yıkayın.
  2. 30% 1 dakika (w / v için membranlar Post-fixMQH 2 O'da) ozmiyum tetroksit
  3. , Su (bölüm 4.1.3) içinde uçlar yıkayıp (zaman birimi için 10 dakika boyunca% 100 etanol ile 3 kez daha sonra% 50,% 70, her biri 5 dakika için% 90) giderek artan bir etanol gradyanı içinde kurutmak.
  4. Etanol (01:02 sonra 02:01 5 dakika boyunca) heksametildisilazan (HMDS) içeren bir karışım ile susuz tedavi ekler.
  5. 5 dakika, kurutulmuş koşullarında hava-kuru ve mağaza için 100% HMDS'nin ile ekler davranın.
  6. (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak. Taramalı elektron mikroskobu ile membranlar inceleyin.

4.3. İmmünofloresan

  1. (W / v) PBS içinde 20 dakika boyunca PFA, (, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 154 mM NaCl, 0.22 um filtre TBS) Tris-tamponlu tuzlu su içinde bir kez yıkayın buz soğukluğunda% 4 ile uçları düzeltildi.
  2. 26, daha önce tarif edildiği gibi uç zar üzerinde hücrelerin immün yapın.
  3. (Membran kenarında kesme) bir neşter kullanılarak membran kaldırmak ve ag üzerine montefloresan montaj ortamına ile kız slayt. Floresan mikroskop ile membran inceleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu endotel hücreleri 14,15,27,28 ile temas için astrosit uç feet geçişine izin vermek için gösterilen 3 mikron gözenek büyüklüğü ile gözenekli zarlar üzerinde SVG açıklığı ve BECS yetiştirmek için olan bir insan, temas BBB model kurmak için. Tam temas modelinin şematik bir temsili, Şekil 1 (resim sol) 'de gösterilmiştir. Bir iletişim sistemi tarafından sunulan temel teknik sorun, zarın ablüminal yüzeyinde yer çekimine karşı astrositler tohum ihtiyacıdır. Biz lümen içine sokulan ek bir silikon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin patolojileri içine Tıbbi araştırma çok öteleme zorluk çekiyor. Akut iskemik inme alanında, örneğin, hayvan modellerinde büyük söz gösterdi birçok ilaç klinikte 38,39 başarısız oldu. Bu hayal kırıklığı yaratan sonuçlar için nedenleri çeşitlidir ve insan inme senaryo ve hayvan çalışmaları 21 elde edilen sonuçların abartı için klinik öncesi test sistemleri aldatma içerir. Klinik faz klinik öncesi bulgular öngörü değerini artırmak için bir strateji ek geliştirme, insan hücre taba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (hibe # 606658) den RLM verilen hibe tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ek FaktörHücre Sistemleri Şirketi4Z0-210
Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BEC'ler), birincil, insanHücre Sistemleri ŞirketiACBRI 376
Komple orta HücreŞirketi4Z0-500CSC JetFuel ile Desteklenmiş
Komple serumsuz ortamHücre Sistemleri ŞirketiSF-4Z0-500
Life Technologies11330-032DMEM/F-12
Endotel hücreleri büyüme takviyesi (sığır kökenli)Sigma-AldrichE2759-15MG
Harici silikon boruWatson-Marlow913.A080.016Pumpsil marka, 8 mm iç çap, 1,6 mm duvar
Fetal buzağı serumuLonza14-501F
Gentamisin sülfatYaşam Teknolojileri15750-060
Heparin sodyumPfizer1.000 U/ml
Heksametildisilazan (HMDS)Sigma-AldrichH4875
İnsan beyni mikrovasküler endotel hücreleriHücre Sistemleri ŞirketiACBRI 376
Dahili silikon boruWatson-Marlow913.A032.016Pumpsil marka, 3.2 mm iç çap, 1.6 mm cidar
L-GlutaminLife Technologies25030
Mayer' s hematoksilen çözeltisiAmber ScientificMH
Earle' ile minimum esansiyel ortam S dengeli tuz çözeltisiHyClone LaboratoriesSH30244.01
Penisilin / StreptomisinYaşam Teknolojileri15140
Sıçan kollajen ITrevigen3440-100-01Cultrex marka
Doku kültürü ekleriCorning Yaşam Bilimleri3472Transwell marka, 6,5 mm çapında, polyester gözenekli membranlı, 3 & m gözenek boyutu
Sistemleri 15 mM HEPES ile CSC RocketFue ile desteklenmiştir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).
  3. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  4. Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).
  5. Stewart, P. A., Wiley, M. J. Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras. Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).
  6. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, 253-257 (1987).
  7. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).
  8. Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).
  9. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).
  10. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).
  11. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).
  12. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).
  13. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).
  14. Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells. Brain Res. 625, 238-243 (1993).
  15. Demeuse, P., et al. Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier. J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).
  16. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).
  17. Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  18. Kroll, S., et al. Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).
  19. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).
  20. Li, G., et al. Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies. Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).
  21. Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation. Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).
  22. Major, E. O., et al. Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).
  23. Eugenin, E. A., Berman, J. W. Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier. Methods. 29, 351-361 (2003).
  24. Dehouck, M. P., et al. Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models. J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).
  25. Perriere, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).
  26. Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin. Brain Res. 1381, 38-51 (2011).
  27. Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane. Lab Chip. 5, 74-85 (2005).
  28. Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes. Blood. , (2012).
  29. Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).
  30. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nat. Med. 14, 731-737 (2008).
  31. Yepes, M., et al. Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein. J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).
  32. Abu Fanne, R., et al. Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity. Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).
  33. Wang, X., et al. Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator. Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).
  34. Wang, X., et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke. Stroke. 35, 2726-2730 (2004).
  35. Donnan, G. A., et al. How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke. Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).
  36. Acheampong, P., Ford, G. A. Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).
  37. Derex, L., Nighoghossian, N. Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).
  38. Garber, K. Stroke treatment--light at the end of the tunnel. Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).
  39. Liebeskind, D. S. Reversing Stroke in the 2010s. Stroke. 40, 3156-3158 (2009).
  40. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  41. Song, L., Pachter, J. S. Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Blood Brain Barrier ModelEndothelial Cell CultureAstrocyte Co culturePorous Membrane InsertCollagen CoatingFluorescent Tracer AssayTransendothelial Electrical ResistanceGlial Fibrillary Acidic ProteinVon Willebrand FactorTPA Permeability Study

İlgili makaleler